La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie neuromusculaire qui touche 1 enfant sur 3500, liée au chromosome X, caractérisée par l’absence de dystrophine, protéine située sous le sarcolemme qui confère stabilité à la membrane cellulaire en connectant l’actine du cytosquelette avec la matrice extracellulaire. Elle fait partie d’un complexe multi protéique, nommé « dystrophin associated protein complex (DAPC)», qui contient, entre autre, le -dystroglycane et l’oxyde nitrique synthase (NOS). Son absence cause la dérégulation de l’homéostasie calcique, la nécrose tissulaire, l’accumulation de tissu graisseux et fibreux, l’incapacité de mouvement et des déficits cardiaques et respiratoires qui aboutissent au décès des patients. Mon travail avait comme objectif l’amélioration de différents aspects du phénotype dystrophique. J’ai utilisé des molécules capables d’activer deux voies de signalisations (la voie du NO et l’inhibition des histones deacetylase (HDAC)), connues pour induire l’amélioration du phénotype dystrophique chez la souris mdx, modèle de la maladie. Plus particulièrement, j’ai testé chez la souris, deux mode d’administration du butyrate d’arginine (AB), la drogue de référence car déjà utilisée en clinique sur des jeunes patients pour une autre indication, par gavage et par injection intrapéritonéale. J’ai étudié aussi deux nouvelles molécules dérivées du AB, qui pourraient être administrées par voie orale et être efficace à faible dose : le 3-Hydroxybutyrate arginate (ABE) et le N-butyril arginine (ABA). AB, ABE et ABA ont été testés in vitro sur les myotubes de patients dystrophiques et in vivo sur des souris mdx. L’administration orale du AB a les mêmes effets positifs que l’injection intrapéritonéale chez les souris mdx. Ces résultats démontrent que l’administration par voie orale doit être prise en considération lors des futurs essais cliniques. Dans un deuxième temps, je me suis focalisée sur les défauts cardiaques. Un suivi par échocardiographie mensuelle a été réalisé sur des souris de 8 mois traitées avec du AB. En parallèle nous avons analysé les effets de l’administration par voie orale du AB sur les déformations de la colonne vertébrale. Enfin, les altérations des signaux de l’électromyogramme (réalisé avec une méthode non invasive développée en clinique et appliquée pour les animaux) ont été également analysées. L’ensemble des résultats obtenus montre que le AB est capable de préserver l’activité cardiaque, d’empêcher la déformation de la colonne vertébrale et de rétablir les paramètres d’excitabilité axonale mesurés chez les souris traitées.Différentes concentrations des ABE et ABA ont été testé in vivo et observé à des faibles doses les mêmes résultats bénéfiques sur de nombreux paramètres structuraux et fonctionnels, que ceux obtenu avec une dose importante de AB (800mg/kg/j). Les deux nouvelles drogues peuvent être administrées à une dose 10 fois inferieur que la dose de AB pour obtenir les mêmes effets. J’ai testé aussi in vitro, sur des cellules musculaires humaines, la capacité des deux produits à induire une augmentation des niveaux intracellulaires d’utrophine et des protéines associées (β-dystroglycan et la myosine embryonnaire). J’ai aussi démontré qu’une augmentation de l’expression de l’utrophine et des protéines associées pouvait être induite par les inhibiteurs d’HDAC (le butyrate, la trichostatine A, l’acide valproique et l’isobutyramide). Enfin, une étude portant sur l’homéostasie calcique a été réalisé car des altérations de cet équilibre sont en partie responsables de la nécrose/dégénérescence du tissue musculaire. En particulier, l’activité spontanée du Ca2+, enregistrée sur le myotubes humaine, été fortement réduite après un traitement agissant sur la voie d’activation du NO et/ou par des inhibiteurs des HDAC. L’ensemble des résultats obtenus apportent la preuve des effets bénéfiques du AB et de ses dérivés sur la DMD, a travers la voie du NO et en inhibant les HDAC. / Duchenne muscular dystrophy is a X-linked progressive neuromuscular disease affecting 1:3500 boys at birth. It is caused by the absence of dystrophin, a subsarcolemmal protein that confers membrane stability linking cytoskeletal actin to the extracellular matrix. It is part of a multi-protein complex called dystrophin associated protein complex (DAPC), which contains, among the other components, -dystroglycan and nitric oxide synthase (NOS).The consequences of the absence of dystrophin are: deregulation of calcium homeostasis, tissues necrosis, progressive accumulation of fat and fibrosis, inability of the movements and cardiac and respiratory failures that lead to patient’s death, around the age of 20-30 years.The objective of my PhD work is to ameliorate different aspects of dystrophic phenotype. In particular I have tested two different ways of administration of arginine butyrate (AB), the reference drug, through feeding-force and intraperitoneal injection. Meanwhile I have studied two new pharmacological molecules, AB derived, which could be administered orally to DMD patients. These compounds are: 3-Hydroxybutyrate arginate (refer as ABE) and N-butyryl arginine (refer as ABA). All of these molecules partially restore dystrophic phenotype activating two independent pathways (both the nitric oxide pathway and the inhibition of the histone deacetilase), which are known to be beneficent for mdx mice.AB, ABE and ABA have been tested in vitro on human DMD myotubes and in vivo on the mdx mice. The first goal of my project is the observation that the positive effects obtained after intraperitoneal injections of AB can be detected also after oral protocol, promoting the idea that the oral way has to be developed for future clinical trials. I have focused my attention on heart defaults; in