Neste trabalho, anticorpos anti-IgGh foram conjugados às nanopartículas de prata (NPAg) para detectar imunoglobulina G humana (IgGh). Um imunoensaio colorimétrico baseado na diminuição da agregação devido ao aumento da repulsão eletrostática após a interação ligante-alvo. A agregação é induzida pela variação da força iônica e uma mudança da coloração da suspensão coloidal de amarelo para vermelho pode ser observada. Na presença de IgGh, a agregação é inibida e a coloração da suspensão coloidal não se altera. As nanopartículas foram obtidas por meio de cinco procedimentos diferentes e caracterizadas por espectroscopia UV-Vis, espalhamento dinâmico de luz, difração de raios-X e microscopia eletrônica. Glicose e borohidreto de sódio foram utilizados como agentes redutores, enquanto CTAB e β-ciclodextrina foram utilizados como estabilizantes. Citrato de sódio foi utilizado como agente redutor e/ou estabilizante. Nanoesferas de carbono foram obtidas por tratamento hidrotérmico de uma solução aquosa de glicose e também foram utilizadas no preparo das nanopartículas. As nanopartículas foram funcionalizadas com ácido mercaptossuccínico e a conjugação ocorreu devido à interação entre grupos aminas e grupos carboxílicos ionizados, presentes no anticorpo e agente de acoplamento, respectivamente. A estabilidade dos conjugados e o efeito da adição de IgGh foram avaliados para todos os sistemas preparados. As nanopartículas de prata preparadas com borohidreto de sódio e citrato de sódio foram selecionadas para serem aplicadas no desenvolvimento do imunoensaio e as condições experimentais foram avaliadas. Em condições ótimas, observou-se uma correlação linear entre a diminuição da agregação do sistema (NPAg-anti-IgGh) e a concentração de IgGh (0 a 200 ng mL-1). O limite de detecção foi estimado em 25 ng mL-1. O método colorimétrico apresentou boa seletividade para a detecção de IgGh. Além disso, foi obtido um resultado satisfatório ao aplicar o método para determinação do fator IX de coagulação. Foi desenvolvido também um método para determinação de ATP baseado na agregação de nanopartículas de ouro. Aptâmeros foram utilizados como elemento de reconhecimento. Em princípio, o método pode ser aplicável à determinação de outros analitos, por meio da substituição do aptâmero utilizado neste trabalho pelo oligonucleotídeo específico para o alvo de interesse. / In this work, antibodies to human immunoglobulin G (anti-IgGh) were used in combination with silver nanoparticle (NPAg) to detect IgGh. A colorimetric immunoassay based on the decrease of aggregation due to increased electrostatic repulsion upon ligand-target interaction. Aggregation was induced by varying the ionic strength and the solution of NPAg-anti-IgGh shows obvious visible color change from yellow to red. In the presence of IgGh aggregation the nanoparticle is inhibited and coloration of the colloidal solution does not change. The nanoparticles were obtained using five different procedures and they were characterized by UV-Vis spectroscopy, dynamic light scattering, X-ray diffraction and electron microscopy. Glucose and sodium borohydride were used as reducing agent, as CTAB and β-cyclodextrin reagents were used as stabilizers. Sodium citrate was used as reducing and stabilizing agent. Carbon nanospheres were prepared by hydrothermal treatment of glucose and used in the preparation of NPAg. The nanoparticles were functionalized with dimercaptosuccinic acid and their conjugation occurred due to the interaction of positively charged amine groups and anionic groups (-COO-) present on the antibody and coupling agent. The stability of conjugates and the variation of aggregation in the presence of IgGh were evaluated for all systems. The NPAg prepared by sodium borohydride were selected for use in the immunoassay and the optimum conditions of the assay were investigated. Under the optimal conditions, the ration between the absorbance at 396 nm and 564 nm was linearly proportional to the IgGh concentration on a range from 0 to 200 ng mL-1, with a detection limit of 25 ng mL-1. The colorimetric method showed good selectivity for IgGh detection. It was possible to adapt the method to the determination of other proteins, such as factor IX. In another approach, anti-aptamer ATP was used to develop a colorimetric method for the determination of ATP based on stabilization of gold nanoparticles provided by strands of DNA.The strategy was based on stabilization of nanoparticles due to interaction with single strands of DNA, and the change of the stability of the nanoparticles provided by the conformational change of the aptamer following recognition. This method could in principle be used to detect analytes by substituting the aptamer used in this study by the specific aptamer for the target of interest

