München, Techn. University, Diss., 2007.

Thesis (doctoral)--University of Göteborg, 1994. / Includes bibliographical references.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in engl. Sprache.

Die hypertherme intraperitoneale Chemoperfusion (hyperthermic intraperitoneal chemotherapy, HIPEC) ist ein vielversprechendes Verfahren bei Patienten mit limitierter Peritonealkarzinose. Möglicherweise wirken Hitzeschockprotein (HSP)-vermittelte Reparaturmechanismen und proliferative Effekte dem Therapieerfolg jedoch entgegen. Um solche möglichen limitierenden Faktoren zu untersuchen, wurden in einem in vitro-HIPEC-Modell die Auswirkungen von Hyperthermie und Chemotherapie auf die Expression von HSPs und die Proliferationsmarker Ki-67 und PCNA im Kolonkarzinom mittels RT-qPCR und Western Blot untersucht. Es zeigten sich hochregulierte HSPs, die mit zunehmender Temperatur und durch die Zugabe von Chemotherapie zunahmen. Man kann davon ausgehen, dass hierdurch intrazelluläre antiapoptotische Effekte und Reparaturmechanismen induziert werden. Die Inhibition von HSPs könnte daher zu einer Verbesserung der HIPEC-Therapie führen. Zum anderen fand sich eine Erhöhung der Proliferationsmarker Ki-67 und PCNA nach der in vitro-HIPEC, was auf ein aggressives Wachstumsverhalten der überlebenden Zellen hindeutet. / Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) represents a promising treatment option for patients with limited peritoneal carcinomatosis. Heat shock protein (HSP)-mediated repair mechanisms und proliferative effects may negatively influence the HIPEC therapy. In order to analyze such limitating factors, we analyzed the effects of hyperthermia and chemotherapy in an in vitro-HIPEC model on the expression of HSPs and the proliferation markers Ki-67 and PCNA in colon cancer cells by RT-qPCR and Western Blot. Up-regulated HSPs expression was found, which increased with higher temperature and the use of chemotherapy. It is assumed that antiapoptotic effects and repair mechanisms are therefore induced. The inhibition of HSPs might improve HIPEC therapy. In addition, the proliferation markers Ki-67 and PCNA were found to be up-regulated after in-vitro-HIPEC, which points to an aggressive rate of growth of the survived colon cancer cells.

Protective vaccination against intracellular pathogens using HSP fusion proteins in the listeria model. / Impfschutz gegen intrazelluläre Pathogene durch Immunisierung mit HSP-Fusionsproteinen im listerien Modell.

Cancer is the leading cause of death in economically developed countries (Jemal et al. 2011). Heat shock protein 90 can be a promising target in cancer treatment as it is responsible for sustaining protein homeostasis in every human cell by folding and activating of more than 200 client proteins (Picard et al. 2002). Apart from strong anti-tumor activities in vitro (Smith et al. 2005) and in vivo (Supko et al. 1995), Hsp90 inhibitors can sensitize tumor cells to radiation (Bisht et al. 2003, Stingl et al.2010, Schilling et al. 2011). Recently, our group showed the radiosensitizing potential of novel Hsp90 inhibitors: NVP-AUY922 and NVP-BEP800 (Stingl et al. 2010). The drugs were administered to cancer cell lines of different origin 24 hours before irradiation (drug-first treatment). In the present work, we explored the effects of a schedule other than drug-first treatment on A549 and SNB19 tumor cell lines. Cell samples were treated with either NVP-AUY922 or NVP-BEP800 one hour before IR and kept in the drug-containing medium for up to 48 hours (simultaneous drug-IR treatment). Our findings showed that depending on the tumor cell line, the combination of Hsp90 inhibition and irradiation may result in radiosensitization or apoptosis of cancer cell lines. It is advised to adjust the sequence of treatment, involving Hsp90 inhibition and irradiation, on the basis of the genetic background of tumor cells. Before entering the clinic, novel therapeutics should be tested on non-malignant tissue to exclude their possible toxic activities. Thus, we applied the simultaneous drug-IR treatment on human skin fibroblast strains. This work showed that Hsp90 inhibitors NVP-AUY922 and NVP-BEP800 preferentially sensitize tumor cells to radiation, whereas the effect(s) on normal fibroblasts was much weaker. The exact mechanisms underlying the Hsp90 inhibitors’ selectivity towards malignant cells remain to be elucidated. It was shown previously that the administration of Hsp90 inhibitors, including NVP-AUY922 and NVP-BEP800, induces heat shock response (Niewidok et al. 2012). Heat shock response triggers the up-regulation of Hsp70, which, due to its strong anti-apoptotic properties, might be responsible for reducing the effects of Hsp90 inhibition. The transfection with Hsp70 siRNA suppressed the NVP-AUY922-induced over-expression of the target protein. However, on the long-term scale, it did not influence the radiosensitivity of A549 and SNB19 cells. To summarize, the use of siRNA proved that Hsp70 inhibition could be used to support Hsp90 inhibition on the short-term scale. Therefore, for future works, more potent and stable methods of Hsp70 inhibition are needed. This thesis presented the effects induced by two novel Hsp90 inhibitors NVP-AUY922 and NVP-BEP800, in combination with irradiation in tumor cell lines as well as in normal skin fibroblasts. Hsp70 pre-silencing was tested as a method for improving radiosensitizing potential of NVP-AUY922. These results support the use of NVP-AUY922 and NVP-BEP800 in combination with irradiation in future clinical trials. / Trotz aller wissenschaftlicher Fortschritte, die in den letzten Jahren in der Onkologie erfolgten, ist Krebs eine der Haupttodesursachen in den wirtschaftlich entwickelten Ländern. Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) stellt ein vielversprechendes neues Target für die Krebstherapie dar, weil es einen großen Anteil des Proteingleichgewichts in jeder humanen Zelle durch Faltung und Aktivierung seiner Klientenproteine kontrolliert (Picard et al. 2002, Trepel et al. 2010). Es wurde gezeigt, dass Hsp90 Inhibitoren starke anti-proliferative Eigenschaften in vitro (Smith et al. 2005) und in vivo aufweisen (Supko et al. 1995). Außerdem führte die Hsp90 Inhibition zur Radiosensibilisierung unterschiedlicher Tumorzelllinien (Bisht et al. 2003, Stingl et al.2010, Schilling et al. 2011). Vor Kurzem wurde in unserer Arbeitsgruppe gezeigt, dass die neuartigen Hsp90 Inhibitoren NVP-AUY922 und NVP-BEP800 zur Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit der Tumorzelllinien führen (Stingl et al. 2010). Die Krebszellen wurden 24 Stunden vor der Bestrahlung behandelt und bestrahlt (‚drug-first’ Behandlungsschema). In dieser Doktorarbeit wurden die Effekte eines anderen Behandlungsschemas auf die A549 und SNB19 Tumorzelllinien untersucht. Die Zellen wurden entweder mit NVP-AUY922 oder NVP-BEP800 eine Stunde vor der Bestrahlung behandelt und bis zu 48 Stunden nach der Bestrahlung weiterhin mit Hsp90 Inhibitor kultiviert (simultane drug-IR Behandlungsschema). Zusammenfassend zeigen die hier gewonnenen Ergebnisse, dass abhängig von der Tumorzelllinie, die Kombination der Hsp90 Inhibition mit Bestrahlung zur Radiosensibilisierung oder zur Apoptose führen kann. Die Reihenfolge der Behandlung mit Hsp90 Inhibitoren und Bestrahlung sollte individuell der Tumorart und den vorliegenden Mutationen angepasst werden. Bevor Medikamente in der Klinik angewendet werden können, müssen sie auf nicht-malignem Gewebe getestet werden, um eine mögliche toxische Wirkung auszuschließen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit die zwei humane Hautfibroblastenlinien HFib1 und HFib2 nach dem simultanen Behandlungsschema mit Hsp90 Inhibitoren und Bestrahlung behandelt. Diese Arbeit zeigte, dass NVP-AUY922 und NVP-BEP800 Tumorzelllinien für die Bestrahlung sensibilisieren, wohingegen der Einfluss von Hsp90 Inhibitoren auf normale Fibroblasten geringer war. Der exakte Mechanismus der Selektivität der Hsp90 Inhibitoren auf Krebszellen ist aber noch unbekannt und erfordert weitere Experimente. Die Behandlung mit N-terminalen Hsp90 Inhibitoren, zum Beispiel mit NVP-AUY922 oder mit NVP-BEP800, induziert die Hitzeschockantwort und unter anderem die Hochregulierung von Hsp70 (Niewidok et al. 2012). Hsp70 ist bekannt für seine starken anti-apoptotischen Eigenschaften, die das therapeutische Potenzial der Hsp90 Inhibitoren reduzieren können. Die Behandlung mit siRNA reduzierte die von NVP-AUY922 induzierte Hsp70-Überexpression, aber beeinflusste nicht die Strahlenempfindlichkeit der Tumorzelllinien A549 und SNB19. Die Transfektion mit siRNA hat bewiesen, dass die Hsp70 Inhibition als eine Unterstützung der Hsp90 Inhibition dienen kann. Dies ist jedoch eine kurzzeitige Methode der Hemmung und alternative Methoden zur Hemmung der Hsp70 Aktivitäten nötig sind. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse erläutern die Effekte, die von zwei neuartigen Hsp90 Inhibitoren NVP-AUY922 und NVP-BEP800 in Kombination mit Bestrahlung induziert werden, sowohl in Tumorzelllinien als auch in normalen Hautfibroblasten. Hsp70-Silencing wurde als Methode zur Erhöhung des radiosensibilisierenden Potenzials des Inhibitor NVP-AUY922 getestet. Alle diese Resultate zusammen sprechen für eine Anwendung von NVP-AUY922 und NVP-BEP800 in klinischen Studien, die alleine oder in Kombination mit Bestrahlung erfolgen könnte.

Das Multiple Myelom (MM) zeichnet sich durch eine krankhafte Entartung der Plasmazellen im Knochenmark aus und gilt heute trotz zahlreicher Behandlungsfortschritte immer noch als unheilbar. Als attraktive Zielstrukturen für neue Therapiemöglichkeiten haben sich in den vergangenen Jahren „Heat-Shock“-Proteine etabliert. Diese liegen häufig überexprimiert vor und sind bei der Stabilisierung mehrerer onkogener Signalwege des MM von zentraler Bedeutung. Zunächst wurden von Pharmaunternehmen verschiedene Inhibitoren von HSP90 entwickelt, die sich in präklinischen MM-Studien als erfolgreich herausstellten, in klinischen Studien jedoch nur eine begrenzte Wirksamkeit zeigten, da eine Inhibition von HSP90 zu einer schnellen HSF-1-vermittelten Hochregulation der HSP70- Expression führt. Dies kompensiert die Inhibition von HSP90 und führt damit zu einer Abschwächung der Anti-Tumoraktivität. Eine duale Hemmung von HSP90 und des HSF-1/HSP70-Systems wird daher als vielversprechende Strategie für eine wirksame Behandlung des MM betrachtet. Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen der klinischen Forschergruppe 216 erstellt wurde, befasst sich daher mit der Entwicklung von Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems. Hierzu wurden zwei unabhängige Strategien verfolgt. Neben einem indirekten Ansatz, der auf einer blockierten HSP70-Expression via Inhibition des HSF-1-Signalwegs beruht, stand die direkte Inhibition von HSP70 im Fokus. Die erzielten Ergebnisse im Einzelnen: 1) In Anlehnung an den HSF-1-Inhibitor NZ28 (12) sollte untersucht werden, ob das dort enthaltene Tetrahydroisochinolin-Gerüst eine Leitstruktur für die Entwicklung von Hemmstoffen des HSF-1-Signalwegs darstellt. Hierzu wurde eine Reihe unterschiedlich substituierter Tetrahydroisochinolinon-Derivate hergestellt. Die Synthese erfolgte über eine sequenzielle Ugi-Heck-Reaktion, da hierbei drei Substituenten des Tetrahydro- isochinolin-Gerüsts hochflexibel und unabhängig voneinander variiert werden können und sich so leicht ein breites Spektrum verschiedener Tetrahydroisochinolinon-Derivate aufbauen lässt. Eine Bioaktivitätsanalyse zeigte jedoch, dass keine der so erhaltenen Verbindungen (26) die HSF-1-vermittelte HSP70-Expression zu inhibieren vermochte. Um den Einfluss des spezifischen Substitutionsmusters der via Ugi-Heck-Reaktion erhaltenen Produkte zu untersuchen, wurde außerdem eine Auswahl der als HSP70- Inhibitoren synthetisierten Tetrahydroisochinolinone (24 und 36) im HSF-1-Assay getestet. Da auch für diese Verbindungen keine Inhibition des Signalwegs beobachtet werden konnte, besteht Grund zur Annahme, dass substituierte Tetrahydroisochinolin-Derivate nicht als Leitstruktur für die Entwicklung von HSF-1-Inhibitoren geeignet sind. 2) Im Gegensatz zu den synthetisierten Tetrahydroisochinolinonen zeigten einige der als Zwischenprodukte der Ugi-Heck-Reaktion isolierten α-Acylaminocarboxamide, die durch ein Michael-System charakterisiert sind, eine Inhibition der HSF-1-vermittelten HSP70- Expression. Zwar konnten keine eindeutigen Struktur-Wirkungsbeziehungen bezüglich einzelner Substituenten abgeleitet werden, aber es zeigte sich, dass die beobachtete Bioaktivität nicht vom enthaltenen Michael-System abhängig ist. Dem Wirkprinzip der α-Acylaminocarboxamide scheint somit keine kovalente Bindung mit nukleophilen Seitenketten von Proteinen zugrunde zu liegen, was das Potenzial unspezifischer Interaktionen reduziert. 3) Bei der Ugi-Multikomponentenreaktion wurden als Carbonsäurederivate auch β-Acyl-substituierte Acrylsäuren eingesetzt. Dabei wurde beobachtet, dass dieser Austausch zur Bildung von pharmakologisch interessanten 2,5-Diketopiperazinderivaten (35) führt. Die in nur einem Reaktionsschritt erhaltenen 2,5-DKPs zeigten eine spezifische und dosisabhängige antiproliferative Wirkung auf aktivierte T-Zellen, was sie als potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Behandlung von unbeabsichtigten T-Zell-vermittelten Autoimmunantworten interessant macht (AG Topp). Eine Analyse der Struktur-Wirkungsbeziehungen zeigte unter anderem eine Präferenz für trans-konfigurierte 2,5-DKPs. Die Aktivität der potentesten Verbindungen der syntheti- sierten Serie lag in derselben Größenordnung wie die der Positiv-Kontrolle 17-Dimethoxyaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, 4b). 4) Ausgangspunkt für die Entwicklung neuartiger HSP70-Inhibitoren war das Ergebnis eines virtuellen Screenings (AG Sotriffer), das darauf abzielte die Proteinfunktion durch eine Interaktion mit dem Interdomänen-Interface von HSP70 zu blockieren. Im ersten Schritt wurde eine diastereoselektive und hochflexible Reaktionssequenz zum virtuelle Screening-Hits (trans-24a) etabliert, mit der im zweiten Schritt eine Bibliothek verwandter Substanzen aufgebaut wurde. Gezielte strukturelle Modifikationen erlaubten dabei wesentliche Strukturelemente zu identifizieren sowie Informationen für die Generierung von Derivaten mit höherer Aktivität zu gewinnen. Die wichtigsten Erkenntnisse dabei waren: - Ausschließlich trans-konfigurierte Tetrahydroisochinolinon-Derivate sind wirksam. - Carboxamide (Pos. 4) sind aktiver als analoge Carbonsäuren. - Die Methoxyfunktion am Phenylsubstituenten in Pos.3 ist für die Aktivität wichtig, dagegen führt das Entfernen der OCH3- Gruppe am Phenylring in Pos. 2 zu einer Aktivitätssteigerung. - Eine aliphatische MeNH-Einheit am exozyklischen Amid reduziert die Aktivität gegenüber Arylamidsubstituenten um eine Zehnerpotenz. Darüber hinaus führt ein tertiärer Dimethylcarboxamid-Rest zum vollständigen Aktivitätsverlust. Zur Falsifizierung der postulierten Bindetasche wurden zusätzlich gezielt Derivate mit sterisch anspruchsvollen Substituenten (Tetrahydronaphthyl, Phenoxyphenyl) hergestellt, die nicht in der Lage sein sollten im berechneten Bindemodus am Interdomänen-Interface zu binden. Dabei stand das so ermittelte verfügbare Platzangebot in Einklang mit den aufgrund der Docking-Analysen getroffenen Annahmen. Um die Enantioselektivität der Aktivität der trans-Verbindungen zu prüfen, wurde für zwei repräsentative Carboxamide (24a und 24i) eine Enantiomerentrennung mittels chiraler HPLC durchgeführt und die Enantiomere einzeln getestet. Dabei erwiesen sich die R,R-Derivate als Träger der Anti-MM-Wirksamkeit. Zur Abschätzung der Permeabilität wurden die PSA-Werte der Carboxamide (24) berechnet. Mit Ausnahme der hydroxylsubstituierten Verbindung 24r lagen die Werte aller Derivate (24a-q) in einem Bereich von 65–88Å2, was einen akzeptablen Resorptionsanteil von 55–90% erwarten lässt. Die Bestimmung der Lipophilie der hergestellten Carboxamide mittels HPLC ergab einen logD-Bereich von 1–3, in dem Wirkstoffe einen ausgewogenen lipophilen Charakter besitzen. Die Effizienz der hergestellten Inhibitoren wurde darüber hinaus anhand der ermittelten LE- (engl. ligand efficiency) und LLE-Werte (engl. ligand lipophilic efficiency) beurteilt. Die günstigste Kombination aus LE und LLE wurde für Verbindung 24j (EC50 = 0.20 μM) ermittelt. Dieses Derivat zeichnet sich durch einen Phenylsubstituenten in Position2 des Tetrahydroisochinolin-Gerüsts, einen Methoxyphenylrest in Position3 und einen Pyrimidinsubstituenten am exozyklischen Amid aus. Zur Beurteilung unspezifisch toxischer Effekte wurde neben der Wirksamkeit an MM-Zellen auch der Einfluss der