La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie neuromusculaire qui touche 1 enfant sur 3500, liée au chromosome X, caractérisée par l’absence de dystrophine, protéine située sous le sarcolemme qui confère stabilité à la membrane cellulaire en connectant l’actine du cytosquelette avec la matrice extracellulaire. Elle fait partie d’un complexe multi protéique, nommé « dystrophin associated protein complex (DAPC)», qui contient, entre autre, le -dystroglycane et l’oxyde nitrique synthase (NOS). Son absence cause la dérégulation de l’homéostasie calcique, la nécrose tissulaire, l’accumulation de tissu graisseux et fibreux, l’incapacité de mouvement et des déficits cardiaques et respiratoires qui aboutissent au décès des patients. Mon travail avait comme objectif l’amélioration de différents aspects du phénotype dystrophique. J’ai utilisé des molécules capables d’activer deux voies de signalisations (la voie du NO et l’inhibition des histones deacetylase (HDAC)), connues pour induire l’amélioration du phénotype dystrophique chez la souris mdx, modèle de la maladie. Plus particulièrement, j’ai testé chez la souris, deux mode d’administration du butyrate d’arginine (AB), la drogue de référence car déjà utilisée en clinique sur des jeunes patients pour une autre indication, par gavage et par injection intrapéritonéale. J’ai étudié aussi deux nouvelles molécules dérivées du AB, qui pourraient être administrées par voie orale et être efficace à faible dose : le 3-Hydroxybutyrate arginate (ABE) et le N-butyril arginine (ABA). AB, ABE et ABA ont été testés in vitro sur les myotubes de patients dystrophiques et in vivo sur des souris mdx. L’administration orale du AB a les mêmes effets positifs que l’injection intrapéritonéale chez les souris mdx. Ces résultats démontrent que l’administration par voie orale doit être prise en considération lors des futurs essais cliniques. Dans un deuxième temps, je me suis focalisée sur les défauts cardiaques. Un suivi par échocardiographie mensuelle a été réalisé sur des souris de 8 mois traitées avec du AB. En parallèle nous avons analysé les effets de l’administration par voie orale du AB sur les déformations de la colonne vertébrale. Enfin, les altérations des signaux de l’électromyogramme (réalisé avec une méthode non invasive développée en clinique et appliquée pour les animaux) ont été également analysées. L’ensemble des résultats obtenus montre que le AB est capable de préserver l’activité cardiaque, d’empêcher la déformation de la colonne vertébrale et de rétablir les paramètres d’excitabilité axonale mesurés chez les souris traitées.Différentes concentrations des ABE et ABA ont été testé in vivo et observé à des faibles doses les mêmes résultats bénéfiques sur de nombreux paramètres structuraux et fonctionnels, que ceux obtenu avec une dose importante de AB (800mg/kg/j). Les deux nouvelles drogues peuvent être administrées à une dose 10 fois inferieur que la dose de AB pour obtenir les mêmes effets. J’ai testé aussi in vitro, sur des cellules musculaires humaines, la capacité des deux produits à induire une augmentation des niveaux intracellulaires d’utrophine et des protéines associées (β-dystroglycan et la myosine embryonnaire). J’ai aussi démontré qu’une augmentation de l’expression de l’utrophine et des protéines associées pouvait être induite par les inhibiteurs d’HDAC (le butyrate, la trichostatine A, l’acide valproique et l’isobutyramide). Enfin, une étude portant sur l’homéostasie calcique a été réalisé car des altérations de cet équilibre sont en partie responsables de la nécrose/dégénérescence du tissue musculaire. En particulier, l’activité spontanée du Ca2+, enregistrée sur le myotubes humaine, été fortement réduite après un traitement agissant sur la voie d’activation du NO et/ou par des inhibiteurs des HDAC. L’ensemble des résultats obtenus apportent la preuve des effets bénéfiques du AB et de ses dérivés sur la DMD, a travers la voie du NO et en inhibant les HDAC. / Duchenne muscular dystrophy is a X-linked progressive neuromuscular disease affecting 1:3500 boys at birth. It is caused by the absence of dystrophin, a subsarcolemmal protein that confers membrane stability linking cytoskeletal actin to the extracellular matrix. It is part of a multi-protein complex called dystrophin associated protein complex (DAPC), which contains, among the other components, -dystroglycan and nitric oxide synthase (NOS).The consequences of the absence of dystrophin are: deregulation of calcium homeostasis, tissues necrosis, progressive accumulation of fat and fibrosis, inability of the movements and cardiac and respiratory failures that lead to patient’s death, around the age of 20-30 years.The objective of my PhD work is to ameliorate different aspects of dystrophic phenotype. In particular I have tested two different ways of administration of arginine butyrate (AB), the reference drug, through feeding-force and intraperitoneal injection. Meanwhile I have studied two new pharmacological molecules, AB derived, which could be administered orally to DMD patients. These compounds are: 3-Hydroxybutyrate arginate (refer as ABE) and N-butyryl arginine (refer as ABA). All of these molecules partially restore dystrophic phenotype activating two independent pathways (both the nitric oxide pathway and the inhibition of the histone deacetilase), which are known to be beneficent for mdx mice.AB, ABE and ABA have been tested