L’utilisation intensive des produits phytosanitaires, en particulier les insecticides, provoque des effets indésirables sur les organismes vivants et leur environnement. Mon travail de thèse a consisté à évaluer l’effet de deux insecticides chez un insecte modèle la drosophile. Une première étude concernait l’effet d’un néonicotinoïde, l’imidaclopride. Nous avons pu montrer que l’exposition chronique à des doses sublétales de cet insecticide perturbe la fonction de reproduction chez la drosophile. D’autre part, une exposition aiguë à l’imidaclopride a mis en évidence une résistance chez les femelles d’une souche de drosophile dite ``des champs´´. Deux mécanismes différents ont été mis en évidence dans la résistance à l’imidaclopride de cette souche. Le premier concerne la sous expression d’une sous-unité (D1) du récepteur nicotinique à l’acétylcholine, cible de l’imidaclopride. Le deuxième concerne l’implication des glutathion S-transférases, enzymes de détoxification, dans le métabolisme de l’imidaclopride. Ces études montrent que les insecticides peuvent avoir en plus des effets sur les insectes ravageurs, des effets néfastes sur des organismes non cibles. La deuxième étude avait pour but de modéliser chez la drosophile, l’impact d’un organochloré, la dieldrine, potentiellement impliquée dans la maladie de Parkinson chez l’homme. L’exposition à cet insecticide conduit à une dégénérescence des neurones dopaminergiques ainsi qu’une perturbation de la structure de régions particulières du cerveau. Nous avons également montré des altérations du métabolisme et l’implication de processus épigénétiques dans la neurodégénérescence induite par la dieldrine. Au cours de ce travail, nous avons pu montrer l’intérêt de nouvelles méthodes comme l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) ou le High Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) dans ce type d’étude. / Pesticides have been used extensively and induce harmful effects on organisms and their environment. The aim of my PhD work was to investigate the effects of two insecticides by using Drosophila as a model. The first study concerns the effect of a neonicotinoid, imidacloprid. The results obtained have shown that a chronic exposure at sublethal doses of this insecticide affects reproduction in flies. Moreover, acute exposure at high doses has pointed out a resistance phenomenon in females of a field strain. We have shown that two mechanisms are implicated: (i) low expression of a subunit of a nicotinic acetylcholine receptor that is the target of imidaclopride and (ii) role of glutathione S-transférases, detoxication enzymes, in imidaclopride metabolism. These results highlight impact of insecticides, in particular imidaclopride, on non target organisms. The aim of the second study was to characterize in Drosophila, effects of an organochlorine, dieldrin, potentially implicated in the etiology of Parkinson’s disease in humans. Dieldrin exposure at low doses promotes neurodegeneration of dopaminergic neurons and alters structures of particular regions of the brain. Disruption of metabolism is also induced after exposition to dieldrin. In addition, we have shown that epigenetic processes are implicated in neurodegenration induced by dieldrin. This work show advantages of new techniques such as Magnetic Resonance Imaging (MRI) and High Reslution Magic Angle Spinning in this kind of study.

No description available.

Background Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed malignant disease among adult males in the USA and the second leading cause of cancer deaths in men. Due to the lack of diagnostic tools that are able to differentiate highly malignant and aggressive cases from indolent tumors, overtreatment has become very common in the era of prostate specific antigen (PSA) screening. New diagnostic methods to determine biological status, malignancy, aggressiveness and extent of PCa are urgently needed. 1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H HRMAS MRS) can be used to establish PCa metabolomic profiles while preserving tissue architecture for subsequent histopathological analysis. Immunohistochemistry (IHC), as opposed to conventional histopathology methods, has the potential to provide objective, more accurate and quantitative knowledge of tissue pathology. This diagnostic- accuracy study sought to evaluate a novel approach to quantitatively identify metabolomic markers of PCa by exploring the potential of PCa immunomarkers to quantify metabolomic profiles established by 1H HRMAS MRS. Material and Methods 1H HRMAS MRS was performed on tissue samples of 51 prostate cancer patients using a 14.1 Tesla NMR spectrometer (BRUKER Biospin, Billerica, MA) with a rotor synchronized CPMG pulse sequence. Spectral intensities of 36 regions of interest were measured as integrals of curve fittings with Lorentzian-Gaussian line shapes. Immunohistochemistry (IHC) was carried out following the spectroscopy scan, using three prostate immunomarkers to identify cancerous and benign glands: P504S (Alpha-methylacyl-CoA-racemace), CK903 (high-molecular weight cytokeratin) and p63. The immunostaining quality following 1H HRMAS MRS was evaluated and compared to unscanned sections of the same sample, to verify the stability and accessibility of the proposed immunomarkers. IHC images were automatically and quantitatively evaluated, using a quantitative image analysis program (QIAP), to determine the percentage of cancerous and benign epithelia in the tissue cross- sections. The results of the program were validated by a correlation with the results of a quantitative IHC review and quantitative conventional histopathology analysis performed by an experienced pathologist. Ultimately, spectral intensities and the cancer epithelium percentage, obtained from quantitative immunohistochemistry, were correlated in order to validate PCa metabolomic markers identified by 1H HRMAS MRS. Patient outcomes and incidence of recurrence were determined by retrospective review of medical records five years after initial surgery. Categories of recurrence were correlated to spectral intensities to explore potential metabolomic markers of recurrence in the cohort. Results Immunostainings with P504S and CK903 showed excellent staining quality and accessibility following 1H HRMAS MRS, suggesting these markers to be suitable for the presented quantitative approach to determine metabolomics profiles of PCa. In contrast, the quality of p63 IHC was impaired after previously performed spectroscopy. IHC using the immunomarkers P504S and CK903 on adjacent slides was found to present a feasible quantitative diagnostic method to distinguish between benign and cancerous conditions in prostate tissue. The cancer epithelium percentage as determined by QIAP showed a significant correlation to the results of quantitative IHC analysis performed by a pathologist (p < 0.001), as well as to a quantitative conventional histopathology review (p = 0.001). The same was true for the benign epithelium percentage (p < 0.001 and p = 0.0183), validating the presented approach. Two metabolomic regions showed a significant correlation between relative spectral intensities and the cancer epithelium percentage as determined by QIAP: 3.22 ppm (p = 0.015) and 2.68 ppm (p = 0.0144). The metabolites corresponding to these regions, phosphocholine and citrate, could be identified as metabolomic markers of PCa in the present cohort. 45 patients were followed for more than 12 months. Of these, 97.8% were still alive five years after initial surgery. 11 patients (24.4%) experienced a recurrence during the follow- up time. The categories of recurrence showed a correlation to the spectral intensities of two regions, 2.33 – 2.3 ppm (p = 0.0403) and 1.28 ppm (p = 0.0144), corresponding to the metabolites phosphocreatine and lipids. Conclusion This study introduces a method that allows an observer-independent, quantitative analysis of IHC to help establish metabolomic profiles and identify metabolomic markers of PCa from spectral intensities obtained with 1H HRMAS NMR Spectroscopy. The immunomarkers P504S and CK903 have been found suitable IHC analysis following 1H HRMAS MRS. A prospective in vivo application of PCa metabolite profiles and metabolomic markers determined by the presented method could serve as highly sensitive, non- invasive diagnostic tool. This observer- independent, computer- automated, quantitative analysis could help to distinguish highly aggressive tumors from low-malignant conditions, avoid overtreatment and reduce risks and complications for cancer patients in the future. Further studies are needed to verify the identified PCa metabolomic markers and to establish clinical applicability. / Einführung Prostatakrebs ist eine häufigsten Krebserkrankungen in den USA und die zweithäufigste malignom- assoziierte Todesursache männlicher Patienten weltweit. Seit der Einführung des Prostata- spezifischen Antigen (PSA)- Screeningtests wird diese Krebsart in früheren Stadien diagnostiziert und therapiert, wodurch die Mortalitätsrate in den letzten Jahren deutlich reduziert werden konnte. Da moderne diagnostische Methoden bislang jedoch nicht ausreichend in der Lage sind, suffizient zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Varianten dieses bösartigen Krebsleidens zu unterscheiden, werden häufig