A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo, bioquimicamente caracterizado pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, o que promove um bloqueio na via de transulfuração da homocisteína e, consequente acúmulo tecidual desse aminoácido. Clinicamente, os pacientes apresentam retardo mental, déficit cognitivo, crises convulsivas, alterações vasculares, esqueléticas, oculares, hepáticas, e pulmonares, cuja fisiopatologia não está totalmente elucidada. O objetivo geral da presente tese foi avaliar o efeito da hiper-homocisteinemia severa sobre parâmetros inflamatórios (citocinas, quimiocinas, óxido nítrico, proteínas de fase aguda e contagem diferencial de leucócitos) e outros parâmetros relacionados, tais como o sistema da coagulação, o estresse oxidativo e, as vias de sinalização da Akt e GSK-3β no cérebro e/ou sangue de ratos. Além disso, investigamos o efeito do estresse oxidativo em pulmão de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia severa. A hiperhomocisteinemia aguda aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de nitritos no hipocampo e no córtex cerebral de ratos. Os níveis de TNF-α e IL-6 também aumentaram no soro de ratos submetidos à administração aguda de homocísteina. A percentagem de neutrófilos e monócitos aumentou no sangue após a administração aguda de homocisteína; entretanto, não observamos alterações nos níveis das proteínas de fase aguda (PCR e α1- glicoproteína ácida). A hiper-homocisteinemia crônica severa também aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de prostaglandina E2 no hipocampo e/ou soro de ratos. Os níveis de nitritos aumentaram no hipocampo, mas verificamos uma diminuição em seus níveis no soro após a hiper-homocisteinemia crônica. O imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a atividade da acetilcolinesterase aumentaram no hipocampo de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia crônica. Demonstramos também que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a contagem de plaquetas no sangue e os níveis de fibrinogênio no plasma. O tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada e os níveis de nitritos no plasma diminuíram após a administração aguda de homocisteína. Mostramos que a hiperhomocisteinemia aguda severa aumentou as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, um índice de peroxidação lipídica e, diminuiu a atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase e glutationa peroxidase e aumentou a atividade da enzima catalase em eritrócitos de ratos. Em relação ao envolvimento das vias de sinalização, demonstramos que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a fosforilação da Akt, o imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a fosforilação da proteína Tau, mas reduziu a fosforilação da GSK-3β após a administração aguda de homocisteína. Por outro lado, a hiper-homocisteinemia crônica severa não alterou a fosforilação da Akt e GSK-3β após a administração crônica desse aminoácido. Além disso, demonstramos que a hiper-homocisteinemia crônica severa aumentou a peroxidação lipídica e, reduziu as defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas em pulmão de ratos. Em resumo, nossos resultados demonstram que a inflamação, a hipercoagulabilidade e o estresse oxidativo podem ocorrer após a hiper-homocisteinemia severa, o que pode estar associado, pelo menos em parte, com as alterações cerebrais e cardiovasculares, bem como no tromboembolismo pulmonar que estão presentes em alguns pacientes homocistinúricos. / Classical homocystinuria, an inborn error of metabolism, is biochemically characterized by cystathionine -synthase deficiency and homocysteine tissue accumulation. Mental retardation, cognitive deficiency, seizures, vascular, skeletal, ocular, hepatic and pulmonary complications are common symptoms in homocystinuric patients. However, the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to investigate the effect of severe hyperhomocysteinemia on inflammatory parameters (cytokines, chemokines, nitric oxide, acute phase-proteins and a differential count of leukocytes) and other related parameters, such as the coagulation system, oxidative stress as well as the involvement of the Akt and GSK-3β pathway in the brain and/or blood of rats. In addition, we investigated the effect of oxidative stress in the lungs of rats submitted to severe hyperhomocysteinemia. Acute hyperhomocysteinemia increased proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and nitrite levels in hippocampus and cerebral cortex of rats. TNF-α and IL-6 levels also increased in serum of rats subjected to acute homocysteine administration. The percentage of neutrophils and monocytes increased in blood after acute homocysteine administration, but acute phase-proteins (CRP and α1-acid glycoprotein) were not altered by homocysteine administration. In addition, we showed that chronic hyperhomocysteinemia increased pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and prostaglandin E2 levels in the hippocampus and/or serum of rats. Nitrite levels increased in the hippocampus, but decreased in the serum after chronic homocysteine administration. The immunocontent of cytosolic and nuclear NF-κB/p65 subunit and the acetylcholinesterase activity were increased in the hippocampus of rats subjected to chronic hyperhomocysteinemia. Next, we demonstrated that acute hyperhomocysteinemia increased the platelet counts in the blood and plasma fibrinogen levels of rats. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, and nitrite levels decreased in plasma after acute hyperhomocysteinemia. Additionally, we showed that acute hyperhomocysteinemia increased thiobarbituric acid-reactive, an index of lipid peroxidation, and decreased the superoxide dismutase and gluthatione peroxidase activity and also increased the catalase activity in erythrocytes of rats. Moreover, acute hyperhomocysteinemia increases Akt phosphorylation, cytosolic and nuclear immunocontent of NF-κβ/p65 subunit and Tau protein phosphorylation, but reduces GSK-3β phosphorylation after acute homocysteine administration. On the other hand, chronic hyperhomocysteinemia did not alter Akt and GSK-3β phosphorylation after the chronic administration of this amino acid. We also showed that chronic hyperhomocysteinemia increased lipid peroxidation, and disrupted antioxidant defenses (enzymatic and non-enzymatic) in the lungs of rats. In summary, our findings showed that inflammation, hypercoagulability and oxidative stress can occur after severe hyperhomocysteinemia, possibly in association, at least in part, with cerebral and cardiovascular dysfunction, as well as pulmonary thromboembolism complications observed in some homocystinuric patients.

