A hiper-homocisteinemia leve é um fator de risco para doenças cerebrais e cardiovasculares embora os mecanismos subjacentes a essas alterações não estejam completamente elucidados. O objetivo principal desta tese de doutorado foi desenvolver um modelo experimental crônico quimicamente induzido de hiper-homocisteinemia leve em ratos adultos. Usando esse modelo, investigamos alguns parâmetros bioquímicos no sistema nervoso central e periférico, a fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos na toxicidade mediada pela homocisteína. A hiper-homocisteinemia leve foi induzida em ratos Wistar através da administração subcutânea de homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal), duas vezes ao dia, do 30° a 60° dia de vida. Ratos controle receberam o mesmo volume de solução salina. Resultados demonstraram que animais submetidos a esse modelo apresentaram níveis plasmáticos de homocisteína de aproximadamente 30 μM. Em relação aos parâmetros bioquímicos, a hiper-homocisteinemia leve experimental induziu estresse oxidativo em plasma, córtex cerebral, coração e aorta, bem como diminuiu a atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas α1 e α2 da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral e hipocampo de ratos adultos. Por outro lado, não foram observadas alterações nos níveis de mRNA transcrito da Na+,K+-ATPase em nenhuma estrutura cerebral estudada. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi significativamente diminuída em linfócitos e sinaptossomas obtidos de córtex cerebral, mas não foi alterada em soro de ratos adultos. A transcrição da ecto-5'-nucleotidase foi significativamente reduzida, mas a expressão das E-NTPDases não foi alterada em linfonodos mesentéricos de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve experimental. Foi observado um aumento nos níveis de mRNA transcrito da E-NTPDase1 e ecto-5'-nucleotidase em córtex cerebral de ratos. Os níveis de ATP foram aumentados, enquanto a adenosina foi diminuída no líquor de ratos tratados com homocisteína. Em relação aos parâmetros inflamatórios, foi observado um aumento nos níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e a quimiocina MCP-1 no hipocampo, enquanto os níveis de IL-1β e a IL-6 foram aumentados em córtex cerebral. Os ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve apresentaram um aumento na atividade da acetilcolinesterase em ambas as estruturas cerebrais testadas; o imunoconteúdo dessa enzima foi significativamente aumentado no córtex cerebral e diminuído no hipocampo, enquanto os níveis de mRNA transcrito da acetilcolinesterase não foram alterados. Perifericamente, a homocisteína aumentou os níveis de TNF-α, IL-6 e MCP-1 em coração e os níveis de IL-6 no soro, mas não alterou a atividade da enzima butirilcolinesterase. Em conjunto, os resultados deste trabalho mostram que a homocisteína promove um estado oxidativo e inflamatório central e periférico além de prejudicar a funcionalidade de enzimas cerebrais importantes. Considerando que a hiper-homocisteinemia leve é prevalente na população e tem sido considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cerebrais e cardíacas, o presente modelo experimental pode ser útil na investigação da patofisiologia de doenças causadas pela homocisteína e estratégias de prevenção. / Mild hyperhomocysteinemia is a risk factor for cerebral and cardiovascular diseases although the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to develop a chronic chemically-induced model of mild hyperhomocysteinemia in adult rats. By using this model, we investigated some biochemical parameters in the central nervous system and peripheral, in order to better understand the mechanisms involved in homocysteine-mediated toxicity. The mild hyperhomocysteinemia was induced in rats by subcutaneous administration of homocysteine (0.03 μmol/g body weight) twice a day to the 30th to 60 day of life. Control rats received the same volume of saline. Results showed that animals subjected to this model had plasma homocysteine levels of approximately 30 μM. Results demonstrated that the experimental mild hyperhomocysteinemia elicited oxidative stress in plasma, cerebral cortex, heart and aorta and decreased the activity and the immunocontent of the α1 and α2 subunits of the Na+,K+-ATPase in cerebral cortex and hippocampus of adult rats. On the other hand, no change in levels of Na+,K+-ATPase mRNA transcripts in such cerebral structures. ATP, ADP and AMP hydrolysis were significantly decreased in lymphocytes and in the synaptosomal fraction of cerebral cortex, without any alteration in serum of adult rats. The transcript of the ecto-5'-nucleotidase was significantly reduced, but the expression of E-NTPDases were not altered in mesenteric lymph nodes of hyperhomocysteinemic rats. I have been observed an increase in E-NTPDase1 and ecto-5′-nucleotidase transcripts in rat cerebral cortex. ATP levels were increased, while adenosine decreased in cerebrospinal fluid of Hcy-treated rats. In relation to inflammatory parameters, was observed an increase in TNF-α, IL-1β, IL-6 and the chemokine MCP-1 in the hippocampus, while IL-1β and IL-6 levels were enhanced in cerebral cortex. Rats subjected to mild hyperhomocysteinemia presented an increase in acetylcholinesterase activity in both cerebral structures tested; the immunocontent of this enzyme was significantly increased in the cerebral cortex and decreased in the hippocampus while levels of acetylcholinesterase mRNA transcripts were not altered. Peripherally, homocysteine increased TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels in the heart and IL-6 levels in serum, but not altered the butyrylcholinesterase activity. Together, the results of this work show that homocysteine promotes central and peripheral oxidative and inflammatory state besides affecting the functionality of important brain enzymes. Whereas mild hyperhomocysteinemia is prevalent in the population and has been considered a risk factor for the development of brain and heart diseases, this experimental model may be useful for the investigation of patophysiology of diseases caused by homocysteine and prevention strategies.