auch Patienten aggressiv therapiert, deren niedriggradiges Prostatakarzinom keine klinische Relevanz gehabt hätte. Es besteht daher ein großes wissenschaftliches Interesse an der Entwicklung neuer diagnostischer Methoden zur akkuraten Bestimmung von biologischem Status, Malignität, Aggressivität und Ausmaß einer Prostatakrebserkrankung. \\\\\\\"1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy\\\\\\\" (1H HRMAS MRS) ist eine vielversprechende diagnostische Methode, welche es ermöglicht, metabolomische Profile von Prostatakrebs zu erstellen, ohne die Gewebsstruktur der analysierten Proben zu zerstören. Durch anschließende histopathologische Begutachtung lassen sich die erstellten Metabolitprofile validieren und evaluieren. Im Gegensatz zu konventionellen histopathologischen Methoden können durch immunhistochemische Verfahren dabei objektivere, akkuratere und quantifizierbare histopathologische Erkenntnisse gewonnen werden. Die vorliegende Studie präsentiert einen neuentwickelten diagnostischen Ansatz zur quantitativen Bestimmung von metabolomischen Markern von Prostatakrebs, basierend auf der Durchführung von 1H HRMAS NMR Spektroskopie und quantitativer Immunhistochemie. Material und Methoden Einundfünfzig Gewebsproben von Prostatakrebspatienten wurden mittels 1H HRMAS MRS an einem 14.1 T BRUKER NMR Spektrometer unter Einsatz einer CPMG-Pulssequenz untersucht. Spektrale Intensitäten in 36 Metabolitregionen wurden gemessen. Anschließend wurden die analysierten Gewebeproben mit drei Immunfärbemarkern für sowohl malignes (P504S, Alpha-methylacyl-CoA-racemase) als auch benignes (CK903, High-molecular weight cytokeratin, und p63) Prostatagewebe angefärbt und quantitativ mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms (QIAP) ausgewertet. Die Anwendbarkeit und Auswertbarkeit der genannten Immunomarker nach Spektroskopie wurde evaluiert und mit der Färbungsqualität von nicht- gescannten Schnitten verglichen. Die Resultate der automatischen Auswertung durch QIAP konnten durch einen erfahrenen Pathologen in einer quantitativen Analyse der Immunfärbungen sowie konventioneller histologischer Färbungen derselben Gewebsproben validiert werden. Die spektralen Intensitäten aus den Messungen mit 1H HRMAS MRS wurden mit den korrespondierenden Ergebnissen der quantitativen Auswertung der Immunfärbungen korreliert, um metabolomische Marker von Prostatakrebs zu identifizieren. Der klinische Verlauf und die Rezidivrate der Patienten wurden 5 Jahre nach der initialen Prostatektomie retrospektiv bestimmt. Rezidivkategorien wurden erstellt und mit den bestimmten spektralen Intensitäten korreliert, um metabolomische Marker für das Auftreten von Prostatakrebsrezidiven zu identifizieren. Ergebnisse Die Immunfärbungen mit P504S und CK903 zeigten exzellente Qualität und Auswertbarkeit nach vorheriger 1H HRMAS MRS. Beide Marker eigneten sich zur Durchführung von quantitativer Immunhistochemie an spektroskopierten Gewebeproben. Im Gegensatz dazu war die Qualität der Immunfärbungen mit p63 nach Spektroskopie vermindert. Quantitative Immunfärbungen unter Einsatz der Immunmarker P504S und CK903 stellten eine praktikable diagnostische Methode dar, um zwischen malignen und benignem Prostatagewebe zu unterscheiden. Der Anteil von bösartig verändertem Prostatagewebe, bestimmt durch QIAP, korrelierte signifikant mit den Ergebnissen der quantitativen Analyse der Immunfärbungen durch den Pathologen (p < 0.001), sowie mit der quantitativen Auswertung der konventionellen histopathologischen Färbung (p = 0.001). Ebenso ließ sich die Bestimmung des Anteils von benignem Gewebe mit QIAP zu den Ergebnissen der pathologischen Analyse korrelieren (p < 0.001 und p = 0.0183). Für zwei metabolomische Regionen konnte ein signifikante Korrelation zwischen relativen spektralen Intensitäten, bestimmt mit 1H HRMAS NMR Spektroskopie, und dem Anteil von malignem Epithelium in derselben Gewebeprobe, ermittelt durch QIAP, festgestellt werden: 3.22 ppm (p = 0.015) und 2.68 ppm (p = 0.0144). Die zu diesen Regionen korrespondierenden Metaboliten, Phosphocholin und Zitrat, konnten als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Die retrospektiven Analyse der klinischen Daten der Patienten fünf Jahre nach Prostatektomie ergab eine Überlebensrate von 97.8%. Elf dieser Patienten (24.4%) erlitten ein Rezidiv ihrer Erkrankung. Die bestimmten Rezidivkategorien korrelierten signifikant mit zwei metabolomischen Regionen (2.33 – 2.3 ppm, p = 0.0403 und 1.28 ppm, p = 0.0144), welche zu den Metaboliten Phosphokreatin und Lipiden korrespondierten. Schlussfolgerung Die vorliegende Studie präsentiert einen diagnostischen Ansatz zur objektiven und quantitativen Bestimmung