Tetrahydroisochinolin-Derivate auf die Viabilität von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersucht (AG Chatterjee). Während die aktivsten Carboxamide an MM-Zellen im submikromolaren Bereich wirksam waren, zeigte mit Ausnahme des phenolsubstituierten Derivats trans-24r keine der getesteten Verbindungen toxische Effekte an PBMCs (EC50 > 100 μM). Darüber hinaus legen detaillierte Westernblot-Analysen einen HSP70-spezifischen Wirkmechanismus nahe. Außerdem führte eine duale Hemmung von HSP70 und HSP90 durch gleichzeitige Inkubation mit trans-24i und NVP-AUY922 (5) zu einem additiven pro-apoptotischen Effekt bei MM-Zellen. Aufgrund der vielversprechenden In-vitro-Ergebnisse und seiner guten Löslichkeit wurde trans-39c in vivo untersucht. Zu diesem Zweck wurden zunächst die physikochemischen Parameter pKa, logP und Löslichkeit sowie die Plasma-Proteinbindung ermittelt (in Kooperation mit AG Meinel). Auf Basis einer im Anschluss durchgeführten Pharmakokinetik-Simulation wurden zwei unterschiedliche Dosierungen gewählt. Toxizitätsuntersuchungen von trans-39c zeigten keine Hämolyseaktivität und keinen Effekt auf die Viabilität von Leber- und Nierenzellen (H. Bruhn). Für die In-vivo-Studie wurde ein murines MM-Modell verwendet, das auf MOPC-315.BM-Luciferase+-Zellen basiert und eine nicht-invasive In-vivo-Bestimmung der Tumorentwicklung via Biolumineszenz ermöglicht (AG Beilhack). Über einen Zeitraum von zehn Tagen wurde zwei Gruppen mit jeweils fünf Tieren behandelt. Dazu wurde trans-39c (4 bzw. 40 μg) im Abstand von 12 h intraperitoneal appliziert. Alle Versuchstiere tolerierten die Behandlung und die mit einer Dosis von 40 μg therapierte Gruppe zeigte eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums gegenüber einer unbehandelten Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch eine im Anschluss durchgeführte Ex-vivo-Untersuchung bestätigt werden, bei der die Tumorlast in verschiedenen Knochen und Geweben ermittelt wurde. Die Tetrahydroisochinolinon-Derivate haben sich damit als ausgezeichnete Leitstruktur für die Weiterentwicklung als HSP70-Inhibitoren erwiesen und könnten in Zukunft zu einem deutlichen Fortschritt bei der Behandlung des Multiplen Myeloms beitragen. / Multiple Myeloma (MM) is generally characterized by a malignant disorder of the plasma cells within the bone marrow. Despite some progress made in treatment, it still remains incurable. Since the past years heat shock proteins (HSPs) have been established as attractive targets for new therapies. HSPs are frequently overexpressed in MM and play an important role in stabilizing multiple oncogene signaling pathways. Initially pharmaceutical companies had developed various inhibitors of HSP90, which proved to be successful in preclinical MM studies. However, in clinical therapies they just showed limited potency since the inhibition of HSP90 leads to a strong and fast HSF-1-mediated upregulation of the HSP70 expression. This response is compensating the inhibition of HSP90 and leads to an attenuation of the antitumor activity. Therefore a dual depletion of HSP90 and the HSF- 1/HSP70 system is regarded as a promising strategy for an efficient treatment of MM. The present work, established within the Clinical Research Unit 216, deals with the development of inhibitors of the HSF-1/HSP70 system. Therefore two independent strategies were implemented, i.e. an inhibition of the HSF-1 signaling pathway and the direct inhibition of HSP70. The obtained results in detail: 1) According to the HSF-1 inhibitor NZ28 (12) it was tested whether its tetrahydro- isoquinoline-scaffold can serve as a lead structure for the development of HSF-1 pathway inhibitors. Hence a series of variously substituted tetrahydroisoquinolinone derivatives was prepared. The synthesis followed a sequential Ugi-Heck reaction, as this procedure offers the opportunity to vary three substituents of the tetrahydroisoquinoline-scaffold independently and highly flexible and therefore gives access to a library of different tetrahydroisoquinolinones. However, bioactivity analysis revealed that none of the obtained compounds (26) was able to inhibit the HSF-1-mediated HSP70 expression. In order to analyze the influence of the specific substitution pattern of the products from the Ugi-Heck reaction, a variety of the tetrahydroisoquinolinones (24 and 36) synthesized as inhibitors of HSP70 were additionally tested with the HSF-1 assay. As these compounds also showed no inhibition of the signaling pathway, it is supposed that substituted tetrahydroisoquinolines are no suitable lead structures for the development of HSF-1 inhibitors. 2) In contrast to the synthesized tetrahydroisoquinolinones, several α-acylaminocarbox- amides showed an inhibition of the HSF-1-mediated HSP70 expression. These compounds were obtained as intermediates of the Ugi-Heck reaction and are characterized through a Michael system. Although no distinct structure-activity relationship could be derived with regard to individual substituents, it could be shown that the observed bioactivity is independent from the Michael system included. Thus, the activity of the α-acylamino-carboxamides is apparently not restricted to a covalent bond formed along with nucleophilic protein side chains. This reduces the potential of unspecific interactions. 