Introdução: A homocistinúria clássica (HCU) é uma doença genética causada pela atividade deficiente da enzima cistationina β-sintase (CβS). Bioquimicamente, é caracterizada por distúrbios no metabolismo dos aminoácidos sulfurados (SAA), com elevação plasmática de homocisteína e metionina e redução de cistationina e cisteína. Clinicamente afeta principalmente os sistemas ocular, vascular, nervoso central e ósseo. O tratamento inclui dieta pobre em metionina e fórmula metabólica, doses farmacológicas de piridoxina (co-fator da CβS) e betaína; e suplementação com ácido fólico e vitamina B12. Pacientes que respondem à piridoxina geralmente apresentam fenótipos mais brandos. No Brasil, o perfil clínico e genético dos pacientes com a doença é pouco conhecido. Evidências recentes sugerem que os SAA, especialmente a cisteína, têm influência também no metabolismo lipídico e na composição corporal. Estas alterações parecem estar ligadas à supressão hepática da SCD-1 (estearoil-CoA desaturase-1), enzima chave na síntese de ácidos graxos monoinsaturados. Redução de massa adiposa e da expressão da SCD-1 hepática são descritas em camundongos com deficiência de CβS não tratados, mas este fenótipo é revertido com o tratamento. Estas alterações metabólicas ainda não foram estudadas em pacientes com HCU. Objetivos: 1) Descrever o perfil clínico e genético de pacientes brasileiros com HCU; e 2) Avaliar a relação entre SAA, composição corporal, atividade da SCD-1, resistência insulínica e metabolismo lipídico em pacientes com HCU em tratamento. Métodos: Estudo transversal. Dados clínicos de 66 pacientes (57 famílias) provenientes das 5 regiões do país (sul n=12, sudeste n=35, nordeste n=8, norte n=1 e centro-oeste n=1) foram analisados. Amostras de sangue de 30 pacientes não relacionados foram enviadas e o DNA genômico foi isolado para sequenciamento do gene CBS. Amostras de RNA de 6 pacientes foram coletadas para análise de expressão gênica por qRT-PCR. Estudos de expressão em E.coli foram realizados para três mutações nunca descritas. Para investigação de alterações na composição corporal e metabolismo lipídico, dois estudos foram conduzidos. No primeiro, composição corporal foi avaliada por bioimpedância elétrica (BIA) em 9 pacientes e 18 controles; e níveis plasmáticos de metionina, homocisteína total, cisteína, colina, betaína, dimetilglicina e etanolamina foram determinados nos pacientes. No segundo estudo, 11 pacientes e 16 controles foram avaliados. Composição corporal foi avaliada por Dual X-ray Absorptiometry (DXA). Os compostos sulfurados metionina, S-adenosilmetionina, S-adenosilhomocisteína, homocisteína total, cisteína e glutationa; além de lipoproteínas, ácidos graxos livres, acilcarnitinas, leptina, adiponectina, isoprostanos, glicose e insulina foram medidos em plasma. Resistência insulínica foi determinada por HOMA-IR. Os índices SCD-16 e SCD-18, que estimam a atividade hepática da SCD-1 em humanos, foram calculados através das razões produto/precursor dos ácidos graxos correspondentes. Resultados: A análise de dados clínicos revelou predominância de não responsividade à piridoxina (82%). A mediana de idade atual foi de 19 anos (mín: 5; máx: 45 anos) ao diagnóstico, de 10 anos (mín: 1; máx: 39 anos); e ao primeiro sintoma, de 5 anos (mín: 0; máx: 20 anos). As manifestações oculares foram os sintomas mais precoces, o principal motivo da suspeita diagnóstica e a manifestação mais prevalente ao diagnóstico (69% dos casos). Apenas 28% dos pacientes em tratamento tinham homocisteína total <60 μmol/L. Quanto às estratégias de tratamento, 89% dos pacientes utilizavam ácido fólico e piridoxina, 76% betaína, 32% vitamina B12 e 26% e dieta pobre em metionina com fórmula metabólica. O sequenciamento do gene CBS revelou 21 mutações diferentes, sendo as mais prevalentes: p.Ile278Thr (18,2% dos alelos), p.Thr191Met (11,3%), r.[737_828del92, 828_931ins104] (11,3%) e p.Trp323Ter (11,3%). Oito novas mutações foram encontradas. As atividades enzimáticas expressas em E.coli foram de: 1,5% para a mutação c.329A>T; 17,5% para a c.284T>C e 206% para a c.2T>C. A análise de qRT-PCR revelou redução de expressão gênica (54-95%) em todos os pacientes avaliados. Não houve diferença no percentual de gordura em ambos os métodos utilizados para avaliação da composição corporal. Já a massa magra foi menor nos pacientes na avaliação por DXA (p=0,008). Leptina plasmática, colesterol LDL e índice SCD-16 foram significativamente mais baixos nos pacientes (p<0,05). Lipoproteínas apresentaram associações com colina, etanolamina e leptina nos pacientes. Cisteína foi significativamente mais baixa nos pacientes e apresentou correlação positiva com IMC (r=0,912, p=0,001), e tendência de associação com o índice SCD-16 (r=0,624, p=0,054). Não houve diferença nos demais parâmetros avaliados. Conclusões: este estudo traz o panorama clínico e genético mais abrangente da HCU já realizado no Brasil. Observa-se que a maioria dos pacientes apresenta fenótipo grave, o que sugere subdiagnóstico das formas atenuadas/responsivas de HCU. Uma grande variabilidade alélica foi observada, mas as quatro mutações mais prevalentes são responsáveis por mais da metade dos alelos mutados. A redução de leptina, SCD-1 e colesterol LDL, e suas associações com os SAA, corroboram estudos observacionais e experimentais prévios que apontam para um papel destes aminoácidos (em especial a cisteína), na modulação do metabolismo lipídico. / Introduction: Classical homocystinuria (HCU) is a genetic disease caused by cystathionine β-synthase (CβS) deficiency. Biochemically, it is characterized by disrupted metabolism of sulfur amino acids (SAA), with elevated homocysteine and methionine and decreased cystathionine and cysteine in plasma. Clinical signs are mainly related to ocular, vascular, central nervous and skeletal systems. Treatment includes a methionine-restricted diet + metabolic formula, pharmacologically high doses of pyridoxine (cofactor of CβS) and betaine, and supplementation with folic acid and vitamin B12. Usually, patients responsive to pyridoxine present milder phenotypes. In Brazil, little is known about the clinical and genetic profile of patients diagnosed with HCU. Interestingly, recent evidence suggests that SAA, especially cysteine, modulate lipid metabolism and body composition. These changes appear to be linked to the suppression of liver SCD-1 (stearoyl-CoA desaturase-1), a key enzyme for the synthesis of monounsaturated fatty acids. Reduced fat mass and low expression of liver SCD-1 are described in HCU mice, and treatment reverses this phenotype. This phenomenon has not been studied in patients with HCU yet. Objectives: 1) to describe the clinical and genetic profile of Brazilian patients with HCU; and 2) to assess the relationship between SAA, body composition, SCD-1 activity, insulin resistance, and lipid metabolism in treated patients with HCU. Methods: A cross-sectional study was conducted. Clinical data of 66 patients (57 families) from 5 regions of Brazil (south n=12, southeast n=35, northeast n=8, north n=1, and mid-west n=1) were analyzed. Blood samples from 30 unrelated patients were collected and DNA was isolated and the CBS gene sequenced. RNA samples from 6 patients were collected and gene expression was analysed by qRT-PCR. Expression studies in E.coli of three novel mutations were performed. To study body composition and lipid metabolism, two studies were conducted. In the first, body composition was assessed by bioelectrical impedance analysis (BIA) in 9 patients and 18 controls; and plasma levels of methionine, total homocysteine, cysteine, choline, betaine, dimethylglycine, and ethanolamine were measured in patients. In the second study, 11 patients and 16 controls were evaluated. Body composition was assessed by Dual X-ray Absorptiometry (DXA). The sulfur compounds methionine, S-adenosylmethionine, S-adenosylhomocysteine, total homocysteine, cysteine, and glutathione; besides lipoproteins, free fatty acids, acylcarnitines, leptin, adiponectin, isoprostanes, glucose, and insulin were measured in plasma. Insulin resistance was