Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-09-08T14:50:10Z No. of bitstreams: 1 2016_MarcusAuréliodaCostaTavaresSabino.pdf: 1902510 bytes, checksum: 9746d9bbcc04914de08edc18633f28c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-11-08T11:12:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarcusAuréliodaCostaTavaresSabino.pdf: 1902510 bytes, checksum: 9746d9bbcc04914de08edc18633f28c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T11:12:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarcusAuréliodaCostaTavaresSabino.pdf: 1902510 bytes, checksum: 9746d9bbcc04914de08edc18633f28c0 (MD5) / Nos animais sensíveis à privação de O2, é observada a injúria tecidual durante a hipóxia e o reoxigenação, tendo como causa principal o estresse oxidativo gerado por radicais livres derivados do oxigênio. Uma das estratégias encontradas por uma ampla variedade de animais à escassez de oxigênio é responder a este insulto com aumento das defesas antioxidantes, e assim evitar o dano oxidativo causado pelos radicais livres, fenômeno nomeado de preparo para o estresse oxidativo (POS). Nossa pergunta é saber se o fenômeno bioquímico do POS acontece na natureza, em especial, no ambiente entre marés, no qual mudanças cíclicas de retirada e oferta de oxigênio acontecem durante a baixa e alta das marés. Nestas condições de baixa e alta da maré em uma praia de Penha (Santa Catarina, Brasil), foi estudado o metabolismo redox envolvendo glutationa (GSH), em análise de corpo inteiro nos mexilhões da espécie Mytilaster solisianus, em três diferentes coletas (chamadas de I, II e III). Os animais mostraram suportar o esperado desequilíbrio redox durante as situações de exposição aérea (de até quatro horas na coleta I e II, e até 9 horas na coleta III) e reimersão no campo, pois os parâmetros antioxidantes endógenos relacionados ao metabolismo de GSH estiveram inalterados durante o ciclo das marés (i.e. Eq-GSH, GSH, GSSG e GSSG/Eq-GSH). Todavia na coleta III, houve uma queda dos níveis totais de Eq-GSH após duas horas de exposição aérea em relação ao grupo de animais pré-imersos. Na coleta III houve uma forte variação da temperatura do ar ao longo da exposição aérea (de 19 para 28° C), apesar disso, o indicador de desequilibrio redox não mudou (razão GSSG/Eq-GSH), mostrando que estes animais têm alto grau de adaptabilidade neste ambiente, no qual os fatores abióticos estão em constante mudança. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In animals sensible to oxygen privation is seen injury in their tissues during hypoxia and reoxygenation, and the main cause is the oxidative stress generated by oxygen-derived free radicals. One of the strategies found by a widespread variety of animals to survive oxygen lack is respond with increase of antioxidant defenses, and thus avoiding the oxidative damage caused by free radicals, a phenomenon named preparation for oxidative stress (POS). Our question address if biochemical phenomenon of POS happens in nature, in special, in the intertidal environment, where changes cyclical of lack and supply oxygen happens during low and high tide. In these conditions of low and high tide in beach of Penha (Santa Catarina, Brazil), was studied redox metabolism of glutathione (GSH), in body whole analysis in the mussel specie Mytilaster solisianus in three differents expeditions (named of I, II e III). The animals shown endure to the expected redox imbalance during aerial exposure (until four hours in expedition I e II, and until 9 hours in expedition III) and reimmersion in field, because the endogenous antioxidant parameters related to the metabolism of the glutathione remained unchanged during tidal cycle (i.e GSH-eq, GSH, GSSG and GSSG/GSH-eq ratio). However in expedition III, there was a drop in glutathione pool (GSH-eq) after two hours of aerial exposure when compared to group of animals pre-emersion. In expedition III there was a strength variation in air temperature (19 to 28° C) during aerial exposure, despite this, the index of redox imbalance remained unchanged (GSSG/GSH-eq) in expedition III, showing that mussels have high level of adaptability in this environment, in which abiotic factors are in continuous changes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Marília Freitas (marilia@bce.unb.br) on 2015-10-29T12:33:32Z No. of bitstreams: 1 2014_NestorFabianLeytonCastro.pdf: 3484643 bytes, checksum: 