metabolomischer Marker von Prostatakrebs unter Verwendung von 1H HRMAS MRS und Immunhistochemie. P504S und CK903 eignen sich als Immunmarker für quantitative Immunfärbungen nach vorheriger Durchführung von 1H HRMAS MRS. Die Metaboliten Phosphocholin und Zitrat konnten in der vorliegenden Patientenkohorte als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Eine mögliche in vivo Anwendung der gefundenen metabolomischen Marker könnte als hochsensitives, objektives und nicht- invasives diagnostisches Werkzeug der Prostatakrebsdiagnostik dienen. Der vorliegende untersucherunabhängige, automatisierte und quantitative diagnostischer Ansatz hat das Potential, zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Krebsfällen zu unterscheiden und somit unnötige Risiken und Komplikationen für Prostatakrebspatienten zu reduzieren. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die identifizierten metabolomischen Marker zu verifizieren und eine klinische Anwendung zu etablieren.

L'utilisation intensive des produits phytosanitaires, en particulier les insecticides, provoque des effets indésirables sur les organismes vivants et leur environnement. Mon travail de thèse a consisté à évaluer l'effet de deux insecticides chez un insecte modèle la drosophile. Une première étude concernait l'effet d'un néonicotinoïde, l'imidaclopride. Nous avons pu montrer que l'exposition chronique à des doses sublétales de cet insecticide perturbe la fonction de reproduction chez la drosophile. D'autre part, une exposition aiguë à l'imidaclopride a mis en évidence une résistance chez les femelles d'une souche de drosophile dite ''des champs''. Deux mécanismes différents ont été mis en évidence dans la résistance à l'imidaclopride de cette souche. Le premier concerne la sous expression d'une sous-unité (D1) du récepteur nicotinique à l'acétylcholine, cible de l'imidaclopride. Le deuxième concerne l'implication des glutathion S-transférases, enzymes de détoxification, dans le métabolisme de l'imidaclopride. Ces études montrent que les insecticides peuvent avoir en plus des effets sur les insectes ravageurs, des effets néfastes sur des organismes non cibles. La deuxième étude avait pour but de modéliser chez la drosophile, l'impact d'un organochloré, la dieldrine, potentiellement impliquée dans la maladie de Parkinson chez l'homme. L'exposition à cet insecticide conduit à une dégénérescence des neurones dopaminergiques ainsi qu'une perturbation de la structure de régions particulières du cerveau. Nous avons également montré des altérations du métabolisme et l'implication de processus épigénétiques dans la neurodégénérescence induite par la dieldrine. Au cours de ce travail, nous avons pu montrer l'intérêt de nouvelles méthodes comme l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) ou le High Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) dans ce type d'étude.

Background: Circadian rhythm disturbance is commonly observed in Alzheimer's disease (AD). In mammals, these rhythms are orchestrated by the superchiasmatic nucleus (SCN). Our previous study in the Tg2576 AD mouse model suggests that inflammatory responses, most likely manifested by low GABA production, may be one of the underlying perpetrators for the changes in circadian rhythmicity and sleep disturbance in AD. However, the mechanistic connections between SCN dysfunction, GABA modulation, and inflammation in AD is not fully understood. Objective: To reveal influences of amyloid pathology in Tg2576 mouse brain on metabolism in SCN and to identify key metabolic sensors that couple SCN dysfunction with GABA modulation and inflammation. Methods: High resolution magic angle spinning (HR-MAS) NMR in conjunction with multivariate analysis was applied for metabolic profiling in SCN of control and Tg2576 female mice. Immunohistochemical analysis was used to detect neurons, astrocytes, expression of GABA transporter 1 (GAT1) and Bmal1. Results: Metabolic profiling revealed significant metabolic deficits in SCN of Tg2576 mice. Reductions in glucose, glutamate, GABA, and glutamine provide hints toward an impaired GABAergic glucose oxidation and neurotransmitter cycling in SCN of AD mice. In addition, decreased redox co-factor NADPH and glutathione support a redox disbalance. Immunohistochemical examinations showed low expression of the core clock protein, Bmal1, especially in activated astrocytes. Moreover, decreased expression of GAT1 in astrocytes indicates low GABA recycling in this cell type. Conclusion: Our results suggest that redox disbalance and compromised GABA signaling are important denominators and connectors between neuroinflammation and clock dysfunction in AD.