3) The Ugi reaction was also performed with β-acyl-substituted acrylic acids. Making use of such carbonic acids, access to pharmacological interesting 2,5-diketopiperazines (35) was gained in just one reaction step. The products obtained showed specific anti-proliferative properties towards activated T-cells in a dose-dependent manner. Therefore they represent potential candidates for treating unwanted T cell-mediated immune responses (explored in the group of Prof. Topp). Analyzing the structure-activity relationship revealed an explicit preference for trans-configured 2,5-DKPs. Moreover, the activity of the most potent compound was of the same magnitude as the positive control 17-dimethoxyaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, 4b) 4) For the development of novel HSP70 inhibitors it was aimed to prevent the protein function by an interaction with the interdomain interface of HSP70. A corresponding Virtual Screening (performed in the group of Prof. Sotriffer) yielded the tetrahydro- isoquinolinone trans-24a as most potent compound. Initially a diastereoselective and highly flexible reaction sequence to the virtual screening hit (trans-24a) was established which was then utilized to create a library of modified compounds. By means of systemic structural modifications significant moieties were identified and furthermore detailed information for creating derivatives with higher potency important results were: - Exclusively trans-configured tetrahydroisoquinolinones are highly active against MM cells. - Carboxamides (Pos. 4) are more potent than the corresponding carbonic acid and carboxylate analogues. - The methoxy function at the phenyl substituent in pos. 3 is important for the activity, whereas its absence at the phenyl ring in pos. 2 increases the potency. - An aliphatic MeNH-group at the exocyclic amide is reducing the activity against arylamide substituents by an order of magnitude. Moreover, a tertiary dimethylcarboxamide moiety causes the complete loss of activity. To falsify the postulated binding pocket, specific derivatives bearing structural challenging substituents (tetrahydronaphthyl, phenoxyphenyl) were synthetized additionally. They should not be able to bind to the interdomain interface in the calculated binding mode. As a result the available space was in good agreement with the assumptions made upon the docking analyses. In order to prove whether the activity of the trans-compounds is induced by only one enantiomer, two representative carboxamides (24a und 24i) were subjected to an enantioseparation by means of chiral HPLC. Exclusively the R,R-compounds were active. To estimate the compounds’ permeability, the PSA values of the carboxamides (24) were calculated. With exception of the hydroxyl substituted compound 24r, the values of all other derivatives (24a-q) ranged between 65–88 Å2. Thus, the fraction of absorption is expected to be 55–90%. The lipophilicity determined by means of HPLC yielded logD- values of 1–3, complying to a well-balanced lipophilic character. The efficiency of the synthesized inhibitors was evaluated by means of the calculated ligand efficiency (LE) and lipophilic ligand efficiency (LLE). The most favorable combination of LE and LLE was found for compound 24j (EC50 = 0.20 μM). It is characterized by a phenyl substituent in position 2 of the tetrahydroisoquinoline-scaffold, a methoxyphenyl group in position 3 and a pyrimidine substituent at the exocyclic amide. In addition to the analyzed potency against MM cells, the influence of the tetrahydroisoquinolines on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was determined in order to appraise unspecific toxic effects (performed in the group of Dr. Chatterjee). While the most potent carboxamides showed activity against MM cells in a submicromolar concentration range, none of the tested compounds showed toxic effects against PBMCs (EC50 > 100 μM) with exception of the phenol substituted derivative trans-24r. Furthermore, detailed Westernblot analyses suggest a HSP70 specific mode of action. As expected the dual inhibition of HSP70 and HSP90 by means of concomitant incubation with trans-24i and NVP-AUY922 (5) yielded an additive pro-apoptotic effect against MM cells. Based on these promising in vitro results compound trans-39c was subjected to an in vivo study. For this purpose the physicochemical parameters pKa, logP and solubility were determined initially (in collaboration with the group of Prof. Meinel) as well as the degree of plasma protein binding. Pharmacokinetic simulations were the fundamental for the two different dosages selected afterwards. In order to evaluate the potential of toxicity in more detail, the compounds’ hemolysis activity and its impact on the viability of liver and kidney cells were determined by H. Bruhn. These analyses did not reveal any cytotoxic effect. The in vivo study was performed with a novel murine MM model that based on MOPC-315.BM luciferase+ cells and therefore allows the none-invasive determination of tumor growth by means of bioluminescence imaging (developed and performed in the group of Prof. Beilhack). Two groups of five animals each were treated over a period of ten days. Therefore trans-39c (4 and 40μg, respectively) was injected intraperitoneal every 12 h. The therapy was well tolerated by all animals and the group treated with the higher dose of 40μg showed a significant reduction of tumor growth compared to the untreated control group. This result could be supplemented by ex vivo analyses performed subsequently where the tumor burden in different bones and tissues was determined. Ultimately the tetrahydroisoquinolinones have been established as excellent lead structures for an advanced development as HSP70 inhibitors and may contribute to a considerable progress in treatment of Multiple Myeloma in the future.