A hiper-homocisteinemia leve é um fator de risco para doenças cerebrais e cardiovasculares embora os mecanismos subjacentes a essas alterações não estejam completamente elucidados. O objetivo principal desta tese de doutorado foi desenvolver um modelo experimental crônico quimicamente induzido de hiper-homocisteinemia leve em ratos adultos. Usando esse modelo, investigamos alguns parâmetros bioquímicos no sistema nervoso central e periférico, a fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos na toxicidade mediada pela homocisteína. A hiper-homocisteinemia leve foi induzida em ratos Wistar através da administração subcutânea de homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal), duas vezes ao dia, do 30° a 60° dia de vida. Ratos controle receberam o mesmo volume de solução salina. Resultados demonstraram que animais submetidos a esse modelo apresentaram níveis plasmáticos de homocisteína de aproximadamente 30 μM. Em relação aos parâmetros bioquímicos, a hiper-homocisteinemia leve experimental induziu estresse oxidativo em plasma, córtex cerebral, coração e aorta, bem como diminuiu a atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas α1 e α2 da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral e hipocampo de ratos adultos. Por outro lado, não foram observadas alterações nos níveis de mRNA transcrito da Na+,K+-ATPase em nenhuma estrutura cerebral estudada. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi significativamente diminuída em linfócitos e sinaptossomas obtidos de córtex cerebral, mas não foi alterada em soro de ratos adultos. A transcrição da ecto-5'-nucleotidase foi significativamente reduzida, mas a expressão das E-NTPDases não foi alterada em linfonodos mesentéricos de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve experimental. Foi observado um aumento nos níveis de mRNA transcrito da E-NTPDase1 e ecto-5'-nucleotidase em córtex cerebral de ratos. Os níveis de ATP foram aumentados, enquanto a adenosina foi diminuída no líquor de ratos tratados com homocisteína. Em relação aos parâmetros inflamatórios, foi observado um aumento nos níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e a quimiocina MCP-1 no hipocampo, enquanto os níveis de IL-1β e a IL-6 foram aumentados em córtex cerebral. Os ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve apresentaram um aumento na atividade da acetilcolinesterase em ambas as estruturas cerebrais testadas; o imunoconteúdo dessa enzima foi significativamente aumentado no córtex cerebral e diminuído no hipocampo, enquanto os níveis de mRNA transcrito da acetilcolinesterase não foram alterados. Perifericamente, a homocisteína aumentou os níveis de TNF-α, IL-6 e MCP-1 em coração e os níveis de IL-6 no soro, mas não alterou a atividade da enzima butirilcolinesterase. Em conjunto, os resultados deste trabalho mostram que a homocisteína promove um estado oxidativo e inflamatório central e periférico além de prejudicar a funcionalidade de enzimas cerebrais importantes. Considerando que a hiper-homocisteinemia leve é prevalente na população e tem sido considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cerebrais e cardíacas, o presente modelo experimental pode ser útil na investigação da patofisiologia de doenças causadas pela homocisteína e estratégias de prevenção. / Mild hyperhomocysteinemia is a risk factor for cerebral and cardiovascular diseases although the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to develop a chronic chemically-induced model of mild hyperhomocysteinemia in adult rats. By using this model, we investigated some biochemical parameters in the central nervous system and peripheral, in order to better understand the mechanisms involved in homocysteine-mediated toxicity. The mild hyperhomocysteinemia was induced in rats by subcutaneous administration of homocysteine (0.03 μmol/g body weight) twice a day to the 30th to 60 day of life. Control rats received the same volume of saline. Results showed that animals subjected to this model had plasma homocysteine levels of approximately 30 μM. Results demonstrated that the experimental mild