Neste trabalho, anticorpos anti-IgGh foram conjugados às nanopartículas de prata (NPAg) para detectar imunoglobulina G humana (IgGh). Um imunoensaio colorimétrico baseado na diminuição da agregação devido ao aumento da repulsão eletrostática após a interação ligante-alvo. A agregação é induzida pela variação da força iônica e uma mudança da coloração da suspensão coloidal de amarelo para vermelho pode ser observada. Na presença de IgGh, a agregação é inibida e a coloração da suspensão coloidal não se altera. As nanopartículas foram obtidas por meio de cinco procedimentos diferentes e caracterizadas por espectroscopia UV-Vis, espalhamento dinâmico de luz, difração de raios-X e microscopia eletrônica. Glicose e borohidreto de sódio foram utilizados como agentes redutores, enquanto CTAB e β-ciclodextrina foram utilizados como estabilizantes. Citrato de sódio foi utilizado como agente redutor e/ou estabilizante. Nanoesferas de carbono foram obtidas por tratamento hidrotérmico de uma solução aquosa de glicose e também foram utilizadas no preparo das nanopartículas. As nanopartículas foram funcionalizadas com ácido mercaptossuccínico e a conjugação ocorreu devido à interação entre grupos aminas e grupos carboxílicos ionizados, presentes no anticorpo e agente de acoplamento, respectivamente. A estabilidade dos conjugados e o efeito da adição de IgGh foram avaliados para todos os sistemas preparados. As nanopartículas de prata preparadas com borohidreto de sódio e citrato de sódio foram selecionadas para serem aplicadas no desenvolvimento do imunoensaio e as condições experimentais foram avaliadas. Em condições ótimas, observou-se uma correlação linear entre a diminuição da agregação do sistema (NPAg-anti-IgGh) e a concentração de IgGh (0 a 200 ng mL-1). O limite de detecção foi estimado em 25 ng mL-1. O método colorimétrico apresentou boa seletividade para a detecção de IgGh. Além disso, foi obtido um resultado satisfatório ao aplicar o método para determinação do fator IX de coagulação. Foi desenvolvido também um método para determinação de ATP baseado na agregação de nanopartículas de ouro. Aptâmeros foram utilizados como elemento de reconhecimento. Em princípio, o método pode ser aplicável à determinação de outros analitos, por meio da substituição do aptâmero utilizado neste trabalho pelo oligonucleotídeo específico para o alvo de interesse. / In this work, antibodies to human immunoglobulin G (anti-IgGh) were used in combination with silver nanoparticle (NPAg) to detect IgGh. A colorimetric immunoassay based on the decrease of aggregation due to increased electrostatic repulsion upon ligand-target interaction. Aggregation was induced by varying the ionic strength and the solution of NPAg-anti-IgGh shows obvious visible color change from yellow to red. In the presence of IgGh aggregation the nanoparticle is inhibited and coloration of the colloidal solution does not change. The nanoparticles were obtained using five different procedures and they were characterized by UV-Vis spectroscopy, dynamic light scattering, X-ray diffraction and electron microscopy. Glucose and sodium borohydride were used as reducing agent, as CTAB and β-cyclodextrin reagents were used as stabilizers. Sodium citrate was used as reducing and stabilizing agent. Carbon nanospheres were prepared by hydrothermal treatment of glucose and used in the preparation of NPAg. The nanoparticles were functionalized with dimercaptosuccinic acid and their conjugation occurred due to the interaction of positively charged amine groups and anionic groups (-COO-) present on the antibody and coupling agent. The stability of conjugates and the variation of aggregation in the presence of IgGh were evaluated for all systems. The NPAg prepared by sodium borohydride were selected for use in the immunoassay and the optimum conditions of the assay were investigated. Under the optimal conditions, the ration between the absorbance at 396 nm and 564 nm was linearly proportional to the IgGh concentration on a range from 0 to 200 ng mL-1, with a detection limit of 25 ng mL-1. The colorimetric method showed good selectivity for IgGh detection. It was possible to adapt the method to the determination of other proteins, such as factor IX. In another approach, anti-aptamer ATP was used to develop a colorimetric method for the determination of ATP based on stabilization of gold nanoparticles provided by strands of DNA.The strategy was based on stabilization of nanoparticles due to interaction with single strands of DNA, and the change of the stability of the nanoparticles provided by the conformational change of the aptamer following recognition. This method could in principle be used to detect analytes by substituting the aptamer used in this study by the specific aptamer for the target of interest