Proteine sind dynamische makromolekulare Systeme, die nativ in verschiedenen Konfor-mationen vorliegen. Besonders Proteine mit einer ausgeprägten intrinsischen Flexibilität stellen als biologische Zielstrukturen für das computergestützte strukturbasierte Wirkstoff-design auch heute noch eine große Herausforderung dar. Die vorliegende Arbeit thematisiert die computergestützte Identifizierung neuer Liganden mit inhibitorischer Aktivität für zwei strukturell sehr flexible Enzyme, die bei verschiedenen Krankheiten eine pathophysio-logische Rolle spielen. Ein Schwerpunkt lag in diesem Zusammenhang auf der Entwicklung virtueller Screeningverfahren, die es ermöglichten, die Flexibilität der Proteine adäquat zu berücksichtigen. Der erste Teil der Arbeit beschreibt ein virtuelles Screeningverfahren für die Identifizierung von Liganden einer neuen, durch Molekulardynamik (MD) Simulationen generierten Proteinkonformation der Aldose Reduktase (AR), einem Enzym, das im Zusammenhang mit der Entstehung von Folgeerkrankungen bei Diabetes mellitus steht. Die angewandte Vorgehensweise zeigt Möglichkeiten auf, wie eine ausgeprägte Proteinflexibilität mit Hilfe computerbasierter Methoden im Rahmen eines virtuellen Screenings explizit berücksichtigt werden kann. Die Studie war auf der einen Seite hinsichtlich methodischer Aspekte von Interesse, da dadurch sowohl eine Beurteilung der Aussagekraft computergenerierter Proteinkonformationen, als auch eine Überprüfung der prinzipiellen Eignung MD-generierter Enzymkonformationen als Template für strukturbasierten Ligandendesignstudien, erfolgen konnte. Auf der anderen Seite war diese Studie aufgrund einer möglichen Erweiterung des bekannten Konformationsraumes der AR auch aus strukturbiologischer Sicht von Interesse. Bei der Suche nach geeigneten Liganden in Moleküldatenbanken kommerziell erhältlicher Verbindungen wurde eine protein- und eine ligandbasierte Strategie verfolgt. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zunächst eine vergleichende Strukturanalyse verschiedener AR-Ligand-Komplexstrukturen, um Informationen hinsichtlich experimentell aufgeklärter Bindemotive, Protein-Ligand-Interaktionen sowie bestehender struktureller Differenzen zwischen der MD-Konformation und anderen Bindetaschenkonformationen der AR zu sammeln. Anschließend wurde die Bindetasche der MD-generierten Proteinstruktur hinsichtlich günstiger Interaktionspunkte analysiert, um aus den Erkenntnissen Pharmako-phormodelle als Filter für die nachfolgenden virtuellen Datenbanksuchen zu entwickeln. Als Ergänzung zum proteinbasierten Ansatz wurde eine ligandbasierte Strategie für die Identifizierung potenzieller Kandidatenmoleküle verfolgt. Dabei diente ein bekannter AR-Inhibitor als Templatstruktur, bei dem aufgrund zuvor durchgeführter Dockingexperimente die begründete Annahme bestand, dass dieser die Bindetaschenform der MD-Proteinkonfor-mation stabilisieren könnte. Hierbei wurde zunächst eine Moleküldatenbank aus kommerziell erhältlichen Verbindungen, die alle über eine bestimmte Substruktur als Ankergruppe verfügten, aufgebaut und anschließend durch Berechnung molekularer Ähnlichkeiten zu der Templatstruktur auf mögliche Kandidatenmoleküle durchsucht. Die virtuell identifizierten Moleküle der beiden Ansätze wurden im Anschluss mit Hilfe von Dockingsimulationen in die Bindetasche der MD-generierten Proteinkonformation gedockt und die berechneten Bindeposen mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren bewertet. Im nächsten Schritt erfolgte eine Untersuchung der Selektivität der Kandidatenmoleküle anhand eines Cross-Dockingexperiments an verschiedenen Bindetaschenkonformationen der AR. Auf der Grundlage aller durch das virtuelle Screeningverfahren gesammelten Informationen wurde eine finale Molekülauswahl getroffen und sechs kommerziell verfügbare Moleküle für experimentelle Untersuchungen bezogen. Die experimentelle Bestimmung der Enzyminhibition wurde dabei von Kooperationspartnern mit Hilfe eines in vitro Assays untersucht. Aufgrund einer unzureichenden Löslichkeit von vier Substanzen unter den Assaybedingungen konnte lediglich das Inhibitionspotenzial von zwei Verbindungen untersucht werden. Eine der Verbindungen zeigte bemerkenswerterweise eine inhibitorische Aktivität im einstelligen mikromolaren Bereich. Eine finale Beurteilung, ob die Zielsetzung dieser Studie, eine neue computergenerierte Bindetaschenkonformation der AR experi-mentell zugänglich zu machen, durch die vorgeschlagenen Verbindungen erfüllt werden konnte, konnte zum Zeitpunkt der Anfertigung der Dissertation aufgrund ausstehender Kristallstrukturen der jeweiligen AR-Ligand-Komplexe nicht erfolgen und bleibt das Ziel zukünftiger Arbeiten. Die Studie zeigte jedoch deutlich, dass nicht nur experimentell aufgeklärte Proteinstrukturen sondern auch die Nutzung von mit Hilfe computerbasierter Verfahren, wie z.B. mittels MD Simulationen, berechneter Proteinkonformationen als Templatstrukturen für die Identifi-zierung neuer Liganden hilfreich sein kann und daher deren Verwendung für diese Zielsetzung ihre Berechtigung hat. Der zweite Teil der Arbeit handelt von der computergestützten Identifizierung nieder-molekularer Liganden einer neuen potenziellen Bindestelle der biologischen Zielstruktur Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren. Hsp70 spielt eine pathophysiologische Rolle bei verschiedenen Krebserkrankungen sowie diversen weiteren Erkrankungen, wie z.B. neurodegenerativen Erkrankungen und Infektions-krankheiten. Bei der neuen potenziellen Bindestelle, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit näher untersucht wurde, handelte es sich um das Interdomäneninterface, der Schnittstelle zwischen der Nukleotid- und Substratbindedomäne von Hsp70. Zum Zeitpunkt der Arbeit waren keine Liganden dieser Proteinregion in der Literatur beschrieben, weshalb es zunächst galt, die Hypothese der Adressierbarkeit dieser Zielregion durch niedermolekulare Liganden zu verifizieren. Hierfür wurde ein virtuelles Screening durchgeführt, bei dem protein- sowie ligandbasierte Suchstrategien zum Einsatz kamen. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zunächst eine Analyse der Hsp70 Tertiär-struktur auf potenziell vorhandene Ligandenbindestellen. Im Anschluss wurde das Interdomäneninterface auf günstige Interaktionspunkte für bestimmte Atomtypen und funktionelle Gruppen zukünftiger Liganden untersucht. Basierend auf diesen Informationen wurde ein Pharmakophormodell als Filter für nachfolgende virtuelle Datenbanksuchen entwickelt. Bei dem ligandbasierten Ansatz fungierte der bekannte Hsp70-Ligand Apoptozol als Templatstruktur für die virtuelle Datenbanksuche, da die Ergebnisse eines vorab durchge-führten Cross-Dockingexperiments deutlich auf eine Bindung des Moleküls an das Interdomäneninterface hinwiesen. Diese Dockingstudie lieferte erste wertvolle Hinweise hinsichtlich der Bindestelle und potenzieller Bindemodi des Moleküls an Hsp70. Im Anschluss an die virtuellen Datenbanksuchen wurden die identifizierten Kandidaten-moleküle hinsichtlich möglicher Bindemodi und Bindungsaffinitäten mittels Docking-simulationen in Verbindung mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren untersucht. Abschließend wurden neun ausgewählte Kandidatenmoleküle von kommerziellen Anbietern bezogen und mit Hilfe von in vitro Assays von Kooperationspartnern innerhalb der Klinischen Forschergruppe 216 auf ihre zytotoxische Aktivität gegenüber Multiplen Myelomzellen untersucht. Dabei konnte für fünf der neun getesteten Verbindungen bereits bei Konzentrationen im ein- bzw. zweistelligen mikromolaren Bereich eine Aktivität gemessen werden, was einer formalen Trefferquote von 56% entspricht. Weiterhin wurde und wird in Folgearbeiten von Kooperationspartnern versucht, eine Bindung der ausgewählten Kandidatenmoleküle an Hsp70 näher zu charakterisieren und sowohl am separierten Protein, als auch in der Targetzelle nachzuweisen. Darüber hinaus wurde zusätzlich ein fragmentbasierter Ansatz, basierend auf einer bestimmten Substruktur, die als eine Art Ankergruppe fungieren sollte, verfolgt. Dabei diente bei der virtuellen Suche in Moleküldatenbanken kommerzieller Anbieter ein Molekülfragment als Suchanfrage. Aus dem identifizierten Molekülsatz wurden Verbindungen unterschied-lichster struktureller Klassen für nachfolgende Dockingexperimente ausgewählt. Die berechneten Bindeposen wurden einem Re-Scoringverfahren für eine zusätzliche Abschätzung der Bindungsaffinität unterzogen. Schließlich wurden die fünf vielver-sprechendsten Verbindungen für nachfolgende experimentelle Untersuchungen kommerziell bezogen. Die Ergebnisse der nachfolgenden röntgenkristallographischen Aufklärung der Protein-Ligand-Komplexe lagen bei der Anfertigung der vorliegenden Dissertation noch nicht abschließend vor und sind Bestandteil aktueller Forschungarbeiten. Mit den durchgeführten virtuellen Screeningverfahren konnten erstmals potenzielle Liganden des Hsp70-Interdomäneninterfaces als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren identifiziert werden. Weiterhin können die identifizierten, zytotoxisch aktiven Verbindungen als Leitstrukturen zukünftiger Inhibitordesignstudien dienen, mit dem Ziel sowohl die Zytotoxizität dieser Moleküle zu optimieren, als auch Struktur-Wirkungsbeziehungen für die Entwicklung von Inhibitoren mit verbesserten biologischen Aktivitätsprofilen abzuleiten. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der computerbasierten Charakterisierung der Proteinflexibilität von Hsp70 mit Hilfe von MD Simulationen. In diesem Zusammenhang erfolgte eine Untersuchung intrinsischer Proteinbewegungen sowie des Konformations-raumes anhand von verschiedenen Hsp70-Enzymstrukturen. Die durchgeführten MD Simulationen waren zum Zeitpunkt der Arbeit die ersten Untersuchungen dieser Art, die nicht nur an einer einzelnen Domäne, sondern an ganzen Zweidomänenstrukturen von Hsp70 erfolgten. Die generierten Trajektorien bestätigten die überdurchschnittlich hohe Flexibilität der Zielstruktur Hsp70. Die im Rahmen der Studie identifizierten, zum Zeitpunkt der Arbeit noch nicht beschriebenen Proteinkonformere erweiterten das Spektrum der bekannten Hsp70-Proteinkonformationen erheblich und lieferten mögliche Enzymkonformationen, die als Templatstrukturen für zukünftige strukturbasierte Wirkstoffdesignstudien dienen können. Darüber hinaus stützten die Beobachtungen die Hypothese der prinzipiellen Eignung des Interdomäneninterfaces von Hsp70 als eine Bindestelle für neue Inhibitoren. Auf der Grundlage der gewonnenen Informationen war es weiterhin möglich, eine erste Hypothese hinsichtlich eines potenziellen inhibitorischen Wirkmechanismus der Liganden des Interdomäneninterfaces zu formulieren. Abschließend lässt sich festhalten, dass durch die vorliegende Arbeit viele neue strukturbiologische Erkenntnisse über Hsp70 gewonnen wurden. Dennoch besteht weiterer Forschungsbedarf, um die Strukturbiologie von Hsp70 umfassend aufzuklären. Möglicher-weise können in zukünftigen Studien Enzymstrukturen aufgeklärt werden, die die Existenz der in silico erzeugten und in der Arbeit beschriebenen Proteinkonformere bestätigen. / Proteins are dynamic macromolecular systems, natively existing in different conformations. Particularly proteins with a marked intrinsic flexibility serving as biological targets issue a challenge to computational structure-based drug design even today. This thesis addresses the computer-aided identification of new inhibitors of two structurally highly flexible enzymes which are playing a pathophysiological role in different diseases. Thus, the focus was on the development of virtual screenings that enable considering the protein flexibility adequately. The first part of this thesis describes a virtual screening aiming to identify ligands of a new protein conformation of aldose reductase (AR) that was generated by molecular dynamics (MD) simulations. AR is an enzyme that is related to secondary diseases of diabetes mellitus. The conducted strategy reveals possibilities how pronounced protein flexibility can explicitly be considered by computer-based methods within the scope of a virtual screening. On the one hand, the study was of special interest because of methodical aspects as both an assessment of the significance of computer-generated protein conformations and an examination of the suitability of MD-generated enzyme conformations as templates for structure-based ligand design studies could be made. On the other hand, the study was of interest with regard to structural biology due to a possible expansion of the known conformational space of the enzyme. The identification of suitable ligands out of a database of commercially available compounds was performed with the help of a protein-based as well as a ligand-based approach. During the protein-based approach a comparative structural analysis of different AR-ligand complexes was first done to collect information about experimentally elucidated binding motives, protein-ligand interactions and existing structural differences between the MD-conformation and other existing AR-binding pocket conformations. Afterwards, the binding pocket of the MD-generated protein structure was analysed with regard to favoured interaction sites. These findings served as basis for the development of pharmacophore models serving as a filter in subsequent in silico database screenings. In addition to the protein-based approach a ligand-based strategy was followed to identify potential candidate molecules. A well-known inhibitor of AR served as template structure. Based on previously conducted docking experiments one may assume that this compound might be able to stabilise the binding pocket of the MD-conformation. Consequently, a database of commercially available compounds all containing a certain substructure as anchor group was generated and feasible candidate molecules were searched via calculation of molecular similarities between database molecules and the template structure. All identified compounds were subsequently docked into the binding pocket of the MD-generated protein