As doenças metabólicas são Erros Inatos do Metabolismo (EIM) que apresentam diferentes aspectos relacionados com sistemas e órgãos distintos, incluindo o cérebro e o coração. Dentre os EIM, as acidemias orgânicas e as aminoacidopatias são os mais freqüentes. Neste trabalho abordaremos a Deficiência de Guanidinoacetato Metiltransferase (GAMT), uma acidemia orgânica, e a Homocistinúria (HCU), uma aminoacidopatia. A Deficiência de GAMT é caracterizada bioquimicamente por acúmulo de guanidino acetato (GAA) e pela deficiência de creatina. Há evidências mostrando que o GAA pode causar excitotoxicidade e induzir estresse oxidativo. A creatina é uma amina de ocorrência natural com um papel muito importante no metabolismo energético, além de apresentar propriedades antioxidantes per se. A hiper-homocisteinemia é um fator de risco para doenças cardiovasculares, aterosclerose e trombose, no entanto, os mecanismos pelos quais a homocisteína (Hcy) desencadeia essas disfunções não são totalmente compreendidos. A Na+,K+-ATPase e a creatina cinase desempenham um papel fundamental no sistema nervoso central, uma vez que a alteração dessas enzimas, juntamente com a diminuição do metabolismo energético e a indução do estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças neurodegenerativas. Dessa forma, os objetivos desse trabalho serão apresentados em duas partes; como segue: Parte I - Ampliar o conhecimento sobre uma possível estratégia de tratamento dos pacientes afetados pela Deficiência de GAMT, investigando o efeito da administração de creatina sobre alterações causadas pela administração intraestriatal de GAA em ratos adultos; Parte II - Investigar o efeito da hiper-homocisteinemia crônica sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em coração de ratos jovens. Para os modelos experimentais mencionados, foram avaliados parâmetros do metabolismo energético (Na+,K+-ATPase, creatina cinase e complexo II da cadeia respiratória), bem como níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), atividade de enzimas antioxidantes denominadas superóxido dismutase e catalase, oxidação de 2',7'-diclorofluoresceína (H2DCF), e níveis de nitritos. Também avaliamos o efeito do ácido fólico sobre as alterações bioquímicas provocadas pela Hcy. Os nossos resultados mostram que a administração de creatina preveniu todos os parâmetros alterados pela administração de GAA. Acreditamos que a prevenção causada pela creatina pode contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados com o déficit energético e estresse oxidativo presentes na Deficiência de GAMT. Para o modelo experimental de hiper-homocisteinemia severa, os nossos resultados mostram que a administração crônica de Hcy aumentou a lipoperoxidação e a produção de espécies reativas, diminui as defesas antioxidantes enzimáticas e os níveis de nitritos em coração de ratos jovens. A administração concomitante de ácido fólico, preveniu os efeitos da Hcy provavelmente por suas propriedades antioxidantes, indicando que o estresse oxidativo provocado pela Hcy pode ser um mecanismo que contribui, pelo menos em parte, nas alterações cardiovasculares características dos pacientes hiper-homocisteinêmicos. Se confirmado em seres humanos, nossos dados poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos cerebrais e cardiovasculares característicos da Deficiência de GAMT e da HCU, respectivamente, e propor terapias adjuvantes para as alterações pertinentes encontradas no cérebro e no coração dos pacientes afetados por essas doenças metabólicas. / Metabolic diseases are Inborn Errors of Metabolism (IEM) that present different aspects related to different systems and organs including the brain and the heart. Among the IEM, the organic acidemias and the aminoacidopathies are the most frequent. In this work we study the guanidinoacetate methyltransferase deficiency (GAMT), an organic acidemia, and the Homocystinuria (HCU), an aminoacid pathology. The GAMT deficiency is characterized biochemically by the accumulation of guanidineacetate (GAA) and creatine deficiency. There are evidences that the GAA can cause excitotoxicity and induce oxidative stress. Creatine is a naturally occurring amine with a very important role in energy metabolism, besides its antioxidant properties per se. Hyperhomocysteinemia is a risk factor for cardiovascular diseases, atherosclerosis and thrombosis, however, the mechanisms by which homocysteine (Hcy) triggers these disorders are not fully understood. The Na+, K+-ATPase and creatine kinase plays a key role in central nervous system, since alteration of these enzymes, together with the decrease of the energy metabolism and induction of oxidative stress have been associated with some neurodegenerative diseases. Thus, the objectives of this study will be presented in two parts, as follows: Part I - To increase knowledge on a possible treatment strategy of patients affected by GAMT deficiency, investigating the effect of creatine administration on changes caused by intrastriatal administration of GAA in adult rats; Part II – To investigate the effect of chronic hyperhomocysteinemia on some parameters of oxidative stress in the heart of young rats. For the experimental models mentioned were evaluated parameters of energy metabolism (Na+, K+-ATPase, creatine kinase and complex II of the respiratory chain), as well as levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), antioxidant enzymes called superoxide dismutase and catalase, oxidation of 2 ', 7'-dichlorofluorescein (H2DCF) and nitrite levels. We also evaluated the effect of folic acid on the biochemical changes caused by Hcy. Our results show that administration of creatine prevented all the parameters altered by the administration of GAA. We believe that the prevention caused by creatine may contribute, at least in part, to a better understanding of the mechanisms related to the energy deficit and oxidative stress present in GAMT deficiency. For the experimental model of severe hyperhomocysteinemia, our findings show that chronic administration of Hcy increased lipoperoxidation and reactive species generation, decreases the enzymatic antioxidant defenses and levels of nitrite in the heart of young rats. Concomitant administration of folic acid prevented the effects of Hcy probably by its antioxidant properties, indicating that the oxidative stress induced by the Hcy may be one mechanism that contributes at least in part, on cardiovascular features of hyperhomocysteinemic patients. If confirmed in humans, our data may contribute to elucidating the brain and cardiovascular mechanisms characteristics of the GAMT deficiency and of the HCU, respectively, and to propose adjuvant therapies relevant to the amendments found in the brain and heart of patients affected by these metabolic diseases.

A homocistinúria é uma desordem metabólica causada pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por essas manifestações são pouco conhecidos. O sistema colinérgico apresenta papel importante na função cognitiva do qual as colinesterases, acetilcolinesterase e butirilcolinesterase, são constituintes ubíquos. Similarmente à acetilcolinesterase, a butirilcolinesterase hidrolisa a acetilcolina e está presente no soro, coração, endotélio vascular e no sistema nervoso. Estudos têm mostrado que as colinesterases estão inibidas no córtex cerebral de pacientes com a doença de Alzheimer. Adicionalmente, há evidências na literatura mostrando que as colinesterases são inibidas por radicais livres. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Recentes estudos têm demonstrado que essa enzima é inibida por radicais livres e também que sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, nosso grupo demonstrou que a homocisteína inibe a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral. Considerando que: a) pouco se sabe sobre os mecanismos responsáveis pelas manifestações neurológicas que ocorrem na homocistinúria, b) a administração de homocisteína prejudica a memória, c) as colinesterases são importantes para as funções cognitivas, d) a atividade da Na+,K+-ATPase está diminuída na isquemia cerebral, e) a homocisteína inibe a atividade dessa enzima in vitro e f) as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em tecidos periféricos podem ser consideradas marcadores de alterações que ocorram no sistema nervoso central, no presente estudo determinamos o efeito in vitro da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos, respectivamente. Também determinamos o efeito da administração aguda e crônica de homocisteína sobre a atividade da butirilcolinesterase sérica e a influência das vitaminas E e C sobre os efeitos inibitórios causados pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 60 dias in vitro. A homocisteína inibiu essa enzima de forma competitiva com a acetilcolina como substrato. Também foi verificado que a homocisteína reduziu significativamente as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos de 29 dias, respectivamente. Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 29 dias. Adicionalmente, verificou-se que o pré-tratamento com as vitaminas E e C não alterou per se a atividade da butirilcolinesterase, mas preveniu a redução da atividade dessa enzima causada pela administração aguda de homocisteína. Por fim, determinou-se que a administração crônica desse aminoácido diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que a redução das atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase pode estar associada à disfunção neurológica presente em pacientes homocistinúricos, uma vez que a determinação dessas enzimas em sistemas periféricos represente um marcador para a ação neurotóxica da homocisteína.