Submitted by Luis Ricardo Andrade da Silva (lrasilva@uefs.br) on 2016-02-12T23:10:51Z No. of bitstreams: 1 M?rcia Maria Noya Rabelo - Disserta??o.pdf: 26908510 bytes, checksum: 90ce9ed15229c185d93e1b1379da4d1a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-12T23:10:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 M?rcia Maria Noya Rabelo - Disserta??o.pdf: 26908510 bytes, checksum: 90ce9ed15229c185d93e1b1379da4d1a (MD5) Previous issue date: 2011-03-31 / INTRODUCTION: Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is one of the most important causes of heart failure in America. Alternative therapies have been investigated as potential therapeutic options for patients with this disease. This study evaluated the effects of therapy with human immunoglobulin in an experimental model of chronic chagasic cardiomyopathy. METHODS: C57BL/6 mice were infected with 1000 trypomastigotes of the Colombian strain of T. cruzi, and after eight months of infection were treated with intravenous human immunoglobulin or albumin (control). Before and after 2 months of treatment, infected animals and normal controls underwent cardiac evaluation including electrocardiogram, echocardiography and treadmill test. The immunoglobulin and albumin groups were treated, respectively, with 1 mg/kg/day of human immunoglobulin or albumin, intraperitoneally, for five consecutive days. All animals were sacrificed under anesthesia, after 2 months of treatment, for histopathological analysis of the heart. RESULTS: No improvement was observed in cardiovascular function in animals treated with immunoglobulin compared to animals treated with albumin. There was an increasing in the number of animals with complete atrioventricular block in the immunoglobulin group. However, sections of hearts in immunoglobulin group had a significantly reduced number of inflammatory cells (p <0,01) and area of fibrosis (p <0,001), compared to animals treated with albumin. In animals treated with immunoglobulin, there was evidence of arteritis marked with immune complex deposition in the intima of arterioles. The concentrations of serum cytokines were increased in the group treated with immunoglobulin in comparison to the other groups (uninfected and treated with albumin mice). When considering cytokines production in heart extract, there were no differences observed in production of IFN-?, TNF-? and IL-10 between the groups treated with immunoglobulin and albumin. CONCLUSION: Thus, we concluded that immunoglobulin therapy has neither not shown anti-inflammatory efficacy nor improvement in cardiovascular function in a murine model of chronic chagasic cardiomyopathy. / INTRODU??O: A doen?a de Chagas, causada pelo protozo?rio Trypanosoma cruzi, ? uma das mais importantes causas de insufici?ncia card?aca na Am?rica. Terapias alternativas v?m sendo investigadas como poss?veis op??es terap?uticas para pacientes portadores desta doen?a. Neste estudo foram avaliados os efeitos da terapia com imunoglobulina humana em um modelo experimental de cardiomiopatia chag?sica cr?nica. M?TODOS: Camundongos C57BL/6 foram infectados com 1000 tripomastigotas da cepa Colombiana de T. cruzi e, ap?s oito meses de infec??o, foram tratados com imunoglobulina ou com albumina humanas (controle). Antes e ap?s 2 meses do tratamento, os animais chag?sicos e controles normais foram submetidos ? avalia??o card?aca, incluindo eletrocardiograma, ecocardiograma e teste ergom?trico. Os grupos tratados com imunoglobulina e albumina receberam, respectivamente, 1 mg/Kg/dia de imunoglobulina humana ou albumina, via intraperitoneal, por cinco dias consecutivos. Todos os animais foram sacrificados sob anestesia ap?s 2 meses de tratamento, para an?lise histopatol?gica do cora??o. RESULTADOS: N?o foi observada uma melhora da fun??o cardiovascular no grupo tratado com imunoglobulina quando comparado ao grupo tratado com albumina. Houve um aumento do n?mero de animais com bloqueio atrioventricular total no grupo imunoglobulina. No entanto, sec??es de cora??es de camundongos do grupo imunoglobulina apresentaram uma redu??o significativa do n?mero de c?lulas inflamat?rias (p< 0,01) e da ?rea de fibrose (p< 0,001) em compara??o com animais chag?sicos tratados com albumina, sendo que nos animais tratados com imunoglobulina foi evidenciada a presen?a de arterite acentuada, com dep?sito de imunocomplexos na camada ?ntima arteriolar. As concentra??es de 12 citocinas s?ricas foram aumentadas no grupo tratado com imunoglobulina em rela??o aos demais grupos (n?o infectados e tratados com albumina). Quando avaliada a produ??o, em extrato de cora??o, de IFN-?, TNF-? e IL-10, n?o foram observadas diferen?as entre os grupos tratados com imunoglobulina e albumina. CONCLUS?O: Deste modo, conclu?mos que a terapia com imunoglobulina humana n?o demonstrou efic?cia anti-inflamat?ria nem induziu a melhora da fun??o card?aca no modelo murino de cardiomiopatia chag?sica cr?nica.