determined by HOMA-IR. SCD-16 and SCD-18 indices, which estimate liver SCD-1 activity in humans, were calculated by product/precursor ratios of the corresponding fatty acids. Results: Clinical data analysis showed a high prevalence of nonresponsive patients (82%). Patients had a median age at evaluation of 19 years (range: 5-45 years); at diagnosis: 10 years (range: 1- 39 years); and first symptoms at the age of 5 years (range: 0-20 years). Eye manifestations were the earliest symptoms, the main reason for diagnostic suspicion, and the most prevalent symptom at diagnosis (69% of the cases). Only 28% of the treated patients had total homocysteine <60 μmol/L. Regarding treatment strategies, 89% of the patients used folic acid and pyridoxine, 76% betaine, 32% vitamin B12, and 26% methionine-restricted diet + formula. CBS sequencing revealed 21 distinct mutations, among which the most prevalent are: p.Ile278Thr (18.2%), p.Thr191Met (11.3%), r [737_828del92, 828_931ins104] (11.3%), and p.Trp323Ter (11.3%). Eight new mutations were found. Enzymatic activities expressed in E.coli were: 1.5% of normal for c.329A>T mutation; 17.5% for c.284T>C, and 206% for c.2T>C. qRT-PCR analysis showed reduced gene expression (54-95%) in all patients studied. Body composition analysis showed no difference in adiposity between patients and controls. However, lean mass was lower in patients according to DXA assessment (p = 0.008). Plasma leptin levels, LDL cholesterol, and SCD-16 index were significantly reduced in patients (p <0.05). Lipoproteins showed associations with choline, ethanolamine, and leptin levels in patients. Cysteine was significantly lower in patients, and positively correlated with BMI (r = 0.912, p = 0.001), and with SCD-16 index (r = 0.624, p = 0.054). No differences were observed for the remaining variables. Conclusions: This study provides the most comprehensive clinical and genetic profile of HCU ever held in Brazil. Most of the patients studied here presented a severe phenotype, suggesting underdiagnosis of milder/responsive types of HCU. A great number of private mutations was observed, but the four most prevalent mutations account for more than half of the mutated alleles. Low leptin, SCD-1 and cholesterol, and their association with SAA, are in agreement with previous observational and experimental studies that show that SAA (mainly cysteine) have an important role in the modulation of lipid metabolism.

Introdução: A homocistinúria clássica (HCU) é uma doença genética causada pela atividade deficiente da enzima cistationina β-sintase (CβS). Bioquimicamente, é caracterizada por distúrbios no metabolismo dos aminoácidos sulfurados (SAA), com elevação plasmática de homocisteína e metionina e redução de cistationina e cisteína. Clinicamente afeta principalmente os sistemas ocular, vascular, nervoso central e ósseo. O tratamento inclui dieta pobre em metionina e fórmula metabólica, doses farmacológicas de piridoxina (co-fator da CβS) e betaína; e suplementação com ácido fólico e vitamina B12. Pacientes que respondem à piridoxina geralmente apresentam fenótipos mais brandos. No Brasil, o perfil clínico e genético dos pacientes com a doença é pouco conhecido. Evidências recentes sugerem que os SAA, especialmente a cisteína, têm influência também no metabolismo lipídico e na composição corporal. Estas alterações parecem estar ligadas à supressão hepática da SCD-1 (estearoil-CoA desaturase-1), enzima chave na síntese de ácidos graxos monoinsaturados. Redução de massa adiposa e da expressão da SCD-1 hepática são descritas em camundongos com deficiência de CβS não tratados, mas este fenótipo é revertido com o tratamento. Estas alterações metabólicas ainda não foram estudadas em pacientes com HCU. Objetivos: 1) Descrever o perfil clínico e genético de pacientes brasileiros com HCU; e 2) Avaliar a relação entre SAA, composição corporal, atividade da SCD-1, resistência insulínica e metabolismo lipídico em pacientes com HCU em tratamento. Métodos: Estudo transversal. Dados clínicos de 66 pacientes (57 famílias) provenientes das 5 regiões do país (sul n=12, sudeste n=35, nordeste n=8, norte n=1 e centro-oeste n=1) foram analisados. Amostras de sangue de 30 pacientes não relacionados foram enviadas e o DNA genômico foi isolado para sequenciamento do gene CBS. Amostras de RNA de 6 pacientes foram coletadas para análise de expressão gênica por qRT-PCR. Estudos de expressão em E.coli foram realizados para três mutações nunca descritas. Para investigação de alterações na composição corporal e metabolismo lipídico, dois estudos foram conduzidos. No primeiro, composição corporal foi avaliada por bioimpedância elétrica (BIA) em 9 pacientes e 18 controles; e níveis plasmáticos de metionina, homocisteína total, cisteína, colina, betaína, dimetilglicina e etanolamina foram determinados nos pacientes. No segundo estudo, 11 pacientes e 16 controles foram avaliados. Composição corporal foi avaliada por Dual X-ray Absorptiometry (DXA). Os compostos sulfurados metionina, S-adenosilmetionina, S-adenosilhomocisteína, homocisteína total, cisteína e glutationa; além de lipoproteínas, ácidos graxos livres, acilcarnitinas, leptina, adiponectina, isoprostanos, glicose e insulina foram medidos em plasma. Resistência insulínica foi determinada por HOMA-IR. Os índices SCD-16 e SCD-18, que estimam a atividade hepática da SCD-1 em humanos, foram calculados através das razões produto/precursor dos ácidos graxos correspondentes. Resultados: A análise de dados clínicos revelou predominância de não responsividade à piridoxina (82%). A mediana de idade atual foi de 19 anos (mín: 5; máx: 45 anos) ao diagnóstico, de 10 anos (mín: 1; máx: 39 anos); e ao primeiro sintoma, de 5 anos (mín: 0; máx: 20 anos). As manifestações oculares foram os sintomas mais precoces, o principal motivo da suspeita diagnóstica e a manifestação mais prevalente ao diagnóstico (69% dos casos). Apenas 28% dos pacientes em tratamento tinham homocisteína total <60 μmol/L. Quanto às estratégias de tratamento, 89% dos pacientes utilizavam ácido fólico e piridoxina, 76% betaína, 32% vitamina B12 e 26% e dieta pobre em metionina com fórmula metabólica. O sequenciamento do gene CBS revelou 21 mutações diferentes, sendo as mais prevalentes: p.Ile278Thr (18,2% dos alelos), p.Thr191Met (11,3%), r.[737_828del92, 828_931ins104] (11,3%) e p.Trp323Ter (11,3%). Oito novas mutações foram encontradas. As atividades enzimáticas expressas em E.coli foram de: 1,5% para a mutação c.329A>T; 17,5% para a c.284T>C e 206% para a c.2T>C. A análise de qRT-PCR revelou redução de expressão gênica (54-95%) em todos os pacientes avaliados. Não houve diferença no percentual de gordura em ambos os métodos utilizados para avaliação da composição corporal. Já a massa magra foi menor nos pacientes na avaliação por DXA (p=0,008). Leptina plasmática, colesterol LDL e índice SCD-16 foram significativamente mais baixos nos pacientes (p<0,05). Lipoproteínas apresentaram associações com colina, etanolamina e leptina nos pacientes. Cisteína foi significativamente mais baixa nos pacientes e apresentou correlação positiva com IMC (r=0,912, p=0,001), e tendência de associação com o índice SCD-16 (r=0,624, p=0,054). Não houve diferença nos demais parâmetros avaliados. Conclusões: este estudo traz o panorama clínico e genético mais abrangente da HCU já realizado no Brasil. Observa-se que a maioria dos pacientes apresenta fenótipo grave, o que sugere subdiagnóstico das formas atenuadas/responsivas de HCU. Uma grande variabilidade alélica foi observada, mas as quatro mutações mais prevalentes são responsáveis por mais da metade dos alelos mutados. A redução de leptina, SCD-1 e colesterol LDL, e suas associações com os SAA, corroboram estudos observacionais e experimentais prévios que apontam para um papel destes aminoácidos (em especial a cisteína), na modulação do metabolismo lipídico. / Introduction: Classical homocystinuria (HCU) is a genetic disease caused by cystathionine β-synthase (CβS) deficiency. Biochemically, it is characterized by disrupted metabolism of sulfur amino acids (SAA), with elevated homocysteine