Background Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed malignant disease among adult males in the USA and the second leading cause of cancer deaths in men. Due to the lack of diagnostic tools that are able to differentiate highly malignant and aggressive cases from indolent tumors, overtreatment has become very common in the era of prostate specific antigen (PSA) screening. New diagnostic methods to determine biological status, malignancy, aggressiveness and extent of PCa are urgently needed. 1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H HRMAS MRS) can be used to establish PCa metabolomic profiles while preserving tissue architecture for subsequent histopathological analysis. Immunohistochemistry (IHC), as opposed to conventional histopathology methods, has the potential to provide objective, more accurate and quantitative knowledge of tissue pathology. This diagnostic- accuracy study sought to evaluate a novel approach to quantitatively identify metabolomic markers of PCa by exploring the potential of PCa immunomarkers to quantify metabolomic profiles established by 1H HRMAS MRS. Material and Methods 1H HRMAS MRS was performed on tissue samples of 51 prostate cancer patients using a 14.1 Tesla NMR spectrometer (BRUKER Biospin, Billerica, MA) with a rotor synchronized CPMG pulse sequence. Spectral intensities of 36 regions of interest were measured as integrals of curve fittings with Lorentzian-Gaussian line shapes. Immunohistochemistry (IHC) was carried out following the spectroscopy scan, using three prostate immunomarkers to identify cancerous and benign glands: P504S (Alpha-methylacyl-CoA-racemace), CK903 (high-molecular weight cytokeratin) and p63. The immunostaining quality following 1H HRMAS MRS was evaluated and compared to unscanned sections of the same sample, to verify the stability and accessibility of the proposed immunomarkers. IHC images were automatically and quantitatively evaluated, using a quantitative image analysis program (QIAP), to determine the percentage of cancerous and benign epithelia in the tissue cross- sections. The results of the program were validated by a correlation with the results of a quantitative IHC review and quantitative conventional histopathology analysis performed by an experienced pathologist. Ultimately, spectral intensities and the cancer epithelium percentage, obtained from quantitative immunohistochemistry, were correlated in order to validate PCa metabolomic markers identified by 1H HRMAS MRS. Patient outcomes and incidence of recurrence were determined by retrospective review of medical records five years after initial surgery. Categories of recurrence were correlated to spectral intensities to explore potential metabolomic markers of recurrence in the cohort. Results Immunostainings with P504S and CK903 showed excellent staining quality and accessibility following 1H HRMAS MRS, suggesting these markers to be suitable for the presented quantitative approach to determine metabolomics profiles of PCa. In contrast, the quality of p63 IHC was impaired after previously performed spectroscopy. IHC using the immunomarkers P504S and CK903 on adjacent slides was found to present a feasible quantitative diagnostic method to distinguish between benign and cancerous conditions in prostate tissue. The cancer epithelium percentage as determined by QIAP showed a significant correlation to the results of quantitative IHC analysis performed by a pathologist (p < 0.001), as well as to a quantitative conventional histopathology review (p = 0.001). The same was true for the benign epithelium percentage (p < 0.001 and p = 0.0183), validating the presented approach. Two metabolomic regions showed a significant correlation between relative spectral intensities and the cancer epithelium percentage as determined by QIAP: 3.22 ppm (p = 0.015) and 2.68 ppm (p = 0.0144). The metabolites corresponding to these regions, phosphocholine and citrate, could be identified as metabolomic markers of PCa in the present cohort. 45 patients were followed for more than 12 months. Of these, 97.8% were still alive five years after initial surgery. 