hyperhomocysteinemia elicited oxidative stress in plasma, cerebral cortex, heart and aorta and decreased the activity and the immunocontent of the α1 and α2 subunits of the Na+,K+-ATPase in cerebral cortex and hippocampus of adult rats. On the other hand, no change in levels of Na+,K+-ATPase mRNA transcripts in such cerebral structures. ATP, ADP and AMP hydrolysis were significantly decreased in lymphocytes and in the synaptosomal fraction of cerebral cortex, without any alteration in serum of adult rats. The transcript of the ecto-5'-nucleotidase was significantly reduced, but the expression of E-NTPDases were not altered in mesenteric lymph nodes of hyperhomocysteinemic rats. I have been observed an increase in E-NTPDase1 and ecto-5′-nucleotidase transcripts in rat cerebral cortex. ATP levels were increased, while adenosine decreased in cerebrospinal fluid of Hcy-treated rats. In relation to inflammatory parameters, was observed an increase in TNF-α, IL-1β, IL-6 and the chemokine MCP-1 in the hippocampus, while IL-1β and IL-6 levels were enhanced in cerebral cortex. Rats subjected to mild hyperhomocysteinemia presented an increase in acetylcholinesterase activity in both cerebral structures tested; the immunocontent of this enzyme was significantly increased in the cerebral cortex and decreased in the hippocampus while levels of acetylcholinesterase mRNA transcripts were not altered. Peripherally, homocysteine increased TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels in the heart and IL-6 levels in serum, but not altered the butyrylcholinesterase activity. Together, the results of this work show that homocysteine promotes central and peripheral oxidative and inflammatory state besides affecting the functionality of important brain enzymes. Whereas mild hyperhomocysteinemia is prevalent in the population and has been considered a risk factor for the development of brain and heart diseases, this experimental model may be useful for the investigation of patophysiology of diseases caused by homocysteine and prevention strategies.

A hiper-homocisteinemia leve é um fator de risco para doenças cerebrais e cardiovasculares embora os mecanismos subjacentes a essas alterações não estejam completamente elucidados. O objetivo principal desta tese de doutorado foi desenvolver um modelo experimental crônico quimicamente induzido de hiper-homocisteinemia leve em ratos adultos. Usando esse modelo, investigamos alguns parâmetros bioquímicos no sistema nervoso central e periférico, a fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos na toxicidade mediada pela homocisteína. A hiper-homocisteinemia leve foi induzida em ratos Wistar através da administração subcutânea de homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal), duas vezes ao dia, do 30° a 60° dia de vida. Ratos controle receberam o mesmo volume de solução salina. Resultados demonstraram que animais submetidos a esse modelo apresentaram níveis plasmáticos de homocisteína de aproximadamente 30 μM. Em relação aos parâmetros bioquímicos, a hiper-homocisteinemia leve experimental induziu estresse oxidativo em plasma, córtex cerebral, coração e aorta, bem como diminuiu a atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas α1 e α2 da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral e hipocampo de ratos adultos. Por outro lado, não foram observadas alterações nos níveis de mRNA transcrito da Na+,K+-ATPase em nenhuma estrutura cerebral estudada. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi significativamente diminuída em linfócitos e sinaptossomas obtidos de córtex cerebral, mas não foi alterada em soro de ratos adultos. A transcrição da ecto-5'-nucleotidase foi significativamente reduzida, mas a expressão das E-NTPDases não foi alterada em linfonodos mesentéricos de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve experimental. Foi observado um aumento nos níveis de mRNA transcrito da E-NTPDase1 e ecto-5'-nucleotidase em córtex cerebral de ratos. Os níveis de ATP foram aumentados, enquanto a adenosina foi diminuída no líquor de ratos tratados com homocisteína. Em relação aos