and methionine and decreased cystathionine and cysteine in plasma. Clinical signs are mainly related to ocular, vascular, central nervous and skeletal systems. Treatment includes a methionine-restricted diet + metabolic formula, pharmacologically high doses of pyridoxine (cofactor of CβS) and betaine, and supplementation with folic acid and vitamin B12. Usually, patients responsive to pyridoxine present milder phenotypes. In Brazil, little is known about the clinical and genetic profile of patients diagnosed with HCU. Interestingly, recent evidence suggests that SAA, especially cysteine, modulate lipid metabolism and body composition. These changes appear to be linked to the suppression of liver SCD-1 (stearoyl-CoA desaturase-1), a key enzyme for the synthesis of monounsaturated fatty acids. Reduced fat mass and low expression of liver SCD-1 are described in HCU mice, and treatment reverses this phenotype. This phenomenon has not been studied in patients with HCU yet. Objectives: 1) to describe the clinical and genetic profile of Brazilian patients with HCU; and 2) to assess the relationship between SAA, body composition, SCD-1 activity, insulin resistance, and lipid metabolism in treated patients with HCU. Methods: A cross-sectional study was conducted. Clinical data of 66 patients (57 families) from 5 regions of Brazil (south n=12, southeast n=35, northeast n=8, north n=1, and mid-west n=1) were analyzed. Blood samples from 30 unrelated patients were collected and DNA was isolated and the CBS gene sequenced. RNA samples from 6 patients were collected and gene expression was analysed by qRT-PCR. Expression studies in E.coli of three novel mutations were performed. To study body composition and lipid metabolism, two studies were conducted. In the first, body composition was assessed by bioelectrical impedance analysis (BIA) in 9 patients and 18 controls; and plasma levels of methionine, total homocysteine, cysteine, choline, betaine, dimethylglycine, and ethanolamine were measured in patients. In the second study, 11 patients and 16 controls were evaluated. Body composition was assessed by Dual X-ray Absorptiometry (DXA). The sulfur compounds methionine, S-adenosylmethionine, S-adenosylhomocysteine, total homocysteine, cysteine, and glutathione; besides lipoproteins, free fatty acids, acylcarnitines, leptin, adiponectin, isoprostanes, glucose, and insulin were measured in plasma. Insulin resistance was determined by HOMA-IR. SCD-16 and SCD-18 indices, which estimate liver SCD-1 activity in humans, were calculated by product/precursor ratios of the corresponding fatty acids. Results: Clinical data analysis showed a high prevalence of nonresponsive patients (82%). Patients had a median age at evaluation of 19 years (range: 5-45 years); at diagnosis: 10 years (range: 1- 39 years); and first symptoms at the age of 5 years (range: 0-20 years). Eye manifestations were the earliest symptoms, the main reason for diagnostic suspicion, and the most prevalent symptom at diagnosis (69% of the cases). Only 28% of the treated patients had total homocysteine <60 μmol/L. Regarding treatment strategies, 89% of the patients used folic acid and pyridoxine, 76% betaine, 32% vitamin B12, and 26% methionine-restricted diet + formula. CBS sequencing revealed 21 distinct mutations, among which the most prevalent are: p.Ile278Thr (18.2%), p.Thr191Met (11.3%), r [737_828del92, 828_931ins104] (11.3%), and p.Trp323Ter (11.3%). Eight new mutations were found. Enzymatic activities expressed in E.coli were: 1.5% of normal for c.329A>T mutation; 17.5% for c.284T>C, and 206% for c.2T>C. qRT-PCR analysis showed reduced gene expression (54-95%) in all patients studied. Body composition analysis showed no difference in adiposity between patients and controls. However, lean mass was lower in patients according to DXA assessment (p = 0.008). Plasma leptin levels, LDL cholesterol, and SCD-16 index were significantly reduced in patients (p <0.05). Lipoproteins showed associations with choline, ethanolamine, and leptin levels in patients. Cysteine was significantly lower in patients, and positively correlated with BMI (r = 0.912, p = 0.001), and with SCD-16 index (r = 0.624, p = 0.054). No differences were observed for the remaining variables. Conclusions: This study provides the most comprehensive clinical and genetic profile of HCU ever held in Brazil. Most of the patients studied here presented a severe phenotype, suggesting underdiagnosis of milder/responsive types of HCU. A great number of private mutations was observed, but the four most prevalent mutations account for more than half of the mutated alleles. Low leptin, SCD-1 and cholesterol, and their association with SAA, are in agreement with previous observational and experimental studies that show that SAA (mainly cysteine) have an important role in the modulation of lipid metabolism.

Introdução: A homocistinúria clássica (HCU) é uma doença genética causada pela atividade deficiente da enzima cistationina β-sintase (CβS). Bioquimicamente, é caracterizada por distúrbios no metabolismo dos aminoácidos sulfurados (SAA), com elevação plasmática de homocisteína e metionina e redução de cistationina e cisteína. Clinicamente afeta principalmente os sistemas ocular, vascular, nervoso central e ósseo. O tratamento inclui dieta pobre em metionina e fórmula metabólica, doses farmacológicas de piridoxina (co-fator da CβS) e betaína; e suplementação com ácido fólico e vitamina B12. Pacientes que respondem à piridoxina geralmente apresentam fenótipos mais brandos. No Brasil, o perfil clínico e genético dos pacientes com a doença é pouco conhecido. Evidências recentes sugerem que os SAA, especialmente a cisteína, têm influência também no metabolismo lipídico e na composição corporal. Estas alterações parecem estar ligadas à supressão hepática da SCD-1 (estearoil-CoA desaturase-1), enzima chave na síntese de ácidos graxos monoinsaturados. Redução de massa adiposa e da expressão da SCD-1 hepática são descritas em camundongos com deficiência de CβS não tratados, mas este fenótipo é revertido com o tratamento. Estas alterações metabólicas ainda não foram estudadas em pacientes com HCU. Objetivos: 1) Descrever o perfil clínico e genético de pacientes brasileiros com HCU; e 2) Avaliar a relação entre SAA, composição corporal, atividade da SCD-1, resistência insulínica e metabolismo lipídico em pacientes com HCU em tratamento. Métodos: Estudo transversal. Dados clínicos de 66 pacientes (57 famílias) provenientes das 5 regiões do país (sul n=12, sudeste n=35, nordeste n=8, norte n=1 e centro-oeste n=1) foram analisados. Amostras de sangue de 30 pacientes não relacionados foram enviadas e o DNA genômico foi isolado para sequenciamento do gene CBS. Amostras de RNA de 6 pacientes foram coletadas para análise de expressão gênica por qRT-PCR. Estudos de expressão em E.coli foram realizados para três mutações nunca descritas. Para investigação de alterações na composição corporal e metabolismo lipídico, dois estudos foram conduzidos. No primeiro, composição corporal foi avaliada por bioimpedância elétrica (BIA) em 9 pacientes e 18 controles; e níveis plasmáticos de metionina, homocisteína total, cisteína, colina, betaína, dimetilglicina e etanolamina foram determinados nos pacientes. No segundo estudo, 11 pacientes e 16 controles foram avaliados. Composição corporal foi avaliada por Dual X-ray Absorptiometry (DXA). Os compostos sulfurados metionina, S-adenosilmetionina, S-adenosilhomocisteína, homocisteína total, cisteína e glutationa; além de lipoproteínas, ácidos graxos livres, acilcarnitinas, leptina, adiponectina, isoprostanos, glicose e insulina foram medidos em plasma. Resistência insulínica foi determinada por HOMA-IR. Os índices SCD-16 e SCD-18, que estimam a atividade hepática da SCD-1 em humanos, foram calculados através das razões produto/precursor dos ácidos graxos correspondentes. Resultados: A análise de dados clínicos revelou predominância de não responsividade à piridoxina (82%). A mediana de idade atual foi de 19 anos (mín: 5; máx: 45 anos) ao diagnóstico, de 10 anos (mín: 1; máx: 39 anos); e ao primeiro sintoma, de 5 anos (mín: 0; máx: 20 anos). As manifestações oculares foram os sintomas mais precoces, o principal motivo da suspeita diagnóstica e a manifestação mais prevalente ao diagnóstico (69% dos casos). Apenas 28% dos pacientes em tratamento tinham homocisteína total <60 μmol/L. Quanto às estratégias de tratamento, 89% dos pacientes utilizavam ácido fólico e piridoxina, 76% betaína, 32% vitamina B12 e 26% e dieta pobre em metionina com fórmula metabólica. O sequenciamento do gene CBS revelou 21 mutações diferentes, sendo as mais prevalentes: p.Ile278Thr (18,2% dos alelos), p.Thr191Met (11,3%), r.