Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / En especies pelágicas como S. lalandi, se ha descrito que la flotabilidad en huevos y embriones es el reflejo de la viabilidad y calidad de estos. Esta característica, se adquiere con la proteólisis del vitelo provocando la hidratación y generando nutrientes para el desarrollo del embrión. Las enzimas involucradas en este proceso son las catepsinas, por lo que han sido propuestas como biomarcadores de calidad en estas especies. Con el objeto de conocer aspectos moleculares involucrados en la adquisición de la flotabilidad en S. lalandi, se evaluó la relación entre la expresión del mRNA que codifica para las catepsinas B, D y L y el nivel de flotabilidad de huevos y embriones tempranos de S. lalandi previamente categorizados como flotantes y no flotantes. Para esto, se colectaron muestras con distintos niveles de flotabilidad y en diferentes etapas del desarrollo. La expresión se evaluó en forma relativa mediante RT-qPCR utilizando partidores diseñados por alineamiento de secuencias de otros peces teleósteos. Los niveles de mRNA de catepsina B fueron mayores en los estadíos de huevo, mórula y blástula, sin diferencias significativas (p> 0,05) entre estadíos. En el estadío de gástrula la expresión de catepsina B disminuyó significativamente, sin presentar cambios en embriones de 24 horas. El mayor nivel de expresión de catepsina D se registró en los huevos no flotantes en comparación con los flotantes. En otros estadíos la expresión de catepsina D no presentó diferencias relacionadas con la flotabilidad de los embriones. Catepsina L, por el contrario, tuvo mayores niveles de expresión en huevos flotantes, así como también en los estadíos de gástrula y embriones de 24 horas con flotabilidad positiva. La expresión del mRNA de estas enzimas en diferentes etapas del desarrollo temprano de S. lalandi confirman su rol descrito en especies pelágicas, cumpliendo funciones específicas en la degradación de las proteínas del vitelo. Además, los perfiles de expresión observados en muestras flotantes y no flotantes permiten proponer a catepsina L como un marcador de buena calidad y a catepsina D como un marcador de mala calidad para los huevos de S. lalandi. / In pelagic species such as S. lalandi, it has been described that the buoyancy in eggs and embryos reflect their viability and quality. This feature is acquired with the yolk proteolysis, which is responsible for the hydration process and generates nutrient for the embryos. The enzymes involved in this process are the cathepsins, which have been proposed as quality biomarkers in these species. In order to know molecular aspects involved in the acquisition of buoyance in S. lalandi, the expression of cathepsin B, D and L was assessed in eggs and early embryos previously classified as floating and non- floating samples. For this, floating and non- floating samples in different developmental stages were collected. Relative expression was evaluated by RT-qPCR using primers designed from sequence alignment of others teleost fish. Cathepsin B mRNA expression levels where higher in eggs, morula and blastocyst stage, with none- statistically significant differences (p> 0,05) between these stages. In gastrula stage, the cathepsin B expression decreased significantly, without changes in 24 hours embryos. The highest expression level of cathepsin D was recorded in non-floating eggs, in comparison with those floating. In others stages, cathepsin D expression did not show differences related with the embryo buoyancy. On the contrary, cathepsin L had higher expression levels in floating eggs as well as in gastrula stage and 24 hours embryos with positive buoyancy. The enzymes mRNA expression during different early development stages in S. lalandi confirms their role described in pelagic species in the yolk protein degradation. In addition, the expression profiles observed in floating and non-floating samples allow proposing to cathepsin L as a good quality marker and cathepsin D as poor quality marker in S. lalandi eggs. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 11140639.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / En la actualidad, Salmonella Enteritidis (SE) es considerada una de las principales causas de toxiinfecciones alimentarias a nivel internacional, habiéndose determinado a los huevos como uno de los vehículos más importantes de este patógeno. Por este motivo, se han estudiado diversos métodos que permitan controlar el ingreso de SE al contenido del huevo, surgiendo la refrigeración como una importante alternativa, debido a que permitiría inhibir la penetración y multiplicación bacteriana. Sin embargo, algunos estudios señalan que la refrigeración de huevos mantenidos previamente a temperatura ambiente, favorecería la penetración de la bacteria a través de la cáscara, debido a que la diferencia de temperaturas genera una presión negativa en éstos, provocando la succión de las bacterias presentes en la superficie del huevo. A partir de estos datos, surge la inquietud de determinar el real efecto de la refrigeración en el control de la penetración de SE al contenido de huevos conservados previamente a temperatura ambiente. Para esto