parâmetros inflamatórios, foi observado um aumento nos níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e a quimiocina MCP-1 no hipocampo, enquanto os níveis de IL-1β e a IL-6 foram aumentados em córtex cerebral. Os ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve apresentaram um aumento na atividade da acetilcolinesterase em ambas as estruturas cerebrais testadas; o imunoconteúdo dessa enzima foi significativamente aumentado no córtex cerebral e diminuído no hipocampo, enquanto os níveis de mRNA transcrito da acetilcolinesterase não foram alterados. Perifericamente, a homocisteína aumentou os níveis de TNF-α, IL-6 e MCP-1 em coração e os níveis de IL-6 no soro, mas não alterou a atividade da enzima butirilcolinesterase. Em conjunto, os resultados deste trabalho mostram que a homocisteína promove um estado oxidativo e inflamatório central e periférico além de prejudicar a funcionalidade de enzimas cerebrais importantes. Considerando que a hiper-homocisteinemia leve é prevalente na população e tem sido considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cerebrais e cardíacas, o presente modelo experimental pode ser útil na investigação da patofisiologia de doenças causadas pela homocisteína e estratégias de prevenção. / Mild hyperhomocysteinemia is a risk factor for cerebral and cardiovascular diseases although the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to develop a chronic chemically-induced model of mild hyperhomocysteinemia in adult rats. By using this model, we investigated some biochemical parameters in the central nervous system and peripheral, in order to better understand the mechanisms involved in homocysteine-mediated toxicity. The mild hyperhomocysteinemia was induced in rats by subcutaneous administration of homocysteine (0.03 μmol/g body weight) twice a day to the 30th to 60 day of life. Control rats received the same volume of saline. Results showed that animals subjected to this model had plasma homocysteine levels of approximately 30 μM. Results demonstrated that the experimental mild hyperhomocysteinemia elicited oxidative stress in plasma, cerebral cortex, heart and aorta and decreased the activity and the immunocontent of the α1 and α2 subunits of the Na+,K+-ATPase in cerebral cortex and hippocampus of adult rats. On the other hand, no change in levels of Na+,K+-ATPase mRNA transcripts in such cerebral structures. ATP, ADP and AMP hydrolysis were significantly decreased in lymphocytes and in the synaptosomal fraction of cerebral cortex, without any alteration in serum of adult rats. The transcript of the ecto-5'-nucleotidase was significantly reduced, but the expression of E-NTPDases were not altered in mesenteric lymph nodes of hyperhomocysteinemic rats. I have been observed an increase in E-NTPDase1 and ecto-5′-nucleotidase transcripts in rat cerebral cortex. ATP levels were increased, while adenosine decreased in cerebrospinal fluid of Hcy-treated rats. In relation to inflammatory parameters, was observed an increase in TNF-α, IL-1β, IL-6 and the chemokine MCP-1 in the hippocampus, while IL-1β and IL-6 levels were enhanced in cerebral cortex. Rats subjected to mild hyperhomocysteinemia presented an increase in acetylcholinesterase activity in both cerebral structures tested; the immunocontent of this enzyme was significantly increased in the cerebral cortex and decreased in the hippocampus while levels of acetylcholinesterase mRNA transcripts were not altered. Peripherally, homocysteine increased TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels in the heart and IL-6 levels in serum, but not altered the butyrylcholinesterase activity. Together, the results of this work show that homocysteine promotes central and peripheral oxidative and inflammatory state besides affecting the functionality of important brain enzymes. Whereas mild hyperhomocysteinemia is prevalent in the population and has been considered a risk factor for the development of brain and heart diseases, this experimental model may be useful for the investigation of patophysiology of diseases caused by homocysteine and prevention strategies.