[737_828del92, 828_931ins104] (11,3%) e p.Trp323Ter (11,3%). Oito novas mutações foram encontradas. As atividades enzimáticas expressas em E.coli foram de: 1,5% para a mutação c.329A>T; 17,5% para a c.284T>C e 206% para a c.2T>C. A análise de qRT-PCR revelou redução de expressão gênica (54-95%) em todos os pacientes avaliados. Não houve diferença no percentual de gordura em ambos os métodos utilizados para avaliação da composição corporal. Já a massa magra foi menor nos pacientes na avaliação por DXA (p=0,008). Leptina plasmática, colesterol LDL e índice SCD-16 foram significativamente mais baixos nos pacientes (p<0,05). Lipoproteínas apresentaram associações com colina, etanolamina e leptina nos pacientes. Cisteína foi significativamente mais baixa nos pacientes e apresentou correlação positiva com IMC (r=0,912, p=0,001), e tendência de associação com o índice SCD-16 (r=0,624, p=0,054). Não houve diferença nos demais parâmetros avaliados. Conclusões: este estudo traz o panorama clínico e genético mais abrangente da HCU já realizado no Brasil. Observa-se que a maioria dos pacientes apresenta fenótipo grave, o que sugere subdiagnóstico das formas atenuadas/responsivas de HCU. Uma grande variabilidade alélica foi observada, mas as quatro mutações mais prevalentes são responsáveis por mais da metade dos alelos mutados. A redução de leptina, SCD-1 e colesterol LDL, e suas associações com os SAA, corroboram estudos observacionais e experimentais prévios que apontam para um papel destes aminoácidos (em especial a cisteína), na modulação do metabolismo lipídico. / Introduction: Classical homocystinuria (HCU) is a genetic disease caused by cystathionine β-synthase (CβS) deficiency. Biochemically, it is characterized by disrupted metabolism of sulfur amino acids (SAA), with elevated homocysteine and methionine and decreased cystathionine and cysteine in plasma. Clinical signs are mainly related to ocular, vascular, central nervous and skeletal systems. Treatment includes a methionine-restricted diet + metabolic formula, pharmacologically high doses of pyridoxine (cofactor of CβS) and betaine, and supplementation with folic acid and vitamin B12. Usually, patients responsive to pyridoxine present milder phenotypes. In Brazil, little is known about the clinical and genetic profile of patients diagnosed with HCU. Interestingly, recent evidence suggests that SAA, especially cysteine, modulate lipid metabolism and body composition. These changes appear to be linked to the suppression of liver SCD-1 (stearoyl-CoA desaturase-1), a key enzyme for the synthesis of monounsaturated fatty acids. Reduced fat mass and low expression of liver SCD-1 are described in HCU mice, and treatment reverses this phenotype. This phenomenon has not been studied in patients with HCU yet. Objectives: 1) to describe the clinical and genetic profile of Brazilian patients with HCU; and 2) to assess the relationship between SAA, body composition, SCD-1 activity, insulin resistance, and lipid metabolism in treated patients with HCU. Methods: A cross-sectional study was conducted. Clinical data of 66 patients (57 families) from 5 regions of Brazil (south n=12, southeast n=35, northeast n=8, north n=1, and mid-west n=1) were analyzed. Blood samples from 30 unrelated patients were collected and DNA was isolated and the CBS gene sequenced. RNA samples from 6 patients were collected and gene expression was analysed by qRT-PCR. Expression studies in E.coli of three novel mutations were performed. To study body composition and lipid metabolism, two studies were conducted. In the first, body composition was assessed by bioelectrical impedance analysis (BIA) in 9 patients and 18 controls; and plasma levels of methionine, total homocysteine, cysteine, choline, betaine, dimethylglycine, and ethanolamine were measured in patients. In the second study, 11 patients and 16 controls were evaluated. Body composition was assessed by Dual X-ray Absorptiometry (DXA). The sulfur compounds methionine, S-adenosylmethionine, S-adenosylhomocysteine, total homocysteine, cysteine, and glutathione; besides lipoproteins, free fatty acids, acylcarnitines, leptin, adiponectin, isoprostanes, glucose, and insulin were measured in plasma. Insulin resistance was determined by HOMA-IR. SCD-16 and SCD-18 indices, which estimate liver SCD-1 activity in humans, were calculated by product/precursor ratios of the corresponding fatty acids. Results: Clinical data analysis showed a high prevalence of nonresponsive patients (82%). Patients had a median age at evaluation of 19 years (range: 5-45 years); at diagnosis: 10 years (range: 1- 39 years); and first symptoms at the age of 5 years (range: 0-20 years). Eye manifestations were the earliest symptoms, the main reason for diagnostic suspicion, and the most prevalent symptom at diagnosis (69% of the cases). Only 28% of the treated patients had total homocysteine <60 μmol/L. Regarding treatment strategies, 89% of the patients used folic acid and pyridoxine, 76% betaine, 32% vitamin B12, and 26% methionine-restricted diet + formula. CBS sequencing revealed 21 distinct mutations, among which the most prevalent are: p.Ile278Thr (18.2%), p.Thr191Met (11.3%), r [737_828del92, 828_931ins104] (11.3%), and p.Trp323Ter (11.3%). Eight new mutations were found. Enzymatic activities expressed in E.coli were: 1.5% of normal for c.329A>T mutation; 17.5% for c.284T>C, and 206% for c.2T>C. qRT-PCR analysis showed reduced gene expression (54-95%) in all patients studied. Body composition analysis showed no difference in adiposity between patients and controls. However, lean mass was lower in patients according to DXA assessment (p = 0.008). Plasma leptin levels, LDL cholesterol, and SCD-16 index were significantly reduced in patients (p <0.05). Lipoproteins showed associations with choline, ethanolamine, and leptin levels in patients. Cysteine was significantly lower in patients, and positively correlated with BMI (r = 0.912, p = 0.001), and with SCD-16 index (r = 0.624, p = 0.054). No differences were observed for the remaining variables. Conclusions: This study provides the most comprehensive clinical and genetic profile of HCU ever held in Brazil. Most of the patients studied here presented a severe phenotype, suggesting underdiagnosis of milder/responsive types of HCU. A great number of private mutations was observed, but the four most prevalent mutations account for more than half of the mutated alleles. Low leptin, SCD-1 and cholesterol, and their association with SAA, are in agreement with previous observational and experimental studies that show that SAA (mainly cysteine) have an important role in the modulation of lipid metabolism.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado na maioria dos casos pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase. Como resultado da deficiência enzimática, ocorre acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos, o que leva a uma variedade de manifestações clínicas, envolvendo muitos órgãos e tecidos, mas principalmente os olhos, os ossos, o sistema cardiovascular e o sistema nervoso central. Como demonstrado por estudos em pacientes e em modelos animais, o estresse oxidativo pode estar envolvido na fisiopatologia de vários erros inatos do metabolismo. Essa condição pode ser causada por uma produção aumentada de espécies reativas, por uma falha nas defesas antioxidantes ou por ambos. Como consequência, o dano oxidativo às biomoléculas é gerado. Estudos em modelos animais demonstram que há uma relação entre Hcy e estresse oxidativo, mas poucos estudos existem avaliando o estresse oxidativo em pacientes portadores de homocistinúria. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar importantes parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em pacientes homocistinúricos em tratamento e em indivíduos saudáveis. Nós verificamos um aumento significativo nos níveis de grupamentos carbonilas e nos níveis de malondialdeído, bem como uma diminuição significativa de grupamentos sulfidrilas e do status antioxidante total no plasma de pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em relação aos controles. Pacientes em tratamento apresentaram uma redução significativa do conteúdo de malondialdeído e das concentrações de Hcy e metionina em relação ao grupo diagnóstico. Além disso, foi demonstrada uma correlação significativa negativa entre os níveis de grupamentos sulfidrilas e as concentrações de Hcy e uma correlação significativa positiva entre os níveis de malondialdeído e as concentrações de Hcy. Posteriormente, foram verificados níveis aumentados de dano ao DNA em pacientes homocistinúricos tratados em relação aos controles. Adicionalmente, foi demonstrado pelo estudo in vitro, um efeito concentração dependente da Hcy sobre o dano ao DNA. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo pode exercer um papel importante na fisiopatologia da homocistinúria e que isso ocorre provavelmente devido às altas concentrações de Hcy encontradas nesses pacientes. Novas abordagens terapêuticas, como o uso de antioxidantes, poderia ser uma alternativa para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. Além disso, um diagnóstico precoce e, consequentemente, um tratamento precoce, poderia evitar que os pacientes permanecessem por longo tempo submetidos à exposição de altas concentrações de Hcy. / Homocystinuria is an inherited error of metabolism of amino acids caused in most cases by deficiency of cystathionine β-synthase. As result of enzymatic deficiency, occur accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids, which leads to a variety of clinical manifestations, involving many organs and tissues, but mainly the eyes, the bones, the cardiovascular system and the central nervous system. As demonstrated by studies involving patients and animal models, the oxidative stress may be involved in pathophysiology of various inherited errors of metabolism. This condition may be caused by an increased production of reactive species, by a fail in antioxidant defense, or both. Consequently, the oxidative damage to biomolecules is generated. Studies in animal models have been shown a relationship between Hcy and oxidative stress, but scarce studies exist evaluating the oxidative stress in homocystinuric patients. Therefore, the aim of this study was to evaluate important parameters of oxidative stress in homocystinuric patients at diagnosis, in homocystinuric patients under treatment and in healthy individuals. We found a significant increase of carbonyl groups and malondialdehyde levels, as well as a reduction of sulfhydryl groups and total antioxidant status in plasma of homocystinuric patients at diagnosis relative to controls. Patients under treatment presented a significant reduction of the content of malondialdehyde, Hcy and methionine concentrations relative to patients at diagnosis. Furthermore, it was demonstrated a significant negative correlation between sulfhydryl group content and Hcy levels and a significant positive correlation between malondialdehyde and Hcy levels. It was demonstrated also increased levels of DNA damage in homocystinuric patients under treatment relative to controls. Additionally, it was verified by in vitro study, a concentration-dependent effect of Hcy on the DNA damage. Taken together, our date indicate that the oxidative stress may play a important role in pathophysiology of homocystinuria, probably due to high Hcy concentrations found in these patients. New therapeutic approaches, as the use of antioxidants, could be an alternative in order to improve the results of therapy in homocystinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of Hcy.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado na maioria dos casos pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase. Como resultado da deficiência enzimática, ocorre acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos, o que leva a uma variedade de manifestações clínicas, envolvendo muitos órgãos e tecidos, mas principalmente os olhos, os ossos, o sistema cardiovascular e o sistema nervoso central. Como demonstrado por estudos em pacientes e em modelos animais, o estresse oxidativo pode estar envolvido na fisiopatologia de vários erros inatos do metabolismo. Essa condição pode ser causada por uma produção aumentada de espécies reativas, por uma falha nas defesas antioxidantes ou por ambos. Como consequência, o dano oxidativo às biomoléculas é gerado. Estudos em modelos animais demonstram que há uma relação entre Hcy e estresse oxidativo, mas poucos estudos existem avaliando o estresse oxidativo em pacientes portadores de homocistinúria. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar importantes parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em pacientes homocistinúricos em tratamento e em indivíduos saudáveis. Nós verificamos um aumento significativo nos níveis de grupamentos carbonilas e nos níveis de malondialdeído, bem como uma diminuição significativa de grupamentos sulfidrilas e do status antioxidante total no plasma de pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em relação aos controles. Pacientes em tratamento apresentaram uma redução significativa do conteúdo de malondialdeído e das concentrações de Hcy e metionina em relação ao grupo diagnóstico. Além disso, foi demonstrada uma correlação significativa negativa entre os níveis de grupamentos sulfidrilas e as concentrações de Hcy e uma correlação significativa positiva entre os níveis de malondialdeído e as concentrações de Hcy. Posteriormente, foram verificados níveis aumentados de dano ao DNA em pacientes homocistinúricos tratados em relação aos controles. Adicionalmente, foi demonstrado pelo estudo in vitro, um efeito concentração dependente da Hcy sobre o dano ao DNA. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo pode exercer um papel importante na fisiopatologia da homocistinúria e que isso ocorre provavelmente devido às altas concentrações de Hcy encontradas nesses pacientes. Novas abordagens terapêuticas, como o uso de antioxidantes, poderia ser uma alternativa para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. Além disso, um diagnóstico precoce e, consequentemente, um tratamento precoce, poderia evitar que os pacientes permanecessem por longo tempo submetidos à exposição de altas concentrações de Hcy. / Homocystinuria is an inherited error of metabolism of amino acids caused in most cases by deficiency of cystathionine β-synthase. As result of enzymatic deficiency, occur accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids, which leads to a variety of clinical manifestations, involving many organs and tissues, but mainly the eyes, the bones, the cardiovascular system and the central nervous system. As demonstrated by studies involving patients and animal models, the oxidative stress may be involved in pathophysiology of various inherited errors of metabolism. This condition may be caused by an increased production of reactive species, by a fail in antioxidant defense, or both. Consequently, the oxidative damage to biomolecules is generated. Studies in animal models have been shown a relationship between Hcy and oxidative stress, but scarce studies exist evaluating the oxidative stress in homocystinuric patients. Therefore, the aim of this study was to evaluate important parameters of oxidative stress in homocystinuric patients at diagnosis, in homocystinuric patients under treatment and in healthy individuals. We found a significant increase of carbonyl groups and malondialdehyde levels, as well as a reduction of sulfhydryl groups and total antioxidant status in plasma of homocystinuric patients at diagnosis relative to controls. Patients under treatment presented a significant reduction of the content of malondialdehyde, Hcy and methionine concentrations relative to patients at diagnosis. Furthermore, it was demonstrated a significant negative correlation between sulfhydryl group content and Hcy levels and a significant positive correlation between malondialdehyde and Hcy levels. It was demonstrated also increased levels of DNA damage in homocystinuric patients under treatment relative to controls. Additionally, it was verified by in vitro study, a concentration-dependent effect of Hcy on the DNA damage. Taken together, our date indicate that the oxidative stress may play a important role in pathophysiology of homocystinuria, probably due to high Hcy concentrations found in these patients. New therapeutic approaches, as the use of antioxidants, could be an alternative in order to improve the results of therapy in homocystinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of Hcy.