A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo, bioquimicamente caracterizado pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, o que promove um bloqueio na via de transulfuração da homocisteína e, consequente acúmulo tecidual desse aminoácido. Clinicamente, os pacientes apresentam retardo mental, déficit cognitivo, crises convulsivas, alterações vasculares, esqueléticas, oculares, hepáticas, e pulmonares, cuja fisiopatologia não está totalmente elucidada. O objetivo geral da presente tese foi avaliar o efeito da hiper-homocisteinemia severa sobre parâmetros inflamatórios (citocinas, quimiocinas, óxido nítrico, proteínas de fase aguda e contagem diferencial de leucócitos) e outros parâmetros relacionados, tais como o sistema da coagulação, o estresse oxidativo e, as vias de sinalização da Akt e GSK-3β no cérebro e/ou sangue de ratos. Além disso, investigamos o efeito do estresse oxidativo em pulmão de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia severa. A hiperhomocisteinemia aguda aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de nitritos no hipocampo e no córtex cerebral de ratos. Os níveis de TNF-α e IL-6 também aumentaram no soro de ratos submetidos à administração aguda de homocísteina. A percentagem de neutrófilos e monócitos aumentou no sangue após a administração aguda de homocisteína; entretanto, não observamos alterações nos níveis das proteínas de fase aguda (PCR e α1- glicoproteína ácida). A hiper-homocisteinemia crônica severa também aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de prostaglandina E2 no hipocampo e/ou soro de ratos. Os níveis de nitritos aumentaram no hipocampo, mas verificamos uma diminuição em seus níveis no soro após a hiper-homocisteinemia crônica. O imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a atividade da acetilcolinesterase aumentaram no hipocampo de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia crônica. Demonstramos também que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a contagem de plaquetas no sangue e os níveis de fibrinogênio no plasma. O tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada e os níveis de nitritos no plasma diminuíram após a administração aguda de homocisteína. Mostramos que a hiperhomocisteinemia aguda severa aumentou as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, um índice de peroxidação lipídica e, diminuiu a atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase e glutationa peroxidase e aumentou a atividade da enzima catalase em eritrócitos de ratos. Em relação ao envolvimento das vias de sinalização, demonstramos que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a fosforilação da Akt, o imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a fosforilação da proteína Tau, mas reduziu a fosforilação da GSK-3β após a administração aguda de homocisteína. Por outro lado, a hiper-homocisteinemia crônica severa não alterou a fosforilação da Akt e GSK-3β após a administração crônica desse aminoácido. Além disso, demonstramos que a hiper-homocisteinemia crônica severa aumentou a peroxidação lipídica e, reduziu as defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas em pulmão de ratos. Em resumo, nossos resultados demonstram que a inflamação, a hipercoagulabilidade e o estresse oxidativo podem ocorrer após a hiper-homocisteinemia severa, o que pode estar associado, pelo menos em parte, com as alterações cerebrais e cardiovasculares, bem como no tromboembolismo pulmonar que estão presentes em alguns pacientes homocistinúricos. / Classical homocystinuria, an inborn error of metabolism, is biochemically characterized by cystathionine -synthase deficiency and homocysteine tissue accumulation. Mental retardation, cognitive deficiency, seizures, vascular, skeletal, ocular, hepatic and pulmonary complications are common symptoms in homocystinuric patients. However, the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to investigate the effect of severe hyperhomocysteinemia on inflammatory parameters (cytokines, chemokines, nitric oxide, acute phase-proteins and a differential count of leukocytes) and other related parameters, such as the coagulation system, oxidative stress as well as the involvement of the Akt and GSK-3β pathway in the brain and/or blood of rats. In addition, we investigated the effect of oxidative stress in the lungs of rats submitted to severe hyperhomocysteinemia. Acute hyperhomocysteinemia increased proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and nitrite levels in hippocampus and cerebral cortex of rats. TNF-α and IL-6 levels also increased in serum of rats subjected to acute homocysteine administration. The percentage of neutrophils and monocytes increased in blood after acute homocysteine administration, but acute phase-proteins (CRP and α1-acid glycoprotein) were not altered by homocysteine administration. In addition, we showed that chronic hyperhomocysteinemia increased pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and prostaglandin E2 levels in the hippocampus and/or serum of rats. Nitrite levels increased in the hippocampus, but decreased in the serum after chronic homocysteine administration. The immunocontent of cytosolic and nuclear NF-κB/p65 subunit and the acetylcholinesterase activity were increased in the hippocampus of rats subjected to chronic hyperhomocysteinemia. Next, we demonstrated that acute hyperhomocysteinemia increased the platelet counts in the blood and plasma fibrinogen levels of rats. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, and nitrite levels decreased in plasma after acute hyperhomocysteinemia. Additionally, we showed that acute hyperhomocysteinemia increased thiobarbituric acid-reactive, an index of lipid peroxidation, and decreased the superoxide dismutase and gluthatione peroxidase activity and also increased the catalase activity in erythrocytes of rats. Moreover, acute hyperhomocysteinemia increases Akt phosphorylation, cytosolic and nuclear immunocontent of NF-κβ/p65 subunit and Tau protein phosphorylation, but reduces GSK-3β phosphorylation after acute homocysteine administration. On the other hand, chronic hyperhomocysteinemia did not alter Akt and GSK-3β phosphorylation after the chronic administration of this amino acid. We also showed that chronic hyperhomocysteinemia increased lipid peroxidation, and disrupted antioxidant defenses (enzymatic and non-enzymatic) in the lungs of rats. In summary, our findings showed that inflammation, hypercoagulability and oxidative stress can occur after severe hyperhomocysteinemia, possibly in association, at least in part, with cerebral and cardiovascular dysfunction, as well as pulmonary thromboembolism complications observed in some homocystinuric patients.