se emplearon 100 huevos frescos, que fueron mantenidos durante 15 días a temperatura ambiente (25°C; grupo A). Al cabo de este periodo, los huevos fueron contaminados mediante la técnica de pinceladas de las cáscaras, con una concentración bacteriana de 2,6 x109 UFC SE/ mL. Luego de la contaminación, se formaron dos grupos al azar de 50 unidades cada uno. Uno de ellos fue refrigerado (4-8°C) – grupo A/R –, y el otro se mantuvo a temperatura ambiente (25°C) – grupo A/A –, durante seis días. Transcurridos seis días de almacenamiento, los huevos de ambos grupos fueron abiertos, y sus yemas y albúminas fueron separadas, para realizar análisis bacteriológico cualitativo (porcentaje de positividad) y cuantitativo (recuento bacteriano). Contrariamente a lo esperado, los resultados de la bacteriología cualitativa del grupo A/R, mostraron un 32% de yemas y un 12% de albúminas positivas a SE, mientras que en el grupo A/A, un 100% de yemas y un 66% de albúminas fueron positivas a la bacteria. Las diferencias entre ambos grupos, tanto para albúminas como para yemas, fueron significativas (p = 0,00001). En cuanto al análisis cuantitativo de las yemas, solo se obtuvo resultados positivos en el grupo A/A, lográndose un recuento promedio de 2,24 log10 UFC SE/ mL. La obtención de un menor número de muestras A/R positivas a SE, respecto a lo ocurrido en las muestras A/A, se explicaría por la inhibición de la multiplicación bacteriana ocurrida a temperatura de refrigeración, y probablemente también por disminución de la penetración bacteriana, en contraste con el favorecimiento de estas a temperatura ambiente. Finalmente, los resultados obtenidos permiten concluir que el exponer los huevos a un diferencial de temperatura no afectaría la penetración de SE a través de la cáscara

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los modelos de experimentación biológica han surgido como una herramienta para el estudio de agentes patógenos, teniendo por finalidad simular de la manera más natural posible la interacción del patógeno con su hospedero. Sin embargo, muchos de ellos, no han conseguido generar los niveles de infección adecuados, lo cual sugiere que deben ser mejorados. El objetivo del presente estudio es optimizar el modelo de infección bacteriana in ovo por inmersión, a través de un protocolo químico o físico (por temperatura) de permeabilización, que mejore el ingreso de Salmonella enterica serotipo Enteritidis (S. Enteritidis) hacia el interior de los huevos, sin generar efecto bactericida residual. Para ello, se analizaron inicialmente dos reactivos permeabilizantes: Urea e Hipoclorito de Sodio, en distintas concentraciones. Se utilizaron grupos de 20 huevos por cada concentración, los cuales fueron precalentados y posteriormente permeabilizados por inmersión en el reactivo diluido, durante 30 minutos. Luego, los huevos fueron puestos en una solución de fucsina concentrada, para visualizar la presencia del paso de colorante en el interior de las cáscaras, determinando con ello el nivel de permeabilización. Se seleccionó de cada reactivo, la menor concentración capaz de permeabilizar 100% de los huevos, con un nivel elevado de penetración de fucsina. Finalmente, se decidió utilizar Urea, ya que logró resultados similares a Hipoclorito de Sodio, pero a diferencia de éste, no había sido utilizado en modelos de infección in ovo. Se evaluó el efecto bactericida residual en un grupo de 90 huevos permeabilizados con Urea y contaminados por inmersión con S. Enteritidis; cuatro horas después los huevos fueron incubados en una estufa por 24 horas a 37ºC. Terminado este período, fueron vaciados de manera aséptica, y recolectados individualmente, para posteriormente ser analizados por bacteriología cualitativa (% de contaminación) y cuantitativa (UFC/mL). Se incluyó un grupo control de infección, el cual fue permeabilizado por un método abrasivo. Los resultados de este estudio mostraron que el porcentaje de huevos contaminados con S. Enteritidis fue mayor en el grupo control (98,5%) que en el grupo permeabilizado con Urea (63,2%) (p ≤ 0,05). Se discute el efecto bactericida residual observado en el grupo permeabilizado con Urea. El presente estudio concluyó que el uso de Urea en concentración 0,025 M logra permeabilizar eficientemente la cáscara de los huevos, sin embargo, genera un efecto bactericida residual sobre S. Enteritidis. También fue analizado el efecto de la temperatura sobre la permeabilización de los huevos, utilizando dos grupos de 40 huevos, de los cuales, un grupo fue refrigerado a 4-8ºC y el otro fue calentado a 37ºC, durante 4 horas. Posteriormente, los huevos fueron puestos a inmersión en una solución fría de fucsina (4-8ºC). Los resultados indicaron que en el grupo de huevos calentados a 37ºC, el porcentaje de ingreso de colorante fue mayor que en el grupo de huevos refrigerados, demostrando que al inducir un diferencial térmico, la permeabilización en los huevos también es mayor. Como conclusión, se sugiere que la inducción de un diferencial térmico marcado, optimiza mejor el modelo de infección in ovo con S. Enteritidis, que la permeabilización de los huevos con Urea 0, 025 M / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No 1080291