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado na maioria dos casos pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase. Como resultado da deficiência enzimática, ocorre acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos, o que leva a uma variedade de manifestações clínicas, envolvendo muitos órgãos e tecidos, mas principalmente os olhos, os ossos, o sistema cardiovascular e o sistema nervoso central. Como demonstrado por estudos em pacientes e em modelos animais, o estresse oxidativo pode estar envolvido na fisiopatologia de vários erros inatos do metabolismo. Essa condição pode ser causada por uma produção aumentada de espécies reativas, por uma falha nas defesas antioxidantes ou por ambos. Como consequência, o dano oxidativo às biomoléculas é gerado. Estudos em modelos animais demonstram que há uma relação entre Hcy e estresse oxidativo, mas poucos estudos existem avaliando o estresse oxidativo em pacientes portadores de homocistinúria. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar importantes parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em pacientes homocistinúricos em tratamento e em indivíduos saudáveis. Nós verificamos um aumento significativo nos níveis de grupamentos carbonilas e nos níveis de malondialdeído, bem como uma diminuição significativa de grupamentos sulfidrilas e do status antioxidante total no plasma de pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em relação aos controles. Pacientes em tratamento apresentaram uma redução significativa do conteúdo de malondialdeído e das concentrações de Hcy e metionina em relação ao grupo diagnóstico. Além disso, foi demonstrada uma correlação significativa negativa entre os níveis de grupamentos sulfidrilas e as concentrações de Hcy e uma correlação significativa positiva entre os níveis de malondialdeído e as concentrações de Hcy. Posteriormente, foram verificados níveis aumentados de dano ao DNA em pacientes homocistinúricos tratados em relação aos controles. Adicionalmente, foi demonstrado pelo estudo in vitro, um efeito concentração dependente da Hcy sobre o dano ao DNA. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo pode exercer um papel importante na fisiopatologia da homocistinúria e que isso ocorre provavelmente devido às altas concentrações de Hcy encontradas nesses pacientes. Novas abordagens terapêuticas, como o uso de antioxidantes, poderia ser uma alternativa para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. Além disso, um diagnóstico precoce e, consequentemente, um tratamento precoce, poderia evitar que os pacientes permanecessem por longo tempo submetidos à exposição de altas concentrações de Hcy. / Homocystinuria is an inherited error of metabolism of amino acids caused in most cases by deficiency of cystathionine β-synthase. As result of enzymatic deficiency, occur accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids, which leads to a variety of clinical manifestations, involving many organs and tissues, but mainly the eyes, the bones, the cardiovascular system and the central nervous system. As demonstrated by studies involving patients and animal models, the oxidative stress may be involved in pathophysiology of various inherited errors of metabolism. This condition may be caused by an increased production of reactive species, by a fail in antioxidant defense, or both. Consequently, the oxidative damage to biomolecules is generated. Studies in animal models have been shown a relationship between Hcy and oxidative stress, but scarce studies exist evaluating the oxidative stress in homocystinuric patients. Therefore, the aim of this study was to evaluate important parameters of oxidative stress in homocystinuric patients at diagnosis, in homocystinuric patients under treatment and in healthy individuals. We found a significant increase of carbonyl groups and malondialdehyde levels, as well as a reduction of sulfhydryl groups and total antioxidant status in plasma of homocystinuric patients at diagnosis relative to controls. Patients under treatment presented a significant reduction of the content of malondialdehyde, Hcy and methionine concentrations relative to patients at diagnosis. Furthermore, it was demonstrated a significant negative correlation between sulfhydryl group content and Hcy levels and a significant positive correlation between malondialdehyde and Hcy levels. It was demonstrated also increased levels of DNA damage in homocystinuric patients under treatment relative to controls. Additionally, it was verified by in vitro study, a concentration-dependent effect of Hcy on the DNA damage. Taken together, our date indicate that the oxidative stress may play a important role in pathophysiology of homocystinuria, probably due to high Hcy concentrations found in these patients. New therapeutic approaches, as the use of antioxidants, could be an alternative in order to improve the results of therapy in homocystinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of Hcy.

A hiperhomocisteinemia severa ou homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo caracterizado pela deficiência na atividade da enzima cistationina- -sintetase. Estudos mostram que perturbações bioenergéticas, inflamatórias e o estresse oxidativo parecem estar relacionados às alterações causadas pela hiperhomocisteinemia severa. Alterações em alguns desses parâmetros em encéfalo, fígado e rim de ratos submetidos a esse modelo experimental já foram observadas em estudos prévios realizados em nosso laboratório. Considerando que pacientes com hiperhomocisteinemia severa apresentam alterações musculares, o objetivo principal dessa tese foi padronizar técnicas para avaliar alguns parâmetros de metabolismo energético, estresse oxidativo e inflamação em músculo esquelético de ratos jovens. Também avaliamos a bioenergética e a atividade da enzima Na+,K+-ATPase em amígdala desses animais. A atividade da butirilcolinesterase e parâmetros inflamatórios também foram avaliados em soro. O efeito do tratamento com creatina sobre as possíveis alterações nos parâmetros bioquímicos encontradas nesse modelo experimental também foi investigado. A hiperhomocisteinemia severa foi induzida em ratos Wistar através da administração subcutânea de homocisteína ou salina (controle), do 6º ao 28º, onde as doses variam de acordo com o desenvolvimento dos animais, atingindo 0,03 μmol/g de peso corporal. Os animais receberam uma injeção intraperitoneal por dia de creatina (50 mg/Kg) concomitante com a administração de homocisteína ou salina (controle). Em relação aos parâmetros bioquímicos no músculo esquelético, mostramos que a homocisteína é capaz de diminuir tanto a viabilidade celular, como a oxidação da glicose, bem como alterar enzimas chave para a manutenção da homeostase energética, como piruvato cinase, creatina cinase e enzimas do ciclo de Krebs e da cadeia transportadora de elétrons. Além disso, a homocisteína aumentou a produção de espécies reativas e lipoperoxidação, alterou as enzimas antioxidantes e o conteúdo de