As doenças metabólicas são Erros Inatos do Metabolismo (EIM) que apresentam diferentes aspectos relacionados com sistemas e órgãos distintos, incluindo o cérebro e o coração. Dentre os EIM, as acidemias orgânicas e as aminoacidopatias são os mais freqüentes. Neste trabalho abordaremos a Deficiência de Guanidinoacetato Metiltransferase (GAMT), uma acidemia orgânica, e a Homocistinúria (HCU), uma aminoacidopatia. A Deficiência de GAMT é caracterizada bioquimicamente por acúmulo de guanidino acetato (GAA) e pela deficiência de creatina. Há evidências mostrando que o GAA pode causar excitotoxicidade e induzir estresse oxidativo. A creatina é uma amina de ocorrência natural com um papel muito importante no metabolismo energético, além de apresentar propriedades antioxidantes per se. A hiper-homocisteinemia é um fator de risco para doenças cardiovasculares, aterosclerose e trombose, no entanto, os mecanismos pelos quais a homocisteína (Hcy) desencadeia essas disfunções não são totalmente compreendidos. A Na+,K+-ATPase e a creatina cinase desempenham um papel fundamental no sistema nervoso central, uma vez que a alteração dessas enzimas, juntamente com a diminuição do metabolismo energético e a indução do estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças neurodegenerativas. Dessa forma, os objetivos desse trabalho serão apresentados em duas partes; como segue: Parte I - Ampliar o conhecimento sobre uma possível estratégia de tratamento dos pacientes afetados pela Deficiência de GAMT, investigando o efeito da administração de creatina sobre alterações causadas pela administração intraestriatal de GAA em ratos adultos; Parte II - Investigar o efeito da hiper-homocisteinemia crônica sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em coração de ratos jovens. Para os modelos experimentais mencionados, foram avaliados parâmetros do metabolismo energético (Na+,K+-ATPase, creatina cinase e complexo II da cadeia respiratória), bem como níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), atividade de enzimas antioxidantes denominadas superóxido dismutase e catalase, oxidação de 2',7'-diclorofluoresceína (H2DCF), e níveis de nitritos. Também avaliamos o efeito do ácido fólico sobre as alterações bioquímicas provocadas pela Hcy. Os nossos resultados mostram que a administração de creatina preveniu todos os parâmetros alterados pela administração de GAA. Acreditamos que a prevenção causada pela creatina pode contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados com o déficit energético e estresse oxidativo presentes na Deficiência de GAMT. Para o modelo experimental de hiper-homocisteinemia severa, os nossos resultados mostram que a administração crônica de Hcy aumentou a lipoperoxidação e a produção de espécies reativas, diminui as defesas antioxidantes enzimáticas e os níveis de nitritos em coração de ratos jovens. A administração concomitante de ácido fólico, preveniu os efeitos da Hcy provavelmente por suas propriedades antioxidantes, indicando que o estresse oxidativo provocado pela Hcy pode ser um mecanismo que contribui, pelo menos em parte, nas alterações cardiovasculares características dos pacientes hiper-homocisteinêmicos. Se confirmado em seres humanos, nossos dados poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos cerebrais e cardiovasculares característicos da Deficiência de GAMT e da HCU, respectivamente, e propor terapias adjuvantes para as alterações pertinentes encontradas no cérebro e no coração dos pacientes afetados por essas doenças metabólicas. / Metabolic diseases are Inborn Errors of Metabolism (IEM) that present different aspects related to different systems and organs including the brain and the heart. Among the IEM, the organic acidemias and the aminoacidopathies are the most frequent. In this work we study the guanidinoacetate methyltransferase deficiency (GAMT), an organic acidemia, and the Homocystinuria (HCU), an aminoacid pathology. The GAMT deficiency is characterized biochemically by the accumulation of guanidineacetate (GAA) and creatine deficiency. There are evidences that the GAA can cause excitotoxicity and induce oxidative stress. Creatine is a naturally occurring amine with a very important role in energy metabolism, besides its antioxidant properties per se. Hyperhomocysteinemia is a risk factor for cardiovascular diseases, atherosclerosis and thrombosis, however, the mechanisms by which homocysteine (Hcy) triggers these disorders are not fully understood. The Na+, K+-ATPase and creatine kinase plays a key role in central nervous system, since alteration of these enzymes, together with the decrease of the energy metabolism and induction of oxidative stress have been associated with some neurodegenerative diseases. Thus, the objectives of this study will be presented in two parts, as follows: Part I - To increase knowledge on a possible treatment strategy of patients affected by GAMT deficiency, investigating the effect of creatine administration on changes caused by intrastriatal administration of GAA in adult rats; Part II – To investigate the effect of chronic hyperhomocysteinemia on some parameters of oxidative stress in the heart of young rats. For the experimental models mentioned were evaluated parameters of energy metabolism (Na+, K+-ATPase, creatine kinase and complex II of the respiratory chain), as well as levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), antioxidant enzymes called superoxide dismutase and catalase, oxidation of 2 ', 7'-dichlorofluorescein (H2DCF) and nitrite levels. We also evaluated the effect of folic acid on the biochemical changes caused by Hcy. Our results show that administration of creatine prevented all the parameters altered by the administration of GAA. We believe that the prevention caused by creatine may contribute, at least in part, to a better understanding of the mechanisms related to the energy deficit and oxidative stress present in GAMT deficiency. For the experimental model of severe hyperhomocysteinemia, our findings show that chronic administration of Hcy increased lipoperoxidation and reactive species generation, decreases the enzymatic antioxidant defenses and levels of nitrite in the heart of young rats. Concomitant administration of folic acid prevented the effects of Hcy probably by its antioxidant properties, indicating that the oxidative stress induced by the Hcy may be one mechanism that contributes at least in part, on cardiovascular features of hyperhomocysteinemic patients. If confirmed in humans, our data may contribute to elucidating the brain and cardiovascular mechanisms characteristics of the GAMT deficiency and of the HCU, respectively, and to propose adjuvant therapies relevant to the amendments found in the brain and heart of patients affected by these metabolic diseases.