particular, starting from the 8th month, a monthly study on heart activity based on echocardiography has been performed on mdx mice treated with AB. We addressed the potential profits of the oral administration of arginine butyrate on vertebral column deformation and electromyogram defaults, with a non-invasive automatized method developed in clinic and then applied to animals. The results collected from these experiments show that AB preserve heart activity, reverse vertebral column deformity and all the axonal excitability parameters that were modified in saline-treated mdx mice.In complement, I have tested different concentrations of ABE and ABA in vivo. The positive effects on many structural and functional dystrophic parameters, previously obtained with high dose of AB administered per os (800 mg/kg/d), has been observed with doses 10 times lower with both new compounds.In parallel, both products were tested in vitro on human muscular cells cultures to investigate their capacity to increase utrophin level. Moreover, the potential ability of histone deacetylase inhibitors (byturate, valproic acid, trichostatin A and isobutyramide) to increase the expression of utrophin and related proteins (-dystroglycan and embryonic myosin) has been studied. Finally, the alteration of calcium homeostasis, largely implicated in the cascades resulting in muscle necrosis/degeneration, was investigated. The spontaneous Ca2+ activity recorded in patient myotubes, i.e. without sarcolemmal integrity was strongly reduced after treatment acting on the NO-pathway activation and/or with HDAC inhibitors. All together, these data constitute a proof of principle of the beneficial effects of arginine butyrate and its derivates on muscular dystrophy, by enhancing NO pathway and inhibiting HDAC.

Cette thèse a été consacrée à la mise au point de deux systèmes d'administration destinés à la voie orale, pour deux molécules différentes.Dans la première partie, des microparticules (MPs) à base de xylane et d'Eudragit® S-100 ont été produites pour encapsuler l’acide 5-aminosalicylique et permettre son absorption au niveau du colon. Le xylane a été extrait à partir de rafles de maïs et caractérisé selon ses propriétés physico-chimiques, rhéologiques et toxicologiques. Par la suite, les MPs ont été préparées soit par réticulation interfaciale, soit par séchage par atomisation et caracterisés quant à leur morphologie, leur taille moyenne et leur distribution, leur stabilité thermique, leur cristallinité, leur efficacité et leur profil de libération du médicament in vitro. Des MPs de caractéristiques physiques appropriées avec des rendements satisfaisants ont été préparées par ces deux méthodes, bien que les systèmes séchés par pulvérisation aient montré une plus grande stabilité thermique. En général, ces derniers systèmes étaient plus prometteurs en raison de leur stabilité thermique et de l'absence d'agents réticulants toxiques. Toutefois, la méthodologie doit être optimiser afin d’améliorer le chargement de principe actif ainsi que sa libération.Dans la deuxième partie de cette thèse, des microémulsions huile-dans-l’eau (ME H/E) à base de triglycérides à chaîne moyenne ont été preparées afin de vectoriser et d’augmenter la solubilité de l'amphotéricine B (AmB). Des diagrammes de phases ont été construits en utilisant des mélanges de tensioactifs dont les valeurs de la balance hydrophile-lipophile variaient entre 9,7 et 14,4. Les MEs H/E sans et avec AmB étaient composées de gouttelettes sphériques non agrégées de diamètre moyen autour de 80 et 120 nm, respectivement, et avec une faible polydispersité. L'incorporation de l'AmB était élevée et dépendait de la fraction volumique de la phase dispersée. La viabilité des cellules J774.A1 n’était pas diminuée par l’exposition aux concentrations d’AmB encapsulée allant jusqu’à 25μg/mL. Par conséquent, les MEs H/E à base d’esters de propylèneglycol et d'acide caprylique peuvent être considéré comme des vecteurs adaptés pour l’AmB. / This thesis was devoted to the development of innovative oral delivery systems for two different molecules. In the first part, microparticles (MPs) based on xylan and Eudragit® S-100 were produced and used to encapsulate 5-aminosalicylic acid for colon delivery. Xylan was extracted from corn cobs and characterized in terms of its physicochemical, rheological and toxicological properties. The polymeric MPs were prepared by interfacial cross-linking polymerization and spray-drying and characterized for their morphology, mean size and distribution, thermal stability, crystallinity, entrapment efficiency and in vitro drug release. MPs with suitable physical characteristics and satisfactory yields were prepared by both methods, although the spray-dried systems showed higher thermal stability. In general, spray-dried MPs would be preferable systems due to their thermal stability and absence of toxic agents used in their preparation. However, drug loading and release need to be optimized. In the second part of this thesis, oil-in-water microemulsions (O/W MEs) based on medium-chain triglycerides were formulated as drug carriers and solubility enhancers for amphotericin B (AmB). Phase diagrams were constructed using surfactant blends with hydrophilic-lipophilic balance values between 9.7 and 14.4. The drug-free and drug-loaded MEs presented spherical non-aggregated droplets around 80 and 120 nm, respectively, and a low polydispersity index. The incorporation of AmB was high and depended on the volume fraction of the disperse phase. These MEs did not reduce the viability of J774.A1 macrophage-like cells for concentrations up to 25 µg/mL of AmB. Therefore, O/W MEs based on propylene glycol esters of caprylic acid may be considered as suitable delivery systems for AmB.