glutationa reduzida, sulfidrilas, carbonilas e nitritos. Em relação aos parâmetros inflamatórios foi observado um aumento nos níveis das citocinas TNF-α, IL-1β and IL-6, proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) em músculo esquelético e soro de ratos. Os ratos submetidos à hiperhomocisteinemia severa apresentaram um aumento na atividade da acetilcolinesterase em músculo esquelético. A enzima butirilcolinesterase não teve sua atividade alterada em soro de ratos. Em conjunto, os resultados desse trabalho mostram que a homocisteína promove perturbações no metabolismo energético, insultos oxidativos e inflamatórios, além de prejudicar a funcionalidade de enzimas importantes em músculo esquelético de ratos jovens. Em relação à amígdala, mostramos que a homocisteína é capaz de alterar enzimas essenciais da cadeia transportadora de elétrons, funções mitocondriais importantes como massa e potencial, diminuir a atividade e o imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase e causar apoptose em amígdala de ratos jovens. A creatina foi capaz de prevenir alterações importantes em músculo esquelético, amígdala e soro desses animais submetidos ao modelo crônico de hiperhomocisteinemia severa, onde ela contribuiu para a homeostase energética celular e pôde atuar como antioxidante. Sendo usada com cautela, pode se tornar um adjuvante terapêutico promissor para minimizar sintomas característicos de pacientes homocistinúricos. / Severe hyperhomocysteinemia or classical homocystinuria is an inborn error of metabolism characterized by a deficiency in the activity of cystathionine- synthetase enzyme. Studies show that bioenergy disturbances and oxidative stress appear to be related to changes caused by severe hyperhomocysteinemia. Changes in some of these parameters in brain, liver and kidney of rats undergoing this experimental model have been observed in previous studies performed in our laboratory. Whereas patients with severe hyperhomocysteinemia have muscle disorders, the main objective of this thesis was to standardize techniques for assessing some energy metabolism parameters, oxidative stress and inflammation in skeletal muscle of young rats. We also evaluate the bioenergetics and enzyme activity of Na+, K+ -ATPase in the amygdala of these animals. The activity of butyrylcholinesterase and inflammatory parameters were also evaluated in serum. The effect of treatment with creatine on the possible changes in biochemical parameters found in this experimental model was also investigated. The severe hyperhomocysteinemia was induced in rats by subcutaneous administration of homocysteine or saline (control), 6th to 28th, and the doses vary according to the development of animals, totaling 0.03 μmol/g body weight. The animals received one intraperitoneal injection of creatine per day (50 mg/kg) with concomitant administration of homocysteine or saline (control). The biochemical parameters in the skeletal muscle, show that homocysteine can reduce both cell viability and glucose oxidation, and change the key enzymes for the maintenance of energy homeostasis, such as pyruvate kinase and creatine kinase enzymes cycle Krebs and electron transport chain. In addition, homocysteine increased ROS generation and lipid peroxidation, altered the antioxidant enzymes and the reduced glutathione content, sulfhydryl, carbonyl and nitrites. Regarding inflammatory parameters was observed increased levels of cytokines TNF-α, IL- 1β and IL-6 chemotactic protein-1 monocytes (MCP-1) in skeletal muscle and serum of rats. The rats with severe hyperhomocysteinemia showed an increase in acetylcholinesterase activity in skeletal muscle. The enzyme butyrylcholinesterase had not changed their activity in rat serum. Taken together, the results of this work show that homocysteine promotes disruption of energy metabolism, oxidative and inflammatory insults, and impair the functionality of important enzymes in skeletal muscle of young rats. Regarding the amygdala showed that homocysteine can alter essential enzymes of the carrier electrons chain significant mitochondrial functions as a mass and the potential, decrease the activity and immunocontent Na+, K+ -ATPase and cause apoptosis in amygdala of young rats. Creatine was able to prevent major changes in skeletal muscle, amygdala and serum of these animals subjected to chronic model of severe hyperhomocysteinemia, where she contributed to the energy cell homeostasis and could act as an antioxidant. Being used with caution, it can become a promising therapeutic adjuvant to minimize symptoms characteristic of homocistinurics patients.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causado pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase, o que resulta no acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Pacientes afetados geralmente apresentam aterosclerose, retardo mental, convulsões e isquemia cerebral. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por estas manifestações são pouco conhecidos. A isquemia cerebral é caracterizada por uma redução grave ou pelo bloqueio completo do fluxo sanguíneo normal em alguma região do cérebro, geralmente causada por um trombo ou uma hemorragia. O estresse oxidativo parece ser um dos principais mecanismos envolvidos no dano celular induzido por isquemia e a administração de antioxidantes, em alguns casos, pode prevenir alguns desses danos. Considerando que: a) pacientes com homocistinúria apresentam alterações neurológicas e que são mais suscetíveis à isquemia, b) o estresse oxidativo parece estar envolvido na fisiopatogenia tanto da homocistinúria quanto da isquemia cerebral c) o ácido fólico reduz os níveis plasmáticos de homocisteína e pode ter efeitos antioxidantes, e) o pré-tratamento com vitaminas E e C previne os efeitos da Hcy sobre a Na+, K+-ATPase e sobre a memória, neste trabalho nós verificamos os efeitos in vivo e in vitro da homocisteína sobre fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de oxigênio e glicose, um modelo in vitro de isquemia cerebral, e também os efeitos do pré-tratamento com antioxidantes, vitamina E mais C e ácido fólico sobre o dano celular causado pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína in vitro (100 e 500 μM), aumentou a liberação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio de incubação, sugerindo um aumento no dano celular causado pela isquemia. Além disso, tanto o modelo agudo quanto o crônico de hiperhomocisteinemia aumentou a morte celular quando os animais foram sacrificados 1 hora após a administração de homocisteína. Nossos resultados também mostraram que o pré-tratamento com ácido fólico foi capaz de prevenir completamente o dano causado pela administração aguda de homocisteína, enquanto que a vitamina E preveniu apenas parte deste efeito. Estes achados podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a maior susceptibilidade dos pacientes hiperhomocisteinêmicos de apresentar eventos issquêmicos e apontam uma possível estratégia de prevenção. / Homocystinuria is an inherited metabolic disorder caused by severe deficiency of cystationine β-synthase activity, resulting in the tissue accumulation of homocysteine and methionine. Affected patients usually present atherosclerosis, mental retardation, seizures, and stroke. However, the physiopatological mechanisms are not yet fully established. Cerebral ischemia is defined as a severe reduction or blockage of normal blood flow in the brain, usually caused by thrombosis or hemorrhage. Oxidative stress seem to be one of major mechanisms involved on cellular damage induced by ischemia, and antioxidants administration, sometimes, can prevent this damage. Considering that: a) homocystinuric patients present neurological alterations and are more susceptible to ischemia, b) oxidative stress is involved on pathogenia such of homocystinuria as of cerebral ischemia, c) folic acid reduces the serum levels of homocisteine and could have antioxidant effects, c) pretreatment with vitamins E and C prevent the effects of homocysteine on Na+, K+-ATPase activity and on memory, in this work we verified the in vivo and in vitro effects of homocysteine on rat hippocampal slices exposed to oxygen and glucose deprivation, an in vitro model of cerebral ischemia, we also investigated the effects of pretreatment with antioxidants, vitamin E plus C and folic acid on cellular damage caused by homocysteine. Results showed that homocysteine in vitro (100 and 500μM), both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the LDH release to the incubation medium, suggesting an increase of tissue damage caused by ischemia. Furthermore, results showed that both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the cellular death. Our results also demonstrated that pretreatment with folic acid completely prevented the damage caused by acute homocysteine administration, whereas vitamin E just partially prevented such effect. These findings may be relevant to explain, at least in part, the higher susceptibility of hyperhomocysteinemic patients to bear ischemic events and point to a possible preventive treatment.