A homocistinúria é uma desordem metabólica causada pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por essas manifestações são pouco conhecidos. O sistema colinérgico apresenta papel importante na função cognitiva do qual as colinesterases, acetilcolinesterase e butirilcolinesterase, são constituintes ubíquos. Similarmente à acetilcolinesterase, a butirilcolinesterase hidrolisa a acetilcolina e está presente no soro, coração, endotélio vascular e no sistema nervoso. Estudos têm mostrado que as colinesterases estão inibidas no córtex cerebral de pacientes com a doença de Alzheimer. Adicionalmente, há evidências na literatura mostrando que as colinesterases são inibidas por radicais livres. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Recentes estudos têm demonstrado que essa enzima é inibida por radicais livres e também que sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, nosso grupo demonstrou que a homocisteína inibe a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral. Considerando que: a) pouco se sabe sobre os mecanismos responsáveis pelas manifestações neurológicas que ocorrem na homocistinúria, b) a administração de homocisteína prejudica a memória, c) as colinesterases são importantes para as funções cognitivas, d) a atividade da Na+,K+-ATPase está diminuída na isquemia cerebral, e) a homocisteína inibe a atividade dessa enzima in vitro e f) as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em tecidos periféricos podem ser consideradas marcadores de alterações que ocorram no sistema nervoso central, no presente estudo determinamos o efeito in vitro da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos, respectivamente. Também determinamos o efeito da administração aguda e crônica de homocisteína sobre a atividade da butirilcolinesterase sérica e a influência das vitaminas E e C sobre os efeitos inibitórios causados pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 60 dias in vitro. A homocisteína inibiu essa enzima de forma competitiva com a acetilcolina como substrato. Também foi verificado que a homocisteína reduziu significativamente as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos de 29 dias, respectivamente. Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 29 dias. Adicionalmente, verificou-se que o pré-tratamento com as vitaminas E e C não alterou per se a atividade da butirilcolinesterase, mas preveniu a redução da atividade dessa enzima causada pela administração aguda de homocisteína. Por fim, determinou-se que a administração crônica desse aminoácido diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que a redução das atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase pode estar associada à disfunção neurológica presente em pacientes homocistinúricos, uma vez que a determinação dessas enzimas em sistemas periféricos represente um marcador para a ação neurotóxica da homocisteína.

A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo, bioquimicamente caracterizado pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, o que promove um bloqueio na via de transulfuração da homocisteína e, consequente acúmulo tecidual desse aminoácido. Clinicamente, os pacientes apresentam retardo mental, déficit cognitivo, crises convulsivas, alterações vasculares, esqueléticas, oculares, hepáticas, e pulmonares, cuja fisiopatologia não está totalmente elucidada. O objetivo geral da presente tese foi avaliar o efeito da hiper-homocisteinemia severa sobre parâmetros inflamatórios (citocinas, quimiocinas, óxido nítrico, proteínas de fase aguda e contagem diferencial de leucócitos) e outros parâmetros relacionados, tais como o sistema da coagulação, o estresse oxidativo e, as vias de sinalização da Akt e GSK-3β no cérebro e/ou sangue de ratos. Além disso, investigamos o efeito do estresse oxidativo em pulmão de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia severa. A hiperhomocisteinemia aguda aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de nitritos no hipocampo e no córtex cerebral de ratos. Os níveis de TNF-α e IL-6 também aumentaram no soro de ratos submetidos à administração aguda de homocísteina. A percentagem de neutrófilos e monócitos aumentou no sangue após a administração aguda de homocisteína; entretanto, não observamos alterações nos níveis das proteínas de fase aguda (PCR e α1- glicoproteína ácida). A hiper-homocisteinemia crônica severa também aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de prostaglandina E2 no hipocampo e/ou soro de ratos. Os níveis de nitritos aumentaram no hipocampo, mas verificamos uma diminuição em seus níveis no soro após a hiper-homocisteinemia crônica. O imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a atividade da acetilcolinesterase aumentaram no hipocampo de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia crônica. Demonstramos também que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a contagem de plaquetas no sangue e os níveis de fibrinogênio no plasma. O tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada e os níveis de nitritos no plasma diminuíram após a administração aguda de homocisteína. Mostramos que a hiperhomocisteinemia aguda severa aumentou as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, um índice de peroxidação lipídica e, diminuiu a atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase e glutationa peroxidase e aumentou a atividade da enzima catalase em eritrócitos de ratos. Em relação ao envolvimento das vias de sinalização, demonstramos que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a fosforilação da Akt, o imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a fosforilação da proteína Tau, mas reduziu a fosforilação da GSK-3β após a administração aguda de homocisteína. Por outro lado, a hiper-homocisteinemia crônica severa não alterou a fosforilação da Akt e GSK-3β após a administração crônica desse aminoácido. Além disso, demonstramos que a hiper-homocisteinemia crônica severa aumentou a peroxidação lipídica e, reduziu as defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas em pulmão de ratos. Em resumo, nossos resultados demonstram que a inflamação, a hipercoagulabilidade e o estresse oxidativo podem ocorrer após a hiper-homocisteinemia severa, o que pode estar associado, pelo menos em parte, com as alterações cerebrais e cardiovasculares, bem como no tromboembolismo pulmonar que estão presentes em alguns pacientes homocistinúricos. / Classical homocystinuria, an inborn error of metabolism, is biochemically characterized by cystathionine -synthase deficiency and homocysteine tissue accumulation. Mental retardation, cognitive deficiency, seizures, vascular, skeletal, ocular, hepatic and pulmonary complications are common symptoms in homocystinuric patients. However, the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to investigate the effect of severe hyperhomocysteinemia on inflammatory parameters (cytokines, chemokines, nitric oxide, acute phase-proteins and a differential count of leukocytes) and other related parameters, such as the coagulation system, oxidative stress as well as the involvement of the Akt and GSK-3β pathway in the brain and/or blood of rats. In addition, we investigated the effect of oxidative stress in the lungs of rats submitted to severe hyperhomocysteinemia. Acute hyperhomocysteinemia increased proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and nitrite levels in hippocampus and cerebral cortex of rats. TNF-α and IL-6 levels also increased in serum of rats subjected to acute homocysteine administration. The percentage of neutrophils and monocytes increased in blood after acute homocysteine administration, but acute phase-proteins (CRP and α1-acid glycoprotein) were not altered by homocysteine administration. In addition, we showed that chronic hyperhomocysteinemia increased pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and prostaglandin E2 levels in the hippocampus and/or serum of rats. Nitrite levels increased in the hippocampus, but decreased in the serum after chronic homocysteine administration. The immunocontent of cytosolic and nuclear NF-κB/p65 subunit and the acetylcholinesterase activity were increased in the hippocampus of rats subjected to chronic hyperhomocysteinemia. Next, we demonstrated that acute hyperhomocysteinemia increased the platelet counts in the blood and plasma fibrinogen levels of rats. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, and nitrite levels decreased in plasma after acute hyperhomocysteinemia. Additionally, we showed that acute hyperhomocysteinemia increased thiobarbituric acid-reactive, an index of lipid peroxidation, and decreased the superoxide dismutase and gluthatione peroxidase activity and also increased the catalase activity in erythrocytes of rats. Moreover, acute hyperhomocysteinemia increases Akt phosphorylation, cytosolic and nuclear immunocontent of NF-κβ/p65 subunit and Tau protein phosphorylation, but reduces GSK-3β phosphorylation after acute homocysteine administration. On the other hand, chronic hyperhomocysteinemia did not alter Akt and GSK-3β phosphorylation after the chronic administration of this amino acid. We also showed that chronic hyperhomocysteinemia increased lipid peroxidation, and disrupted antioxidant defenses (enzymatic and non-enzymatic) in the lungs of rats. In summary, our findings showed that inflammation, hypercoagulability and oxidative stress can occur after severe hyperhomocysteinemia, possibly in association, at least in part, with cerebral and cardiovascular dysfunction, as well as pulmonary thromboembolism complications observed in some homocystinuric patients.