conformation and predicted binding poses were assessed by a re- and consensus scoring procedure. In the next step selectivity investigations at different AR binding pocket conformations were performed on the basis of a cross-docking experiment. In accordance with all information received during the virtual screening process a final compound selection was made and six commercially available molecules were ordered for further experimental analyses. These experiments were performed by cooperation partners using a well established in vitro assay. As a result of an insufficient solubility of four compounds under the assay conditions, the inhibitory potency of only two molecules could be determined. Remarkably, one compound showed an inhibitory activity at a one-digit micromolar concentration. However, as crystal structures of the particular AR-ligand complexes were pending at the time of preparing the thesis, it was not possible to finally conclude whether the purpose of this study to make a new computationally generated binding pocket conformation of AR experimentally accessible could be achieved. This task remains the aim of future projects. The study clearly demonstrated that not only the use of experimentally elucidated protein structures as template structures can be useful for the identification of new ligands but also the use of structures generated by computer-based procedures like MD simulations. The second part of this thesis is about the computer-aided identification of small ligands of a new potential binding site of the biological target heat shock protein 70 (Hsp70), as a novel Hsp70 inhibitor class. Hsp70 plays a pathophysiological role in different cancer diseases and other diseases such as neuro-degenerative disorders and infectious diseases. The interdomain interface between the nucleotide and the substrate binding domain of Hsp70 represents the new potential binding site and was comprehensively investigated as part of the present thesis. At the time of the study no ligand of this protein region was described in the literature. Thus, the hypothesis whether the target site represents an addressable binding site was needed to be proven by small ligands. For this purpose a virtual screening was conducted by using both protein- and ligand-based search strategies. During the protein-based approach, the tertiary structure of Hsp70 was analysed with regard to potentially existing ligand binding sites. Subsequently, the interdomain interface was scanned to identify favourable interaction sites of specific atom types and functional groups of future ligands. Based on the gathered information a pharmacophore model was developed, serving as a query in following in silico database screenings. The known Hsp70 ligand Apoptozol was of use as template structure for virtual database screenings as results of a previously performed cross-docking experiment indicated that the molecule binds to the interdomain interface. The study provided initial valuable hints about the binding site and potential binding modes of the molecule at Hsp70. After database screenings the identified candidate molecules were tested with regard to their possible binding modes and binding affinities by docking simulations combined with a re- and a consensus scoring procedure. Finally, nine selected compounds were purchased from commercial suppliers and their cytotoxic activity towards multiple myeloma cells was tested in an in vitro assay by cooperation partners of the clinical research group 216. Thereby, five out of nine tested compounds showed a cytotxic activity at one- to two-digit micromolar concentrations, resulting in a formal hit rate of 56%. Ongoing research projects are being made to further characterise the binding of the chosen molecules to Hsp70 and to verify the binding to both the isolated protein and the protein inside the target cells. Furthermore, a fragment-based approach was followed based on a specific substructure that might be serving as an anchor group for a targeted binding to the interdomain interface. A molecular fragment served as query during the virtual search in several compound databases of commercial suppliers. Out of the resulting molecule collection, only members of different, most diverse structural classes were chosen for subsequent docking experiments. As a next step, the calculated binding poses were submitted to a re-scoring procedure to verify the particular binding affinities. Finally, the five most promising compounds were purchased for further experimental analyses. The results of the X-ray crystallography to determine the respective protein-ligand complexes were not finally available at the time of preparing the present thesis and related experiments are still the subject of current research work. With the performed virtual screenings it was possible for the first time to identify potential ligands of the Hsp70 interdomain interfaces as a novel class of Hsp70 inhibitors. Further on, the identified, cytotoxic active compounds might serve as lead structures in future inhibitor design studies that aim to optimise the cytoxicity of these molecules as well as to deduce structure-activity relationships from ligand series for the development of inhibitors that have more favourable biological activity profiles. Another emphasis of the thesis was on the computer-based characterisation of the protein flexibility of Hsp70 with the help of MD simulations. In this context an analysis of intrinsic protein dynamics together with the conformational space was done on the basis of different Hsp70 enzyme structures. At the time of the work, the conducted MD simulations were the first of this type which addressed Hsp70 two-domain-structures instead of structures of separated protein domains. Thus, this thesis provided initial insights into potential intrinsic protein movements. The evaluation of the generated trajectories confirmed the high flexibility of Hsp70. Thereby, at the time of the study so far unknown protein conformations could be identified that considerably expanded the spectrum of known Hsp70 protein conformations and proposed possible enzyme conformations that might be used as template structures for future structure-based drug design studies. Furthermore, the observations supported the hypothesis that the Hsp70 interdomain interface may principally be suitable as a binding site for new inhibitors. In the light of all this information, it was possible to postulate a first hypothesis about a potential mechanism of action of an enzyme inhibition by ligands of the interdomain interface. In summary, the present thesis revealed various aspects with regard to the structural biological elucidation of Hsp70. Nevertheless, structural analyses of Hsp70 will be ongoing in the future. It might be possible that in future studies enzyme structures will be identified that confirm the existence of the in silico generated protein conformers, described in the present thesis.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Tübingen, Univ., Diss., 2002.