3f92622240d0f7e59822aca3974ed379 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-02-12T21:00:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_NestorFabianLeytonCastro.pdf: 3484643 bytes, checksum: 3f92622240d0f7e59822aca3974ed379 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-12T21:00:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_NestorFabianLeytonCastro.pdf: 3484643 bytes, checksum: 3f92622240d0f7e59822aca3974ed379 (MD5) / A hipóxia ocorre quando as células são expostas a baixas tensões (< 5%) de oxigênio. Isto afeta o metabolismo, a expressão de genes, a secreção e resposta a hormônios e pode garantir a sobrevivência ou algumas vezes iniciar uma cascata apoptótica. O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) humano regula a transcrição de inúmeros genes envolvidos na resposta à hipóxia e tem importante papel em processos fisiológicos e patológicos. Ele é um heterodímero formado pelas subunidades HIF-1α e HIF-1β, também chamada de transportador nuclear de arilhidrocarbono (ARNT). Em condições de normóxia, o HIF-1 é hidroxilado pelas prolilhidroxilases (PHDs) e marcado para degradação pelo proteasoma. Porém, quando as células se encontram sob hipóxia, as PHDs são inibidas e assim ocorre o acúmulo do HIF-1. Alterações no estado redox podem ter efeito na ativação do HIF-1 e foi verificado que condições de estresse oxidativo podem levar à ativação deste fator. O estresse oxidativo ocorre quando as moléculas antioxidantes e os mecanismos de defesa celular são incapazes de proteger a célula dos efeitos das espécies reativas de oxigênio (EROs) as quais atacam moléculas biológicas vitais, tais como lipídeos, DNA dentre outras. As EROs incluem os radicais livres derivados de oxigênio, entre essas o íon superóxido (O2●-), o radical hidroxila (●OH-), e outras moléculas que embora não possuam elétrons livres são muito reativas devido à sua instabilidade, como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Para estudar os efeitos do HIF-1 sob condições de estresse oxidativo, escolhemos a levedura Saccharomyces cerevisiae, também conhecida como levedura de padeiro. A utilização da levedura S. cerevisiae tem provado ser muito útil como um modelo de sistema in vivo para estudar a ação de fármacos, a expressão de proteínas heterólogas e a função básica de fatores de transcrição humanos. Foram usadas três linhagens mutantes, EG103αβ a qual expressa as duas subunidades do fator de transcrição HIF-1, EG103αΔβ que expressa a subunidade beta truncada e a linhagem EG103M2 que possue o vetor vazio. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta ao estresse oxidativo dessas linhagens de leveduras para aprofundar o conhecimento sobre a regulação da atividade de HIF-1. O crescimento das linhagens foi investigado e os resultados mostraram que a linhagem EG103αβ teve um crescimento menor que as outras duas linhagens (EG103αΔβ e EG103M2) em normóxia. Quando tratada com várias concentrações de H2O2 o crescimento da linhagem EG103αβ diferiu do controle não tratado somente nas concentrações de 1 e 2 mM, quando houve uma diminuição do crescimento. Essa resposta foi similar àquela das outras duas linhagens. Então não foi uma resposta específica da linhagem EG103αβ, indicando que a expressão do HIF-1 não alterou a sensibilidade da resposta ao H2O2. Ao tratar as células com alguns agentes oxidantes como Menadiona (MD), hidroperóxido de cumene (CHP) e terc-butilhidroperóxido (t-BHP) os resultados mostraram que a linhagem EG103αβ apresentava uma susceptibilidade menor à MD na concentração 50 μM, em comparação com as outras linhagens. O uso do inibidor da catalase ATZ (10 mM) e H2O2 0,5 mM mostrou que a susceptibilidade da linhagem EG103αβ aumentou em relacão ao controle tratado somente com H2O2. Nas duas outras linhagens o aumento da susceptibilidade ocorreu com uma concentração menor de ATZ (2 mM) e H2O2 0,5 mM. Isto indica que talvez a linhagem EG103αβ tenha maiores concentrações de catalase em relação às outras duas linhagens. O uso do inibidor da síntese de glutationa, butionina-sulfoximina (BSO) não mostrou uma resposta diferenciada da linhagem EG103αΔβ à exposição ao H2O2. O uso do quelante de ferro, deferoxamina (DFO) também mostrou uma ação de proteção contra o dano oxidativo na linhagem EG103αβ, indicando um papel da ausência de ferro na proteção pelo HIF-1. Medidas dos níveis de glutationa (GSH-eq) e da enzima superóxido dismutase devem ser repetidas para conclusão definitiva de seu papel na linhagem EG103αβ. Em conclusão, os resultados indicam que a expressão das subunidades que compõem o HIF-1 humano em leveduras reduz seu crescimento, aumenta sua resistência à menadiona e talvez os níveis de catalase e faz com que um quelante de ferro tenha papel protetor nestas células. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Hypoxia occurs when cells are exposed to low oxygen tensions (<5%). It affects the metabolism, gene expression, secretion and response to hormones and can ensure the survival or sometimes initiate an apoptotic cascade. The human hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) regulates the transcription of numerous genes involved in the response to hypoxia and plays an important role in physiological and pathological processes. HIF-1 is a heterodimer formed by the HIF-1α and HIF-1β subunits, the latter also called arylhydrocarbone nuclear transporter (ARNT). In normoxic conditions, HIF-1 is hydroxylated by prolylhidroxilases (PHDs) and marked for degradation by the proteasome. However, when cells are under hypoxia, the PHDs are inhibited and HIF-1 accumulates. Changes in the redox state may have an effect on HIF-1 activation and oxidative stress conditions have been to lead to the activation of this factor. Oxidative stress occurs when the antioxidant molecules and cellular defense mechanisms are unable to protect the cell from the effects of reactive oxygen species (ROS) which attack vital biological molecules such as lipids, DNA and others. ROS include free radicals derived from oxygen, among these the superoxide ion (O2●-), o hydroxyl radical (●OH-), and other molecules that although not having free electrons are very reactive due to its instability, such as hydrogen peroxide (H2O2). To study the effects of HIF-1 under conditions of oxidative stress, we chose the yeast Saccharomyces cerevisiae, also known as Baker's yeast. The use of S. cerevisiae has proven to be very useful as an in vivo model system to study the action of drugs, the expression of heterologous proteins and the basic function of human transcription factors. The three mutant strains, EG103αβ which expresses the two subunits of HIF-1 transcription factor, EG103αΔβ, expressing the truncated beta subunit and EG103M2 strain that possesses an empty vector were used. The objective of this study was to evaluate the oxidative stress response of the yeast strains to increase knowledge about the regulation of HIF-1 activity. The growth of the strains was investigated and the results showed that the strain EG103αβ had a slower growth than the other two strains (EG103αΔβ and EG103M2) under normoxia. When treated with various concentrations of H2O2 the growth of EG103αβ differed from the untreated control only at concentrations of 1 and 2 mM, when there was a decline in growth. This response was similar to that of the other two strains. So it was not a specific response of EG103αβ, indicating that HIF-1 expression did not change the sensitivity response to H2O2. By treating the cells with certain oxidizing agents such as Menadione (MD), cumene hydroperoxide (CHP) and tert-butylhydroperoxide (t-BHP) the results showed that the strain EG103αβ has lower susceptibility to 50 uM MD concentrations, compared to the other strains. The use of the catalase inhibitor ATZ (10 mM) and 0.5 mM H2O2 showed that the susceptibility of EG103αβ increased compared to the control treatment only with H2O2. In the other two strains increased susceptibility was observed with a smaller concentration of ATZ (2 mM) and 0.5 mM H2O2. This indicates that EG103αβ has higher catalase levels in comparison to the other two strains. The use of the inhibitor of glutathione synthesis, buthionine sulfoximine (BSO) showed that EG103αΔβ responded similarly to the other two strains. The use of the iron chelator, deferoxamine (DFO) showed a protective effect against oxidative damage in EG103αβ, indicating a role of iron absence in the protection by HIF-1. Measures of glutathione levels (GSH-eq) and superoxide dismutase should be repeated for definitive conclusion of their role in the EG103αβ lineage. In conclusion, the results indicate that the expression of the subunits that make up the human HIF-1 reduces yeast growth, increases its resistance to menadione and perhaps levels of catalase and makes an iron chelator a protective agent in these cells.