Introdução: A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo causado pela atividade deficiente da cistationina β-sintase (CβS). É caracterizada pela elevação sérica de homocisteína e metionina e redução dos níveis de cisteína. As manifestações clínicas clássicas envolvem os sistemas ocular, vascular, nervoso central e ósseo. Entretanto, observações recentes sugerem que alterações na composição corporal, especialmente a redução de tecido adiposo, também pode ser uma manifestação frequente e clinicamente relevante nesta doença. Além disso, a gravidade do fenótipo clínico parece ser influenciada por outros genes além do CβS. O objetivo deste estudo foi investigar alterações na composição corporal e detectar mutações comuns nos genes CβS, MTHFR e F5 em pacientes com homocistinúria clássica; relacionando dados clínicos, bioquímicos e genéticos. Métodos: Realizada avaliação da composição corporal em 8 pacientes através de duas técnicas: antropometria (aferição das dobras cutâneas triciptal, biciptal, subescapular e suprailíaca) e bioimpedância elétrica (BIA). A partir dos resultados obtidos, calculou-se o percentual de gordura pelas fórmulas de Siri (antropometria) e Kushner (BIA). O índice de massa corporal (IMC) também foi calculado. Os níveis de metionina, homocisteína e cisteína foram mensurados por HPLC. A avaliação genotípica foi realizada em 11 pacientes através de PCR-RFLP. Pesquisadas as mutações p.I278T, p.T191M, p.G307S e c.844ins68 no gene CβS; c.677TC>T e c.1298A>C no gene MTHFR; e p.R506Q no gene F5 (Fator V de Leiden). Resultados: Cinco pacientes apresentaram baixo percentual de gordura por pelo menos um dos métodos; o restante apresentou percentual médio. De acordo com o IMC, apenas dois pacientes foram classificados em baixo peso. O percentual de gordura total não se relacionou com os achados bioquímicos ou ósseos, mas medida isolada da dobra cutânea triciptal correlacionou-se positivamente com os níveis de cisteína (p=0,03) Além disso, os níveis de homocisteína e metionina correlacionaram-se negativamente com o IMC, enquanto que a cisteína teve associação positiva (p<0.05). Houve tendência do escore T de fêmur associar-se negativamente com homocisteína e positivamente com cisteína (p=0,09). Entre as mutações do gene CβS, a p.1278T foi a única encontrada (n= 3/9 famílias); entretanto, em 2/3 famílias estava em cis com a c.844ins68. Assim, em apenas um caso tinha caráter patogênico. Não foi possível estabelecer associação entre mutações em MTHFR e F5 e a gravidade do fenótipo. Conclusões: Os resultados sugerem que deficiência de CβS gera alterações significativas na composição corporal – observou-se redução do percentual de gordura independentemente do IMC. Este pode ser um mecanismo patogênico importante envolvido na etiologia da 2 osteoporose na homocistinúria clássica, mas estudos adicionais são necessários para demonstrar esta relação. Os achados sugerem que as mutações patogênicas no gene CBS sejam raras ou privadas nesta amostra, e não corroboram a ação dos genes MTHFR e F5 como modificadores da doença. / Introduction: Classical homocystinuria is an inborn error of metabolism caused by the deficient activity of cystathionine β-synthase (CβS). It is characterized by plasma increase in homocysteine and methionine and a decrease in cysteine levels. Its classical clinical manifestations involve the following systems: ocular, vascular, central nervous, and skeletal. However, recent observations have suggested that changes in the body composition, especially a reduction of the adipose tissue, may also be a frequent manifestation of the disease and clinically relevant to it. Moreover, the severity of its clinical phenotype may be influenced by other genes besides CβS. The objective of the present study was to investigate alterations in the body composition and to detect common mutations in CβS, MTHFR and F5 genes in patients with classical homocystinuria and to correlate them to the clinical, biochemical, and genetic data. Methods: Body composition was assessed in 8 patients using the techniques of anthropometry (measurement of the following skinfolds: triciptal, biciptal, subscapular, and suprailiac) and electrical bioimpedance (BIA). Based on the results obtained, the percentage of body fat was calculated using the formulas of Siri (anthropometry) and Kushner (BIA). The body mass index (BMI) was also calculated. The levels of methionine, homocysteine, and cysteine were measured by HPLC. The genotypic evaluation was done in 11 patients by PCR-RFLP. The following mutations were investigated: p.I278T, p.T191M, p.G307S, and c.844ins68 in the CβS gene; c.677TC>T and c.1298A>C in the MTHFR gene; and p.R506Q in the F5 gene (Factor V Leiden). Results: Five patients presented low percentage of body fat by at least one of the methods; the other patients presented a medium percentage. According to the BMI, only 2 patients were classified as being underweight. The percentage of total body fat was not related to either bone or biochemical findings, but the isolate measurement of the triciptal skinfold was positively correlated to the levels of cysteine (p=0.03). Also, the levels of homocysteine and methionine were negatively correlated to the BMI, while cysteine had a positive association (p<0.05). The T score of the femur tended to associate negatively with homocysteine and positively with cysteine (p=0.09). The genetic evaluation revealed only one pathogenic mutation in CβS (p.I278T). An association between mutations in MTHFR and F5 and phenotype severity could not be established. Conclusions: The present results suggest that the deficiency of CβS causes significant alterations in the body composition; a reduction of the percentage of body fat was observed independently from the BMI. This may be an important pathogenic mechanism involved in the etiology of osteoporosis in classical homocystinuria. The present findings suggest that in this sample the 4 pathogenic mutations in the CBS gene are rare or private and do not corroborate with the action of the MTHFR and F5 genes as disease modifiers. Further studies are needed.