A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo, bioquimicamente caracterizado pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, o que promove um bloqueio na via de transulfuração da homocisteína e, consequente acúmulo tecidual desse aminoácido. Clinicamente, os pacientes apresentam retardo mental, déficit cognitivo, crises convulsivas, alterações vasculares, esqueléticas, oculares, hepáticas, e pulmonares, cuja fisiopatologia não está totalmente elucidada. O objetivo geral da presente tese foi avaliar o efeito da hiper-homocisteinemia severa sobre parâmetros inflamatórios (citocinas, quimiocinas, óxido nítrico, proteínas de fase aguda e contagem diferencial de leucócitos) e outros parâmetros relacionados, tais como o sistema da coagulação, o estresse oxidativo e, as vias de sinalização da Akt e GSK-3β no cérebro e/ou sangue de ratos. Além disso, investigamos o efeito do estresse oxidativo em pulmão de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia severa. A hiperhomocisteinemia aguda aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de nitritos no hipocampo e no córtex cerebral de ratos. Os níveis de TNF-α e IL-6 também aumentaram no soro de ratos submetidos à administração aguda de homocísteina. A percentagem de neutrófilos e monócitos aumentou no sangue após a administração aguda de homocisteína; entretanto, não observamos alterações nos níveis das proteínas de fase aguda (PCR e α1- glicoproteína ácida). A hiper-homocisteinemia crônica severa também aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de prostaglandina E2 no hipocampo e/ou soro de ratos. Os níveis de nitritos aumentaram no hipocampo, mas verificamos uma diminuição em seus níveis no soro após a hiper-homocisteinemia crônica. O imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a atividade da acetilcolinesterase aumentaram no hipocampo de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia crônica. Demonstramos também que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a contagem de plaquetas no sangue e os níveis de fibrinogênio no plasma. O tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada e os níveis de nitritos no plasma diminuíram após a administração aguda de homocisteína. Mostramos que a hiperhomocisteinemia aguda severa aumentou as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, um índice de peroxidação lipídica e, diminuiu a atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase e glutationa peroxidase e aumentou a atividade da enzima catalase em eritrócitos de ratos. Em relação ao envolvimento das vias de sinalização, demonstramos que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a fosforilação da Akt, o imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a fosforilação da proteína Tau, mas reduziu a fosforilação da GSK-3β após a administração aguda de homocisteína. Por outro lado, a hiper-homocisteinemia crônica severa não alterou a fosforilação da Akt e GSK-3β após a administração crônica desse aminoácido. Além disso, demonstramos que a hiper-homocisteinemia crônica severa aumentou a peroxidação lipídica e, reduziu as defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas em pulmão de ratos. Em resumo, nossos resultados demonstram que a inflamação, a hipercoagulabilidade e o estresse oxidativo podem ocorrer após a hiper-homocisteinemia severa, o que pode estar associado, pelo menos em parte, com as alterações cerebrais e cardiovasculares, bem como no tromboembolismo pulmonar que estão presentes em alguns pacientes homocistinúricos. / Classical homocystinuria, an inborn error of metabolism, is biochemically characterized by cystathionine -synthase deficiency and homocysteine tissue accumulation. Mental retardation, cognitive deficiency, seizures, vascular, skeletal, ocular, hepatic and pulmonary complications are common symptoms in homocystinuric patients. However, the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to investigate the effect of severe hyperhomocysteinemia on inflammatory parameters (cytokines, chemokines, nitric oxide, acute phase-proteins and a differential count of leukocytes) and other related parameters, such as the coagulation system, oxidative stress as well as the involvement of the Akt and GSK-3β pathway in the brain and/or blood of rats. In addition, we investigated the effect of oxidative stress in the lungs of rats submitted to severe hyperhomocysteinemia. Acute hyperhomocysteinemia increased proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and nitrite levels in hippocampus and cerebral cortex of rats. TNF-α and IL-6 levels also increased in serum of rats subjected to acute homocysteine administration. The percentage of neutrophils and monocytes increased in blood after acute homocysteine administration, but acute phase-proteins (CRP and α1-acid glycoprotein) were not altered by homocysteine administration. In addition, we showed that chronic hyperhomocysteinemia increased pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and prostaglandin E2 levels in the hippocampus and/or serum of rats. Nitrite levels increased in the hippocampus, but decreased in the serum after chronic homocysteine administration. The immunocontent of cytosolic and nuclear NF-κB/p65 subunit and the acetylcholinesterase activity were increased in the hippocampus of rats subjected to chronic hyperhomocysteinemia. Next, we demonstrated that acute hyperhomocysteinemia increased the platelet counts in the blood and plasma fibrinogen levels of rats. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, and nitrite levels decreased in plasma after acute hyperhomocysteinemia. Additionally, we showed that acute hyperhomocysteinemia increased thiobarbituric acid-reactive, an index of lipid peroxidation, and decreased the superoxide dismutase and gluthatione peroxidase activity and also increased the catalase activity in erythrocytes of rats. Moreover, acute hyperhomocysteinemia increases Akt phosphorylation, cytosolic and nuclear immunocontent of NF-κβ/p65 subunit and Tau protein phosphorylation, but reduces GSK-3β phosphorylation after acute homocysteine administration. On the other hand, chronic hyperhomocysteinemia did not alter Akt and GSK-3β phosphorylation after the chronic administration of this amino acid. We also showed that chronic hyperhomocysteinemia increased lipid peroxidation, and disrupted antioxidant defenses (enzymatic and non-enzymatic) in the lungs of rats. In summary, our findings showed that inflammation, hypercoagulability and oxidative stress can occur after severe hyperhomocysteinemia, possibly in association, at least in part, with cerebral and cardiovascular dysfunction, as well as pulmonary thromboembolism complications observed in some homocystinuric patients.