Les amidons non modifiées et modifiés représentent un groupe d’excipients biodégradables et abondants particulièrement intéressant. Ils ont été largement utilisés en tant qu’excipients à des fins diverses dans des formulations de comprimés, tels que liants et/ou agents de délitement. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose atomisé (SD HASCA) a été récemment proposé comme un excipient hydrophile à libération prolongée innovant dans les formes posologiques orales solides. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose amorphe (HASCA) a d'abord été produit par l'éthérification de l'amidon de maïs à haute teneur en amylose avec le chloroacétate. HASCA a été par la suite séché par atomisation pour obtenir le SD HASCA. Ce nouvel excipient a montré des propriétés présentant certains avantages dans la production de formes galéniques à libération prolongée. Les comprimés matriciels produits à partir de SD HASCA sont peu coûteux, simples à formuler et faciles à produire par compression directe. Le principal objectif de cette recherche était de poursuivre le développement et l'optimisation des comprimés matriciels utilisant SD HASCA comme excipient pour des formulations orales à libération prolongée. A cet effet, des tests de dissolution simulant les conditions physiologiques du tractus gastro-intestinal les plus pertinentes, en tenant compte de la nature du polymère à l’étude, ont été utilisés pour évaluer les caractéristiques à libération prolongée et démontrer la performance des formulations SD HASCA. Une étude clinique exploratoire a également été réalisée pour évaluer les propriétés de libération prolongée de cette nouvelle forme galénique dans le tractus gastro-intestinal. Le premier article présenté dans cette thèse a évalué les propriétés de libération prolongée et l'intégrité physique de formulations contenant un mélange comprimé de principe actif, de chlorure de sodium et de SD HASCA, dans des milieux de dissolution biologiquement pertinentes. L'influence de différentes valeurs de pH acide et de temps de séjour dans le milieu acide a été étudiée. Le profil de libération prolongée du principe actif à partir d'une formulation de SD HASCA optimisée n'a pas été significativement affecté ni par la valeur de pH acide ni par le temps de séjour dans le milieu acide. Ces résultats suggèrent une influence limitée de la variabilité intra et interindividuelle du pH gastrique sur la cinétique de libération à partir de matrices de SD HASCA. De plus, la formulation optimisée a gardé son intégrité pendant toute la durée des tests de dissolution. L’étude in vivo exploratoire a démontré une absorption prolongée du principe actif après administration orale des comprimés matriciels de SD HASCA et a montré que les comprimés ne se sont pas désintégrés en passant par l'estomac et qu’ils ont résisté à l’hydrolyse par les α-amylases dans l'intestin. Le deuxième article présente le développement de comprimés SD HASCA pour une administration orale une fois par jour et deux fois par jour contenant du chlorhydrate de tramadol (100 mg et 200 mg). Ces formulations à libération prolongée ont présenté des valeurs de dureté élevées sans nécessiter l'ajout de liants, ce qui facilite la production et la manipulation des comprimés au niveau industriel. La force de compression appliquée pour produire les comprimés n'a pas d'incidence significative sur les profils de libération du principe actif. Le temps de libération totale à partir de comprimés SD HASCA a augmenté de manière significative avec le poids du comprimé et peut, de ce fait, être utilisé pour moduler le temps de libération à partir de ces formulations. Lorsque les comprimés ont été exposés à un gradient de pH et à un milieu à 40% d'éthanol, un gel très rigide s’est formé progressivement sur leur surface amenant à la libération prolongée du principe actif. Ces propriétés ont indiqué que SD HASCA est un excipient robuste pour la production de formes galéniques orales à libération prolongée, pouvant réduire la probabilité d’une libération massive de principe actif et, en conséquence, des effets secondaires, même dans le cas de co-administration avec une forte dose d'alcool. Le troisième article a étudié l'effet de α-amylase sur la libération de principe actif à partir de comprimés SD HASCA contenant de l’acétaminophène et du chlorhydrate de tramadol qui ont été développés dans les premières étapes de cette recherche (Acetaminophen SR et Tramadol SR). La modélisation mathématique a montré qu'une augmentation de la concentration d’α-amylase a entraîné une augmentation de l'érosion de polymère par rapport à la diffusion de principe actif comme étant le principal mécanisme contrôlant la libération de principe actif, pour les deux formulations et les deux temps de résidence en milieu acide. Cependant, même si le mécanisme de libération peut être affecté, des