Sabe-se que concentrações elevadas de homocisteína (Hcy) estão associadas com o aumento do risco de doenças cardiovasculares e com o dano celular causado pela formação das espécies ativas de oxigênio (EAO). Sabe-se também que o estrogênio atua como antioxidante não enzimático envolvido na proteção cardiovascular. Foram objetivos deste trabalho avaliar o efeito da homocistinúria sobre parâmetros de estresse oxidativo em tecido cardíaco; e avaliar o efeito da hiperhomocisteinemia (HHcy) sobre parâmetros de estresse oxidativo e hemodinâmicos em ratas com e sem estrogênio. Este trabalho foi divido em 4 experimentos. No experimento 1 foram utilizados 16 animais divididos em 2 grupos (n= 8/grupo): controle e Hcy. Estes animais receberam tratamento crônico do 6° dia ao 28° dia de vida com doses crescentes de Hcy e foram mortos 1 hora após a última dose.No experimento 2 foram utilizados 30 ratos, divididos em 4 grupos: Salina (n=8); Folato (n=6); Hcy (n=9) e Folato+Hcy (n=7). Estes animais receberam ácido fólico e/ou Hcy do 6° ao 28º dias de vida e foram mortos aos 80 dias de vida. No experimento 3, foram utilizados 64 animais divididos em 6 grupos (n= 8/grupo): NAIVE; NAIVE+Hcy; Sham; Sham+Hcy; castrada e castrada+Hcy. Estes animais foram castrados no 50° dia de vida e, após uma semana, receberam tratamento agudo com Hcy de 8 em 8 horas por 72 horas e foram mortos 1 hora após a última dose. No experimento 4, foram utilizados 32 animais divididos em 4 grupos (n= 8/grupo): controle, castrado, metionina e castrado+metionina. Estes animais foram castrados no 70° dia de vida, receberam metionina na água de beber por 30 dias e foram mortos logo após o final do tratamento. No modelo de homocistinúria (experimento 1), não foram observadas alterações na lipoperoxidação (LPO) cardíaca nos ratos com 28 dias. No entanto, as atividades das enzimas antioxidantes SOD e GST estavam aumentadas no grupo Hcy. Como este é um tratamento crônico, provavelmente estas enzimas estão aumentadas de forma a minimizar o dano oxidativo causado pela Hcy. Já no experimento 2, avaliou-se o efeito da Hhcy a longo prazo, em animais com 80 dias. Houve aumento na LPO dos animais tratados com Hcy que foi previnida com a administração de folato. A redução da LPO na presença do folato confirma sua capacidade de minimizar o dano causado pela Hcy. Observamos ainda adiminuição na atividade das enzimas GST e catalase nos animais tratados com Hcy o que resultaria em aumento da concentração de peróxido de hidrogênio no tecido cardíaco. O tratamento com folato previniu a atividade das enzimas antioxidantes. A partir dos resultados encontrados, podemos sugerir que os níveis de Hcy podem ser reduzidos com folato, uma vez que altas doses de folato reduziram consideravelmente os níveis de estresse oxidativo gerado pela Hcy. No modelo de HHcy aguda (experimento 3), o estresse oxidativo cardíaco aumentou em função da administração de Hcy no grupo sem estrogênio. Este resultado se correlaciona positivamente com a pressão arterial (PA), ou seja, os animais com maior LPO também apresentaram uma maior PA. Este efeito não foi observado nos grupos com níveis estrogênicos fisiológicos. Acredita-se que estes resultados sejam devidos à proteção antioxidante oferecida pelo estrogênio. Além disso, observamos uma diminuição na atividade da GST nos animais castrados+Hcy, o que pode estar contribuindo para o dano oxidativo observado. Já no modelo de HHcy causado pelo consumo de metionina (experimento 4), observamos um aumento na PDFVE no grupo castrado+metionina que se correlaciona negativamente com os metabólitos do NO. Este resultado mostra que os animais que tiveram disfunção ventricular apresentaram uma menor biodisponibilidade do NO. Neste modelo observamos também um aumento no dano oxidativo cardíaco em função da administração de metionina no grupo sem estrogênio. Este resultado se correlaciona positivamente com a PDFVE, ou seja, os animais com maior LPO também apresentam uma maior pressão ventricular diastólica, indicando uma possível participação do estresse oxidativo na disfunção ventricular. Estes animais ainda apresentaram um aumento na atividade das enzimas antioxidantes GST e GPx no grupo castrado+metionina, sugerindo que o tratamento crônico levou a uma adaptação do sistema antioxidante enzimático na ausência do estrogênio. / It is known that high concentrations of homocysteine (Hcy) are associated with the increase of risk of cardiovascular disease and of cellular damage caused by the formation of reactive oxygen species (ROS). It is also known that the estrogen acts as a non enzymatic antioxidant involved in cardiovascular protection. In this work we evaluated the effect of homocystinuria on myocardial oxidative stress parameters, and the effect of hyperhomocysteinemia (HHcy) on the same parameters and also on hemodynamics in rats with and without estrogen. Four experiments were performed. In experiment number one, sixteen animals were divided in 2 groups (n=8/group): control and Hcy. These animals received chronic treatment from the 6th to the 28th day of life with increasing doses of Hcy and were killed one hour after the last dose. In the second experiment, thirty rats were divided into four groups: Saline (n=8); Folate (n=6); Hcy (n=9) and Folate+Hcy (n=7).These animals had received folic acid and/or Hcy from the 6th to the 28th day of life and had been killed with 80 days of life. In the third experiment, fourty eight animals were divided in 6 groups (n=8/group): NAIVE; NAIVE+Hcy; Sham; Sham+Hcy; castrated and castrated+Hcy. These animals were castrated in the 50th day of life and, after one week, they received an acute treatment with Hcy for 72 hours at each eight hours and were killed one hour after the last dose. In the fourth experiment, thirty two animals were divided into four groups (n=8/group): control, castrated, methionine and castrated+methionine. These animals had been castrated in the 70th day of life, and received methionine in drinking water for 30 days and were killed at the end of treatment. In the homocystinuria model (experiment number one), there were no signs of alterations in lipid peroxidation (LPO) in 28 day rats. However, antioxidant enzyme activities of SOD and GST were increased in Hcy group. As this is a chronic treatment, probably these enzymes are increased to minimize the oxidative damage caused by Hcy. In the second experiment, the effect of the homocystinuria was evaluated in animals with 80 days. It was observed an increase in LPO in the animals that had received Hcy, but it returned to control values with folate administration. The reduction of LPO in the presence of folate confirms its capacity of minimize the damage caused by Hcy. We also observedreduction in the enzyme activities of GST and catalase in the animals receiving Hcy, which also returned to the control values with the administration of folate. It is possible that Hcy increases the hydrogen peroxide concnetration in the myocardium of these animals. From the results obtained, we can suggest that the levels of Hcy can be reduced with folate, since high doses of folate had significantly reduced the levels of oxidative stress caused by Hcy. In the acute model of HHcy (experiment number three), myocardial oxidative stress increased due to the administration of Hcy in the group without estrogen. This result has a positive correlation with mean arterial pressure (MAP), that is, the higher LPO, the higher MAP. This effect was not observed in groups with physiological estrogens levels. It is possible that these findings are related to the antioxidant protection offered by estrogen. Moreover, we observed a reduction in the activity of GST in the group castrated+Hcy, which can be contributing for the oxidative damage observed. In the HHcy model caused by the consumption of methionine (experiment number four), we observedThis result has a negative correlation with the nitric oxide metabolites (Nox) showing that the animals that had an increased ventricular diastolic pressure had presented lesser NO bioavailability. In this model we also observed an increase in the myocardial oxidative stress due to the administration of methionine in the group without estrogen. This result has a positive correlation with LVEDP, that is, the animals with enhanced LPO also presented high ventricular diastolic pressure, indicating a possible participation of oxidative stress in ventricular dysfunction. These animals also presented an increase in the activities of GST and GPx in group castrated+methionine, suggesting that chronic treatment with methionine leads to an adaptation of the enzymatic antioxidant system in the absence of the estrogen.