A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo, bioquimicamente caracterizado pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, o que promove um bloqueio na via de transulfuração da homocisteína e, consequente acúmulo tecidual desse aminoácido. Clinicamente, os pacientes apresentam retardo mental, déficit cognitivo, crises convulsivas, alterações vasculares, esqueléticas, oculares, hepáticas, e pulmonares, cuja fisiopatologia não está totalmente elucidada. O objetivo geral da presente tese foi avaliar o efeito da hiper-homocisteinemia severa sobre parâmetros inflamatórios (citocinas, quimiocinas, óxido nítrico, proteínas de fase aguda e contagem diferencial de leucócitos) e outros parâmetros relacionados, tais como o sistema da coagulação, o estresse oxidativo e, as vias de sinalização da Akt e GSK-3β no cérebro e/ou sangue de ratos. Além disso, investigamos o efeito do estresse oxidativo em pulmão de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia severa. A hiperhomocisteinemia aguda aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de nitritos no hipocampo e no córtex cerebral de ratos. Os níveis de TNF-α e IL-6 também aumentaram no soro de ratos submetidos à administração aguda de homocísteina. A percentagem de neutrófilos e monócitos aumentou no sangue após a administração aguda de homocisteína; entretanto, não observamos alterações nos níveis das proteínas de fase aguda (PCR e α1- glicoproteína ácida). A hiper-homocisteinemia crônica severa também aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de prostaglandina E2 no hipocampo e/ou soro de ratos. Os níveis de nitritos aumentaram no hipocampo, mas verificamos uma diminuição em seus níveis no soro após a hiper-homocisteinemia crônica. O imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a atividade da acetilcolinesterase aumentaram no hipocampo de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia crônica. Demonstramos também que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a contagem de plaquetas no sangue e os níveis de fibrinogênio no plasma. O tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada e os níveis de nitritos no plasma diminuíram após a administração aguda de homocisteína. Mostramos que a hiperhomocisteinemia aguda severa aumentou as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, um índice de peroxidação lipídica e, diminuiu a atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase e glutationa peroxidase e aumentou a atividade da enzima catalase em eritrócitos de ratos. Em relação ao envolvimento das vias de sinalização, demonstramos que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a fosforilação da Akt, o imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a fosforilação da proteína Tau, mas reduziu a fosforilação da GSK-3β após a administração aguda de homocisteína. Por outro lado, a hiper-homocisteinemia crônica severa não alterou a fosforilação da Akt e GSK-3β após a administração crônica desse aminoácido. Além disso, demonstramos que a hiper-homocisteinemia crônica severa aumentou a peroxidação lipídica e, reduziu as defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas em pulmão de ratos. Em resumo, nossos resultados demonstram que a inflamação, a hipercoagulabilidade e o estresse oxidativo podem ocorrer após a hiper-homocisteinemia severa, o que pode estar associado, pelo menos em parte, com as alterações cerebrais e cardiovasculares, bem como no tromboembolismo pulmonar que estão presentes em alguns pacientes homocistinúricos. / Classical homocystinuria, an inborn error of metabolism, is biochemically characterized by cystathionine -synthase deficiency and homocysteine tissue accumulation. Mental retardation, cognitive deficiency, seizures, vascular, skeletal, ocular, hepatic and pulmonary complications are common symptoms in homocystinuric patients. However, the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to investigate the effect of severe hyperhomocysteinemia on inflammatory parameters (cytokines, chemokines, nitric oxide, acute phase-proteins and a differential count of leukocytes) and other related parameters, such as the coagulation system, oxidative stress as well as the involvement of the Akt and GSK-3β pathway in the brain and/or blood of rats. In addition, we investigated the effect of oxidative stress in the lungs of rats submitted to severe hyperhomocysteinemia. Acute hyperhomocysteinemia increased proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and nitrite levels in hippocampus