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo caracterizado, bioquimicamente, pela deficiência da enzima cistationina-β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos e vasculares característicos, como retardo mental e arteriosclerose, cuja fisiopatologia é desconhecida. No presente trabalho, avaliamos os efeitos in vitro e in vivo da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos. Primeiramente, observamos o efeito in vitro da exposição de homogeneizados de córtex parietal de ratos ao ácido fólico, avaliando a inibição causada pela homocisteína sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas plasmáticas. Nos estudos in vivo, investigamos o efeito do pré-tratamento com ácido fólico sobre a inibição das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase em córtex parietal e em soro de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia aguda, respectivamente. Considerando que a Na+,K+-ATPase é suscetível ao ataque de radicais livres, nós determinamos o efeito da hiperhomocisteinemia aguda sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo total de grupos tióis em córtex parietal de ratos. Finalmente, investigamos o efeito do ácido fólico sobre a redução da atividade da Na+,K+-ATPase em córtex parietal e sobre o aumento do índice de dano ao DNA em sangue total de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia crônica. Nossos resultados mostraram que a homocisteína in vitro reduz, significativamente, a atividade da Na+,K+-ATPase e que o ácido fólico previne esse efeito. Estudos cinéticos com o substrato ATP revelaram que a homocisteína inibe de forma não-competitiva a enzima Na+,K+-ATPase. Os estudos in vivo confirmaram que a hiperhomocisteinemia aguda diminui as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase e que o pré-tratamento com ácido fólico também previne os efeitos causados pela homocisteína. Por outro lado, a hiperhomocisteinemia aguda não alterou os parâmetros de estresse oxidativo analisados. A hiperhomocisteinemia crônica inibiu a Na+,K+-ATPase em córtex parietal e aumentou o índice de dano ao DNA em sangue total de ratos e, novamente, o tratamento com ácido fólico previne tais efeitos. Esses resultados, em conjunto, revelam os efeitos da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos e colaboram com o entendimento da fisiopatologia da homocistinúria. Além disso, os resultados sugerem que o ácido fólico, já utilizado por alguns pacientes homocistinúricos, poderá ser uma importante ferramenta terapêutica utilizada na prevenção dos efeitos neurológicos e vasculares da homocisteína.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causado pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase, o que resulta no acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Pacientes afetados geralmente apresentam aterosclerose, retardo mental, convulsões e isquemia cerebral. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por estas manifestações são pouco conhecidos. A isquemia cerebral é caracterizada por uma redução grave ou pelo bloqueio completo do fluxo sanguíneo normal em alguma região do cérebro, geralmente causada por um trombo ou uma hemorragia. O estresse oxidativo parece ser um dos principais mecanismos envolvidos no dano celular induzido por isquemia e a administração de antioxidantes, em alguns casos, pode prevenir alguns desses danos. Considerando que: a) pacientes com homocistinúria apresentam alterações neurológicas e que são mais suscetíveis à isquemia, b) o estresse oxidativo parece estar envolvido na fisiopatogenia tanto da homocistinúria quanto da isquemia cerebral c) o ácido fólico reduz os níveis plasmáticos de homocisteína e pode ter efeitos antioxidantes, e) o pré-tratamento com vitaminas E e C previne os efeitos da Hcy sobre a Na+, K+-ATPase e sobre a memória, neste trabalho nós verificamos os efeitos in vivo e in vitro da homocisteína sobre fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de oxigênio e glicose, um modelo in vitro de isquemia cerebral, e também os efeitos do pré-tratamento com antioxidantes, vitamina E mais C e ácido fólico sobre o dano celular causado pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína in vitro (100 e 500 μM), aumentou a liberação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio de incubação, sugerindo um aumento no dano celular causado pela isquemia. Além disso, tanto o modelo agudo quanto o crônico de hiperhomocisteinemia aumentou a morte celular quando os animais foram sacrificados 1 hora após a administração de homocisteína. Nossos resultados também mostraram que o pré-tratamento com ácido fólico foi capaz de prevenir completamente o dano causado pela administração aguda de homocisteína, enquanto que a vitamina E preveniu apenas parte deste efeito. Estes achados podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a maior susceptibilidade dos pacientes hiperhomocisteinêmicos de apresentar eventos issquêmicos e apontam uma possível estratégia de prevenção. / Homocystinuria is an inherited metabolic disorder caused by severe deficiency of cystationine β-synthase activity, resulting in the tissue accumulation of homocysteine and methionine. Affected patients usually present atherosclerosis, mental retardation, seizures, and stroke. However, the physiopatological mechanisms are not yet fully established. Cerebral ischemia is defined as a severe reduction or blockage of normal blood flow in the brain, usually caused by thrombosis or hemorrhage. Oxidative stress seem to be one of major mechanisms involved on cellular damage induced by ischemia, and antioxidants administration, sometimes, can prevent this damage. Considering that: a) homocystinuric patients present neurological alterations and are more susceptible to ischemia, b) oxidative stress is involved on pathogenia such of homocystinuria as of cerebral ischemia, c) folic acid reduces the serum levels of homocisteine and could have antioxidant effects, c) pretreatment with vitamins E and C prevent the effects of homocysteine on Na+, K+-ATPase activity and on memory, in this work we verified the in vivo and in vitro effects of homocysteine on rat hippocampal slices exposed to oxygen and glucose deprivation, an in vitro model of cerebral ischemia, we also investigated the effects of pretreatment with antioxidants, vitamin E plus C and folic acid on cellular damage caused by homocysteine. Results showed that homocysteine in vitro (100 and 500μM), both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the LDH release to the incubation medium, suggesting an increase of tissue damage caused by ischemia. Furthermore, results showed that both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the cellular death. Our results also demonstrated that pretreatment with folic acid completely prevented the damage caused by acute homocysteine administration, whereas vitamin E just partially prevented such effect. These findings may be relevant to explain, at least in part, the higher susceptibility of hyperhomocysteinemic patients to bear ischemic events and point to a possible preventive treatment.