Introdução: A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo causado pela atividade deficiente da cistationina β-sintase (CβS). É caracterizada pela elevação sérica de homocisteína e metionina e redução dos níveis de cisteína. As manifestações clínicas clássicas envolvem os sistemas ocular, vascular, nervoso central e ósseo. Entretanto, observações recentes sugerem que alterações na composição corporal, especialmente a redução de tecido adiposo, também pode ser uma manifestação frequente e clinicamente relevante nesta doença. Além disso, a gravidade do fenótipo clínico parece ser influenciada por outros genes além do CβS. O objetivo deste estudo foi investigar alterações na composição corporal e detectar mutações comuns nos genes CβS, MTHFR e F5 em pacientes com homocistinúria clássica; relacionando dados clínicos, bioquímicos e genéticos. Métodos: Realizada avaliação da composição corporal em 8 pacientes através de duas técnicas: antropometria (aferição das dobras cutâneas triciptal, biciptal, subescapular e suprailíaca) e bioimpedância elétrica (BIA). A partir dos resultados obtidos, calculou-se o percentual de gordura pelas fórmulas de Siri (antropometria) e Kushner (BIA). O índice de massa corporal (IMC) também foi calculado. Os níveis de metionina, homocisteína e cisteína foram mensurados por HPLC. A avaliação genotípica foi realizada em 11 pacientes através de PCR-RFLP. Pesquisadas as mutações p.I278T, p.T191M, p.G307S e c.844ins68 no gene CβS; c.677TC>T e c.1298A>C no gene MTHFR; e p.R506Q no gene F5 (Fator V de Leiden). Resultados: Cinco pacientes apresentaram baixo percentual de gordura por pelo menos um dos métodos; o restante apresentou percentual médio. De acordo com o IMC, apenas dois pacientes foram classificados em baixo peso. O percentual de gordura total não se relacionou com os achados bioquímicos ou ósseos, mas medida isolada da dobra cutânea triciptal correlacionou-se positivamente com os níveis de cisteína (p=0,03) Além disso, os níveis de homocisteína e metionina correlacionaram-se negativamente com o IMC, enquanto que a cisteína teve associação positiva (p<0.05). Houve tendência do escore T de fêmur associar-se negativamente com homocisteína e positivamente com cisteína (p=0,09). Entre as mutações do gene CβS, a p.1278T foi a única encontrada (n= 3/9 famílias); entretanto, em 2/3 famílias estava em cis com a c.844ins68. Assim, em apenas um caso tinha caráter patogênico. Não foi possível estabelecer associação entre mutações em MTHFR e F5 e a gravidade do fenótipo. Conclusões: Os resultados sugerem que deficiência de CβS gera alterações significativas na composição corporal – observou-se redução do percentual de gordura independentemente do IMC. Este pode ser um mecanismo patogênico importante envolvido na etiologia da 2 osteoporose na homocistinúria clássica, mas estudos adicionais são necessários para demonstrar esta relação. Os achados sugerem que as mutações patogênicas no gene CBS sejam raras ou privadas nesta amostra, e não corroboram a ação dos genes MTHFR e F5 como modificadores da doença. / Introduction: Classical homocystinuria is an inborn error of metabolism caused by the deficient activity of cystathionine β-synthase (CβS). It is characterized by plasma increase in homocysteine and methionine and a decrease in cysteine levels. Its classical clinical manifestations involve the following systems: ocular, vascular, central nervous, and skeletal. However, recent observations have suggested that changes in the body composition, especially a reduction of the adipose tissue, may also be a frequent manifestation of the disease and clinically relevant to it. Moreover, the severity of its clinical phenotype may be influenced by other genes besides CβS. The objective of the present study was to investigate alterations in the body composition and to detect common mutations in CβS, MTHFR and F5 genes in patients with classical homocystinuria and to correlate them to the clinical, biochemical, and genetic data. Methods: Body composition was assessed in 8 patients using the techniques of anthropometry (measurement of the following skinfolds: triciptal, biciptal, subscapular, and suprailiac) and electrical bioimpedance (BIA). Based on the results obtained, the percentage of body fat was calculated using the formulas of Siri (anthropometry) and Kushner (BIA). The body mass index (BMI) was also calculated. The levels of methionine, homocysteine, and cysteine were measured by HPLC. The genotypic evaluation was done in 11 patients by PCR-RFLP. The following mutations were investigated: p.I278T, p.T191M, p.G307S, and c.844ins68 in the CβS gene; c.677TC>T and c.1298A>C in the MTHFR gene; and p.R506Q in the F5 gene (Factor V Leiden). Results: Five patients presented low percentage of body fat by at least one of the methods; the other patients presented a medium percentage. According to the BMI, only 2 patients were classified as being underweight. The percentage of total body fat was not related to either bone or biochemical findings, but the isolate measurement of the triciptal skinfold was positively correlated to the levels of cysteine (p=0.03). Also, the levels of homocysteine and methionine were negatively correlated to the BMI, while cysteine had a positive association (p<0.05). The T score of the femur tended to associate negatively with homocysteine and positively with cysteine (p=0.09). The genetic evaluation revealed only one pathogenic mutation in CβS (p.I278T). An association between mutations in MTHFR and F5 and phenotype severity could not be established. Conclusions: The present results suggest that the deficiency of CβS causes significant alterations in the body composition; a reduction of the percentage of body fat was observed independently from the BMI. This may be an important pathogenic mechanism involved in the etiology of osteoporosis in classical homocystinuria. The present findings suggest that in this sample the 4 pathogenic mutations in the CBS gene are rare or private and do not corroborate with the action of the MTHFR and F5 genes as disease modifiers. Further studies are needed.