and cerebral cortex of rats. TNF-α and IL-6 levels also increased in serum of rats subjected to acute homocysteine administration. The percentage of neutrophils and monocytes increased in blood after acute homocysteine administration, but acute phase-proteins (CRP and α1-acid glycoprotein) were not altered by homocysteine administration. In addition, we showed that chronic hyperhomocysteinemia increased pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and prostaglandin E2 levels in the hippocampus and/or serum of rats. Nitrite levels increased in the hippocampus, but decreased in the serum after chronic homocysteine administration. The immunocontent of cytosolic and nuclear NF-κB/p65 subunit and the acetylcholinesterase activity were increased in the hippocampus of rats subjected to chronic hyperhomocysteinemia. Next, we demonstrated that acute hyperhomocysteinemia increased the platelet counts in the blood and plasma fibrinogen levels of rats. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, and nitrite levels decreased in plasma after acute hyperhomocysteinemia. Additionally, we showed that acute hyperhomocysteinemia increased thiobarbituric acid-reactive, an index of lipid peroxidation, and decreased the superoxide dismutase and gluthatione peroxidase activity and also increased the catalase activity in erythrocytes of rats. Moreover, acute hyperhomocysteinemia increases Akt phosphorylation, cytosolic and nuclear immunocontent of NF-κβ/p65 subunit and Tau protein phosphorylation, but reduces GSK-3β phosphorylation after acute homocysteine administration. On the other hand, chronic hyperhomocysteinemia did not alter Akt and GSK-3β phosphorylation after the chronic administration of this amino acid. We also showed that chronic hyperhomocysteinemia increased lipid peroxidation, and disrupted antioxidant defenses (enzymatic and non-enzymatic) in the lungs of rats. In summary, our findings showed that inflammation, hypercoagulability and oxidative stress can occur after severe hyperhomocysteinemia, possibly in association, at least in part, with cerebral and cardiovascular dysfunction, as well as pulmonary thromboembolism complications observed in some homocystinuric patients.

A homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo, bioquimicamente caracterizado pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, o que promove um bloqueio na via de transulfuração da homocisteína e, consequente acúmulo tecidual desse aminoácido. Clinicamente, os pacientes apresentam retardo mental, déficit cognitivo, crises convulsivas, alterações vasculares, esqueléticas, oculares, hepáticas, e pulmonares, cuja fisiopatologia não está totalmente elucidada. O objetivo geral da presente tese foi avaliar o efeito da hiper-homocisteinemia severa sobre parâmetros inflamatórios (citocinas, quimiocinas, óxido nítrico, proteínas de fase aguda e contagem diferencial de leucócitos) e outros parâmetros relacionados, tais como o sistema da coagulação, o estresse oxidativo e, as vias de sinalização da Akt e GSK-3β no cérebro e/ou sangue de ratos. Além disso, investigamos o efeito do estresse oxidativo em pulmão de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia severa. A hiperhomocisteinemia aguda aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de nitritos no hipocampo e no córtex cerebral de ratos. Os níveis de TNF-α e IL-6 também aumentaram no soro de ratos submetidos à administração aguda de homocísteina. A percentagem de neutrófilos e monócitos aumentou no sangue após a administração aguda de homocisteína; entretanto, não observamos alterações nos níveis das proteínas de fase aguda (PCR e α1- glicoproteína ácida). A hiper-homocisteinemia crônica severa também aumentou as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), a quimiocina CCL2 (MCP-1) e os níveis de prostaglandina E2 no hipocampo e/ou soro de ratos. Os níveis de nitritos aumentaram no hipocampo, mas verificamos uma diminuição em seus níveis no soro após a hiper-homocisteinemia crônica. O imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a atividade da acetilcolinesterase aumentaram no hipocampo de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia crônica. Demonstramos também que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a contagem de plaquetas no sangue e os níveis de fibrinogênio no plasma. O tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada e os níveis de nitritos no plasma diminuíram após a administração aguda de homocisteína. Mostramos que a hiperhomocisteinemia