11 patients (24.4%) experienced a recurrence during the follow- up time. The categories of recurrence showed a correlation to the spectral intensities of two regions, 2.33 – 2.3 ppm (p = 0.0403) and 1.28 ppm (p = 0.0144), corresponding to the metabolites phosphocreatine and lipids. Conclusion This study introduces a method that allows an observer-independent, quantitative analysis of IHC to help establish metabolomic profiles and identify metabolomic markers of PCa from spectral intensities obtained with 1H HRMAS NMR Spectroscopy. The immunomarkers P504S and CK903 have been found suitable IHC analysis following 1H HRMAS MRS. A prospective in vivo application of PCa metabolite profiles and metabolomic markers determined by the presented method could serve as highly sensitive, non- invasive diagnostic tool. This observer- independent, computer- automated, quantitative analysis could help to distinguish highly aggressive tumors from low-malignant conditions, avoid overtreatment and reduce risks and complications for cancer patients in the future. Further studies are needed to verify the identified PCa metabolomic markers and to establish clinical applicability.:Table of Contents Glossary 1 Introduction 1. 1 Prostate Cancer 1. 2 Detection of Prostate Cancer – State of the Art 1. 2. 1 Prostate- Specific Antigen Test and Digital Rectal Examination 1.2.2 Radiographic Methods in PCa Detection 1.2.3 Transrectal Core Biopsies and Histopathological Analysis 1.2.4 Histopathological Grading of Prostate Cancer: GLEASON Score 1.3 Challenges and Need for New Approaches in PCa Diagnostic Management 2 Scientific Background I: Nuclear Magnetic Resonance,1H HRMAS NMR Spectroscopy and Metabolomic Profiles 2.1 Nuclear Magnetic Resonance 2.1.1 Spin Precession 2.1.2 Magnetic Resonance 2.1.3 Chemical Shift and J- coupling 2.2 Nuclear Magnetic Resonance 2.2.1 Magic Angle Spinning and 1H HRMAS NMR Spectroscopy 2.2.2 MAS Spinning Rates and Spinning Side Bands 2. 3 Metabolomics, Metabolite Profiles and Clinical Utility 3 Scientific Background II: Immunohistochemistry of Prostate Cancer 4 Aims of the Study 5 Material and Methods 5.1 Prostate Tissue Samples and Patient Demographics 5.2 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.2.1 Sample Preparation 5.2.2 Spectroscopy Scan 5.2.3 Data Processing 5.3 Immunohistochemistry 5.3.1 Immunohistochemistry Material and Equipment 5.3.2. Immunohistochemistry Protocol 5. 3. 3 Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.3.4 Qualitative IHC Analysis 5. 3.5 Quantitative IHC Analysis 5.3.5.1 Quantitative IHC Slide Review 5.3.5.2 Computer-Automated Quantitative IHC Analysis 5.3 Quantitative Histopathology 5. 4 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers 5. 5 Patient Outcomes and Recurrence Categories 5.6 Statistical Analysis 6 Results 6. 1 Patient demographics 6. 2 Spectroscopy Results 6. 3 Immunohistochemistry 6. 3. 1 Evaluation of Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS MRS 6. 3. 2 Qualitative Immunohistochemistry 6. 4 Quantitative Immunohistochemistry 6. 4. 1 Quantitative IHC Slide Review 6. 4. 2 Computer-Automated Quantitative IHC Evaluation using QIAP 6. 5 Quantitative Histopathology 6. 6 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers using QIAP 6. 7 Patient Outcomes and Recurrence 7 Discussion 8 Summary / Abstract 9 Zusammenfassung 10 References 11 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 12 Danksagung 13 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis Appendix A.1 Immunostaining protocols A.2 Spectral Intensities Measured by 1H HRMAS MRS in 51 Samples A.3 Graphs for Correlations of Spectral Intensities and CaE% determined by QIAP in 34 Additional Regions of Interest / Einführung Prostatakrebs ist eine häufigsten Krebserkrankungen in den USA und die zweithäufigste malignom- assoziierte Todesursache männlicher Patienten weltweit. Seit der Einführung des Prostata- spezifischen Antigen (PSA)- Screeningtests wird diese Krebsart in früheren Stadien diagnostiziert und therapiert, wodurch die Mortalitätsrate in den letzten Jahren deutlich reduziert werden konnte. Da moderne diagnostische Methoden bislang jedoch nicht ausreichend in der Lage sind, suffizient zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Varianten dieses bösartigen Krebsleidens zu unterscheiden, werden häufig auch Patienten aggressiv therapiert, deren niedriggradiges Prostatakarzinom keine klinische Relevanz gehabt hätte. Es besteht daher ein großes wissenschaftliches Interesse an der Entwicklung neuer diagnostischer Methoden zur akkuraten Bestimmung von biologischem Status, Malignität, Aggressivität und Ausmaß einer Prostatakrebserkrankung. \\\\\\\"1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy\\\\\\\" (1H HRMAS MRS) ist eine vielversprechende diagnostische Methode, welche es ermöglicht, metabolomische Profile von Prostatakrebs zu erstellen, ohne die Gewebsstruktur der analysierten Proben zu zerstören. Durch anschließende histopathologische Begutachtung lassen sich die erstellten Metabolitprofile validieren und evaluieren. Im Gegensatz zu konventionellen histopathologischen Methoden können durch immunhistochemische Verfahren dabei objektivere, akkuratere und quantifizierbare histopathologische Erkenntnisse gewonnen werden. Die vorliegende Studie präsentiert einen neuentwickelten diagnostischen Ansatz zur quantitativen Bestimmung von metabolomischen Markern von Prostatakrebs, basierend auf der Durchführung von 1H HRMAS NMR Spektroskopie und quantitativer Immunhistochemie. Material und Methoden Einundfünfzig Gewebsproben von Prostatakrebspatienten wurden mittels 1H HRMAS MRS an einem 14.1 T BRUKER NMR Spektrometer unter Einsatz einer CPMG-Pulssequenz untersucht. Spektrale Intensitäten in 36 Metabolitregionen wurden gemessen. Anschließend wurden die analysierten Gewebeproben mit drei Immunfärbemarkern für sowohl malignes (P504S, Alpha-methylacyl-CoA-racemase) als auch benignes (CK903, High-molecular weight cytokeratin, und p63) Prostatagewebe angefärbt und quantitativ mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms (QIAP) ausgewertet. Die Anwendbarkeit und Auswertbarkeit der genannten Immunomarker nach Spektroskopie wurde evaluiert und mit der Färbungsqualität von nicht- gescannten Schnitten verglichen. Die Resultate der automatischen Auswertung durch QIAP konnten durch einen erfahrenen Pathologen in einer quantitativen Analyse der Immunfärbungen sowie konventioneller histologischer Färbungen derselben Gewebsproben validiert werden. Die spektralen Intensitäten aus den Messungen mit 1H HRMAS MRS wurden mit den korrespondierenden Ergebnissen der quantitativen Auswertung der Immunfärbungen korreliert, um metabolomische Marker von Prostatakrebs zu identifizieren. Der klinische Verlauf und die Rezidivrate der Patienten wurden 5 Jahre nach der initialen Prostatektomie retrospektiv bestimmt. Rezidivkategorien wurden erstellt und mit den bestimmten spektralen Intensitäten korreliert, um metabolomische Marker für das Auftreten von Prostatakrebsrezidiven zu identifizieren. Ergebnisse Die Immunfärbungen mit P504S und CK903 zeigten exzellente Qualität und Auswertbarkeit nach vorheriger 1H HRMAS MRS. Beide Marker eigneten sich zur Durchführung von quantitativer Immunhistochemie an spektroskopierten Gewebeproben. Im Gegensatz dazu war die Qualität der Immunfärbungen mit p63 nach Spektroskopie vermindert. Quantitative Immunfärbungen unter Einsatz der Immunmarker P504S und CK903 stellten eine praktikable diagnostische Methode dar, um zwischen malignen und benignem Prostatagewebe zu unterscheiden. Der Anteil von bösartig verändertem Prostatagewebe, bestimmt durch QIAP, korrelierte signifikant mit den Ergebnissen der quantitativen Analyse der Immunfärbungen durch den Pathologen (p < 0.001), sowie mit der quantitativen Auswertung der konventionellen histopathologischen Färbung (p = 0.001). Ebenso ließ sich die Bestimmung des Anteils von benignem Gewebe mit QIAP zu den Ergebnissen der pathologischen Analyse korrelieren (p < 0.001 und p = 0.0183). Für zwei metabolomische Regionen konnte ein signifikante Korrelation zwischen relativen spektralen Intensitäten, bestimmt mit 1H HRMAS NMR Spektroskopie, und dem Anteil von malignem Epithelium in derselben Gewebeprobe, ermittelt durch QIAP, festgestellt werden: 3.22 ppm (p = 0.015) und 2.68 ppm (p = 0.0144). Die zu diesen Regionen korrespondierenden