in vitro on human DMD myotubes and in vivo on the mdx mice. The first goal of my project is the observation that the positive effects obtained after intraperitoneal injections of AB can be detected also after oral protocol, promoting the idea that the oral way has to be developed for future clinical trials. I have focused my attention on heart defaults; in particular, starting from the 8th month, a monthly study on heart activity based on echocardiography has been performed on mdx mice treated with AB. We addressed the potential profits of the oral administration of arginine butyrate on vertebral column deformation and electromyogram defaults, with a non-invasive automatized method developed in clinic and then applied to animals. The results collected from these experiments show that AB preserve heart activity, reverse vertebral column deformity and all the axonal excitability parameters that were modified in saline-treated mdx mice.In complement, I have tested different concentrations of ABE and ABA in vivo. The positive effects on many structural and functional dystrophic parameters, previously obtained with high dose of AB administered per os (800 mg/kg/d), has been observed with doses 10 times lower with both new compounds.In parallel, both products were tested in vitro on human muscular cells cultures to investigate their capacity to increase utrophin level. Moreover, the potential ability of histone deacetylase inhibitors (byturate, valproic acid, trichostatin A and isobutyramide) to increase the expression of utrophin and related proteins (-dystroglycan and embryonic myosin) has been studied. Finally, the alteration of calcium homeostasis, largely implicated in the cascades resulting in muscle necrosis/degeneration, was investigated. The spontaneous Ca2+ activity recorded in patient myotubes, i.e. without sarcolemmal integrity was strongly reduced after treatment acting on the NO-pathway activation and/or with HDAC inhibitors. All together, these data constitute a proof of principle of the beneficial effects of arginine butyrate and its derivates on muscular dystrophy, by enhancing NO pathway and inhibiting HDAC.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la conséquence de la perte de la dystrophine, une protéine cytosquelettique indispensable au maintien mécanique et fonctionnel du sarcolemme. Notre équipe a largement étudié les entrées cationiques dans les lignées murines et a montré : 1- une augmentation anormale des influx dépendant des stocks calciques (SOCE) dans les myotubes (MT) déficients en dystrophine (dys-), 2- que les influx SOCE sont médiés par les canaux TRPC1 et TRPC4, 3- que la dérégulation des SOCE dans les MT dys- est corrigée grâce à la surexpression de l'α1-syntrophine. Au jour d'aujourd’hui, il existe peu d'éléments dans la littérature quant à la caractérisation des entrées SOCEs dans les cellules musculaires humaines et dans la DMD. Ce travail de thèse s'articule autour de deux parties : Le modèle murin, dans lequel nous avons montré un rôle indispensable de STIM1 et Orai1 dans la mise en place des entrées SOCEs et l'implication de la voie Ca2+/PLC/PKC dans l'augmentation anormale de ces entrées dans les MT murins dys-. Le modèle humain primaire, dans lequel nous avons mis en évidence : 1- une augmentation anormale des influx SOCEs dans les MT DMD et établit le profil d'expression des différentes protéines nécessaires à la mise en place de ces entrées ; 2- l'implication de la voie Ca2+/PLC/PKC dans la dérégulation des SOCEs dans les MT humains DMD et le rôle de l'α1-syntrophine dans la régulation de ces entrées dans les MT humains ; 3- la dérégulation de l'homéostasie calcique dans la DMD qui se produit par l'intermédiaire des entrées cationiques dépendantes de TRPV2 dans les cellules musculaires dystrophiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the consequence of the loss of dystrophin, a cytoskeletal protein essential for the mechanical and functional maintenance of the sarcolemma. Our group has extensively studied store-operated cation influx (SOCE) in mouse cell lines and highlighted: 1- an abnormal increase in SOCE in dystrophin-deficient (dys-) mouse myotubes (MT), 2- That SOCE are mediated by TRPC1 and TRPC4, 3- that SOCE deregulation in dys- MT is corrected by overexpression of α1-syntrophin. As of today, there is little evidence in the literature regarding the characterization of SOCE in human muscle cells and in human DMD. This thesis work is divided in two parts : In the murine model, we demonstrated an essential role of STIM1 and Orai1 in the establishment of SOCE and highlighted the involvement of Ca2+/PLC/PKC pathway in the abnormal increase of cation entry in dystrophin-deficient mouse myotubes.In primary human model, we showed: 1- an abnormal increase of SOCE in DMD MT and established the expression profile of various proteins necessary for the implementation of this influx; 2- the involvement of Ca2+/PLC/PKC in SOCE deregulation in human DMD MT and the role of α1-syntrophin in the regulation of cation entry in human MT; 3- the deregulation of calcium homeostasis in DMD that occurs through TRPV2. This work proposes a new regulatory pathway, Ca2+/PLC/PKC, for SOCE in skeletal muscle cells and provides the first elements of the disruption of calcium homeostasis in DMD human myotubes due to the absence of SOCE's regulation by the α1-syntrophin and to the overactivation of TRPV2 channels.