aguda severa aumentou as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, um índice de peroxidação lipídica e, diminuiu a atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase e glutationa peroxidase e aumentou a atividade da enzima catalase em eritrócitos de ratos. Em relação ao envolvimento das vias de sinalização, demonstramos que a hiper-homocisteinemia aguda severa aumentou a fosforilação da Akt, o imunoconteúdo citoplasmático e nuclear da subunidade p65 do NF-κB e a fosforilação da proteína Tau, mas reduziu a fosforilação da GSK-3β após a administração aguda de homocisteína. Por outro lado, a hiper-homocisteinemia crônica severa não alterou a fosforilação da Akt e GSK-3β após a administração crônica desse aminoácido. Além disso, demonstramos que a hiper-homocisteinemia crônica severa aumentou a peroxidação lipídica e, reduziu as defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas em pulmão de ratos. Em resumo, nossos resultados demonstram que a inflamação, a hipercoagulabilidade e o estresse oxidativo podem ocorrer após a hiper-homocisteinemia severa, o que pode estar associado, pelo menos em parte, com as alterações cerebrais e cardiovasculares, bem como no tromboembolismo pulmonar que estão presentes em alguns pacientes homocistinúricos. / Classical homocystinuria, an inborn error of metabolism, is biochemically characterized by cystathionine -synthase deficiency and homocysteine tissue accumulation. Mental retardation, cognitive deficiency, seizures, vascular, skeletal, ocular, hepatic and pulmonary complications are common symptoms in homocystinuric patients. However, the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to investigate the effect of severe hyperhomocysteinemia on inflammatory parameters (cytokines, chemokines, nitric oxide, acute phase-proteins and a differential count of leukocytes) and other related parameters, such as the coagulation system, oxidative stress as well as the involvement of the Akt and GSK-3β pathway in the brain and/or blood of rats. In addition, we investigated the effect of oxidative stress in the lungs of rats submitted to severe hyperhomocysteinemia. Acute hyperhomocysteinemia increased proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and nitrite levels in hippocampus and cerebral cortex of rats. TNF-α and IL-6 levels also increased in serum of rats subjected to acute homocysteine administration. The percentage of neutrophils and monocytes increased in blood after acute homocysteine administration, but acute phase-proteins (CRP and α1-acid glycoprotein) were not altered by homocysteine administration. In addition, we showed that chronic hyperhomocysteinemia increased pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), chemokine CCL2 (MCP-1) and prostaglandin E2 levels in the hippocampus and/or serum of rats. Nitrite levels increased in the hippocampus, but decreased in the serum after chronic homocysteine administration. The immunocontent of cytosolic and nuclear NF-κB/p65 subunit and the acetylcholinesterase activity were increased in the hippocampus of rats subjected to chronic hyperhomocysteinemia. Next, we demonstrated that acute hyperhomocysteinemia increased the platelet counts in the blood and plasma fibrinogen levels of rats. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, and nitrite levels decreased in plasma after acute hyperhomocysteinemia. Additionally, we showed that acute hyperhomocysteinemia increased thiobarbituric acid-reactive, an index of lipid peroxidation, and decreased the superoxide dismutase and gluthatione peroxidase activity and also increased the catalase activity in erythrocytes of rats. Moreover, acute hyperhomocysteinemia increases Akt phosphorylation, cytosolic and nuclear immunocontent of NF-κβ/p65 subunit and Tau protein phosphorylation, but reduces GSK-3β phosphorylation after acute homocysteine administration. On the other hand, chronic hyperhomocysteinemia did not alter Akt and GSK-3β phosphorylation after the chronic administration of this amino acid. We also showed that chronic hyperhomocysteinemia increased lipid peroxidation, and disrupted antioxidant defenses (enzymatic and non-enzymatic) in the lungs of rats. In summary, our findings showed that inflammation, hypercoagulability and oxidative stress can occur after severe hyperhomocysteinemia, possibly in association, at least in part, with cerebral and cardiovascular dysfunction, as well as pulmonary thromboembolism complications observed in some homocystinuric patients.