Metaboliten, Phosphocholin und Zitrat, konnten als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Die retrospektiven Analyse der klinischen Daten der Patienten fünf Jahre nach Prostatektomie ergab eine Überlebensrate von 97.8%. Elf dieser Patienten (24.4%) erlitten ein Rezidiv ihrer Erkrankung. Die bestimmten Rezidivkategorien korrelierten signifikant mit zwei metabolomischen Regionen (2.33 – 2.3 ppm, p = 0.0403 und 1.28 ppm, p = 0.0144), welche zu den Metaboliten Phosphokreatin und Lipiden korrespondierten. Schlussfolgerung Die vorliegende Studie präsentiert einen diagnostischen Ansatz zur objektiven und quantitativen Bestimmung metabolomischer Marker von Prostatakrebs unter Verwendung von 1H HRMAS MRS und Immunhistochemie. P504S und CK903 eignen sich als Immunmarker für quantitative Immunfärbungen nach vorheriger Durchführung von 1H HRMAS MRS. Die Metaboliten Phosphocholin und Zitrat konnten in der vorliegenden Patientenkohorte als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Eine mögliche in vivo Anwendung der gefundenen metabolomischen Marker könnte als hochsensitives, objektives und nicht- invasives diagnostisches Werkzeug der Prostatakrebsdiagnostik dienen. Der vorliegende untersucherunabhängige, automatisierte und quantitative diagnostischer Ansatz hat das Potential, zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Krebsfällen zu unterscheiden und somit unnötige Risiken und Komplikationen für Prostatakrebspatienten zu reduzieren. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die identifizierten metabolomischen Marker zu verifizieren und eine klinische Anwendung zu etablieren.:Table of Contents Glossary 1 Introduction 1. 1 Prostate Cancer 1. 2 Detection of Prostate Cancer – State of the Art 1. 2. 1 Prostate- Specific Antigen Test and Digital Rectal Examination 1.2.2 Radiographic Methods in PCa Detection 1.2.3 Transrectal Core Biopsies and Histopathological Analysis 1.2.4 Histopathological Grading of Prostate Cancer: GLEASON Score 1.3 Challenges and Need for New Approaches in PCa Diagnostic Management 2 Scientific Background I: Nuclear Magnetic Resonance,1H HRMAS NMR Spectroscopy and Metabolomic Profiles 2.1 Nuclear Magnetic Resonance 2.1.1 Spin Precession 2.1.2 Magnetic Resonance 2.1.3 Chemical Shift and J- coupling 2.2 Nuclear Magnetic Resonance 2.2.1 Magic Angle Spinning and 1H HRMAS NMR Spectroscopy 2.2.2 MAS Spinning Rates and Spinning Side Bands 2. 3 Metabolomics, Metabolite Profiles and Clinical Utility 3 Scientific Background II: Immunohistochemistry of Prostate Cancer 4 Aims of the Study 5 Material and Methods 5.1 Prostate Tissue Samples and Patient Demographics 5.2 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.2.1 Sample Preparation 5.2.2 Spectroscopy Scan 5.2.3 Data Processing 5.3 Immunohistochemistry 5.3.1 Immunohistochemistry Material and Equipment 5.3.2. Immunohistochemistry Protocol 5. 3. 3 Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.3.4 Qualitative IHC Analysis 5. 3.5 Quantitative IHC Analysis 5.3.5.1 Quantitative IHC Slide Review 5.3.5.2 Computer-Automated Quantitative IHC Analysis 5.3 Quantitative Histopathology 5. 4 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers 5. 5 Patient Outcomes and Recurrence Categories 5.6 Statistical Analysis 6 Results 6. 1 Patient demographics 6. 2 Spectroscopy Results 6. 3 Immunohistochemistry 6. 3. 1 Evaluation of Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS MRS 6. 3. 2 Qualitative Immunohistochemistry 6. 4 Quantitative Immunohistochemistry 6. 4. 1 Quantitative IHC Slide Review 6. 4. 2 Computer-Automated Quantitative IHC Evaluation using QIAP 6. 5 Quantitative Histopathology 6. 6 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers using QIAP 6. 7 Patient Outcomes and Recurrence 7 Discussion 8 Summary / Abstract 9 Zusammenfassung 10 References 11 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 12 Danksagung 13 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis Appendix A.1 Immunostaining protocols A.2 Spectral Intensities Measured by 1H HRMAS MRS in 51 Samples A.3 Graphs for Correlations of Spectral Intensities and CaE% determined by QIAP in 34 Additional Regions of Interest