concentrations d’α-amylase allant de 0 UI/L à 20000 UI/L n'ont pas eu d'incidence significative sur les profils de libération prolongée à partir de comprimés SD HASCA, indépendamment de la durée de séjour en milieu acide, le principe actif utilisé, la teneur en polymère et la différente composition de chaque formulation. Le travail présenté dans cette thèse démontre clairement l'utilité de SD HASCA en tant qu'un excipient à libération prolongée efficace. / Unmodified and modified starches represent a particularly interesting group of biodegradable and abundant excipients. They have been widely used as excipients for various purposes in tablet formulations, such as binders and/or disintegrants. Spray-dried high-amylose sodium carboxymethyl starch (SD HASCA) was recently proposed as an innovating hydrophilic excipient for sustained-release (SR) in solid oral dosage forms. Amorphous high-amylose sodium carboxymethyl starch (HASCA) was first produced by the etherification of high-amylose corn starch with chloroacetate. HASCA was then spray dried to obtain SD HASCA. This new excipient has shown advantageous and effective properties in the production of SR delivery systems. SR matrix tablets prepared from SD HASCA are inexpensive, simple to formulate and easy to produce by direct compression. The main objective of the present research was to continue the development and optimization of matrix tablets using SD HASCA as the retarding excipient in view of their ultimate application as sustained drug-release delivery systems for oral administration. For this purpose, dissolution tests simulating some of the most relevant physiological conditions of the gastrointestinal tract, taking into account the nature of the polymer under investigation, were employed to evaluate the drug-release characteristics and demonstrate the performance of SD HASCA SR formulations. An exploratory clinical study was also carried out to evaluate the SR properties of this new drug delivery system in the gastrointestinal tract. The first article presented in this thesis evaluated the drug-release characteristics and the physical integrity of formulations containing a compressed blend of drug, sodium chloride and SD HASCA in biorelevant media. The influence of different acidic pH values and residence times was investigated. The SR profile from an optimized SD HASCA formulation was not significantly affected by both the acidic pH value and the residence time in the acidic medium. These results suggest a limited influence of intra- and inter-subject variability of gastric pH on the release kinetics from SD HASCA matrices. In addition, the optimized formulation maintained its integrity throughout the duration of the dissolution tests. The exploratory in vivo study demonstrated extended drug absorption after oral administration of SD HASCA matrix tablets and that the matrix tablets did not disintegrate while passing through the stomach and resisted hydrolysis by α-amylase in the intestine. The second article reports the development of once-daily and twice-daily SD HASCA tablets containing tramadol hydrochloride (100 mg and 200 mg). These SR formulations presented high crushing strengths without requiring the addition of binders, which facilitates tablet processing and handling. The compression force (CF) applied to produce the tablets did not significantly affect the drug-release profiles. The total release time from SD HASCA tablets increased significantly in function of the tablet weight and can be used to modulate the total release time from theses formulations. When exposed to a pH gradient and to a 40% ethanol medium, a very rigid gel formed progressively on the surface of the tablets providing controlled drug-release properties. These properties indicated that SD HASCA is a robust excipient for oral, sustained drug-release, likely to minimize the possibility of dose dumping and consequent adverse effects, even when co-administered with high doses of alcohol. The third article investigated the effect of α-amylase on drug-release from previously developed SD HASCA tablets containing acetaminophen and tramadol hydrochloride (Acetaminophen SR and Tramadol SR). Mathematical modeling showed that an increase in α-amylase concentration resulted in an increase of polymer erosion over drug diffusion as the main mechanism controlling drug-release, for both formulations and both residence times in acidic medium. However, even if the mechanism of release was affected, α-amylase concentrations ranging from 0 IU/L to 20000 IU/L did not significantly affect the drug-release profiles from SD HASCA SR tablets, regardless of the residence time in acidic medium, the drug used, the polymer content and the different composition of each formulation. The work presented in this thesis clearly demonstrates the value of SD HASCA as an efficient SR excipient.