In these studies we sought to determine the role of Fyn kinase and ADAM10 in B cell biology. A disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10) is a zinc dependent proteinase related to matrix metalloproteinases. ADAM10 has emerged as a key regulator of cellular processes by cleaving and shedding extracellular domains of multiple transmembrane receptors and ligands. In particular, ADAM10 has been identified as a key regulator of lymphocyte development. Here we report that ADAM10 is dispensable for early B cell development within the bone marrow. However, deletion of ADAM10 from all peripheral B cells or in post-switch cells leads to severe impairments in humoral responses. When ADAM10 was deleted from all peripheral B cells a decrease in antigen specific IgG production was seen both with respect to serum levels and IgG ASCs, indicating that plasma cell (PC) differentiation is influenced. Cells producing high affinity antigen specific antibodies were particularly affected, consistent with defects in germinal center (GC) reactions. Moreover, changes in lymphoid architecture were also observed. Consistent with these findings, follicular dendritic cell (FDC)-reticula was undetectable following immunization. On the other hand, when ADAM10 was deleted in post-switch B cells, GC formation and lymphoid architecture were not impaired. Despite normal architecture, however, antibody production was still affected, likely due to abnormal gene expression in ADAM10-deficient PCs. Consistent with this hypothesis, PCs isolated from ADAM10Δ/ΔIgG1-cre+/- showed decreased expression of genes that facilitate plasma cell differentiation and function and increased expression of Bcl6, an inhibitor of PC differentiation. Fyn kinase is a member of the Src protein tyrosine kinase. Fyn is widely expressed in many cell types, including lymphocytes. Fyn has been shown to interact with both the B cell and T cell receptor (BCR and TCR, respectively). While Fyn-deletion did not impair the development of immature T cells and B cells, TCR signaling was altered in mature T cells. Our results demonstrate that Fyn-KO mice have significantly low basal levels of IgG1 and IgG2a. Additionally, these mice displayed delayed kinetics in the production of NP-specific IgG1 and IgG2b, and significantly low NP-specific IgG2a after a T-dependent immunization protocol. Defects in antibody production correlated with significantly reduced numbers of GC B cells, TFH cells and splenic PCs. Moreover, Fyn-KO B cells showed decreased production antibody following in vitro activation. Our results thus demonstrate that Fyn-mediated signaling and B cell ADAM10 expression are necessary for optimal humoral responses.

L’autophagie est un processus catabolique lié aux lysosomes. L’autophagie joue un rôle dans la biologie des lymphocytes et dans la réponse immunitaire en générale. Nous avons montré une dérégulation de l’autophagie dans les lymphocytes provenant de souris développant un lupus et de patients atteints d’un lupus érythémateux disséminé. Nous avons ensuite cherché à définir le rôle potentiel de l’autophagie des lymphocytes dans l’activation et le maintien des réponses humorales normales et pathologiques. Ainsi, nous avons généré des souris déficientes en autophagie spécifiquement dans les lymphocytes B. Ces modèles de souris nous ont permis de montrer que l’autophagie ne jouait pas de rôle majeur dans la mise en place de la réponse immunitaire humorale à court terme. Cependant, l’étude du même modèle murin sur fond génétique prédisposant à une auto-immunité systémique a démontré un rôle de l’autophagie dans la production d’auto-anticorps anti-nucléaires et dans le maintien d’un fort nombre de plasmocytes. L’autophagie est donc importante pour l’initiation de l’activation des lymphocytes B et leur survie en contexte d’auto-immunité à long terme. Ce modèle nous a également permis de montrer que l’absence d’autophagie lors de la stimulation du BCR compromet sa polarisation, conjointe à celle des molécules complexe majeur d’histocompatibilité de classe II et des lysosomes. Ce phénomène est important dans la mise en place de la synapse immunologique, structure qui permet la dégradation et l’internalisation d’antigène particulaires. Nous avons pu mettre en évidence que l’inhibition de l’autophagie impacte effectivement la présentation d’antigènes particulaires internalisés via le BCR aux lymphocytes T. Ainsi, la modulation de l’autophagie dans les lymphocytes pourrait permettre à plusieurs niveaux de limiter l’activation et la survie des lymphocytes autoréactifs dans le contexte de maladies auto-immunes. / Macroautophagy, called autophagy, is a catabolic lysosomal process. Macroautophagy was recently shown to regulate the immune response especially by regulating lymphocyte biology. We demonstrated that autophagy is deregulated in T cells from lupus mouse models and patients suffering from systemic lupus erythematosus. We suggest that autophagy could regulate the survival of autoreactive lymphocytes during lupus. We then wanted to better understand the role of autophagy in normal and pathologic humoral responses. We have generated mouse models conditionally deficient for ATG5 in B cells. In accordance with previous studies, we show that autophagy is dispensable for B cell survival and activation under short-term B cell receptor (BCR) activation. We then investigated long-term immunity on a spontaneous model of autoimmunity. In autoimmune-prone mice deficient for autophagy in B cells, we demonstrate that autophagy is important to maintain high levels of anti-nuclear auto-antibodies, and high number of long-lived plasma cells in the bone marrow. With these same mouse models, we show that autophagy contributes to the polarization of internalized BCR after stimulation, together with the recruitment of lysosomes and MHCMII molecules-containing compartments. The polarization of B cells is particularly important for the acquisition of particulate antigens for B cells. We postulate that ATG5 and possibly the autophagic machinery could facilitate the formation of the immune synapse. We indeed demonstrate that presentation of immobilized antigens to T cells is compromised in the absence of ATG5 in B cells. Thus, modulating autophagy in lymphocytes, could limit at several levels the activation and/or survival of autoreactive lymphocytes during autoimmunity.

Infectant près de 185 millions d’individus dans le monde, le virus de l’hépatite C (VHC) est une cause importante d’hépatite virale chronique, qui mène éventuellement à la cirrhose et au carcinome hépatocellulaire. Dans les pays développés, la principale cause d’infection chez les enfants est la transmission de la mère à l’enfant (TME) durant la grossesse ou lors de l’accouchement et qui se produit dans <10% des cas. L’évolution de l’hépatite C lors de la grossesse est mal comprise, on observe une augmentation de la charge virale au 3e trimestre de la grossesse qui redescend suite à l’accouchement. Cette diminution s’accompagne d’une augmentation significative des marqueurs sériques d’inflammation du foie et d’une détérioration de la fonction hépatique chez une proportion importante des femmes infectées. Le développement de modèles de culture in vitro a permis de reconnaître l’implication de la réponse humorale neutralisante anti-VHC dans la progression clinique de l’hépatite C. Par contre, l’impact des anticorps (AC) neutralisants et non-neutralisants dans la pathologie de l’hépatite C en grossesse reste un sujet peu étudié. Dans cette étude, nous avons mis en évidence que la pression sélective exercée par les réponses neutralisantes anti-VHC menait à une diversification de la quasiespèce du VHC chez les femmes mono-infectées ou co-infectées par le VIH. Cette diversification est associée à une fréquence réduite de TME et à des niveaux d’inflammation hépatique plus faible chez les patientes mono-infectées uniquement. Chez les patientes co-infectées, la diversification de la quasiespèce et la présence de réponses neutralisantes ne suffisent pas à diminuer les risques de TME. Nous proposons également un rôle pour les anticorps (AC) non-neutralisants dans l’exacerbation de l’inflammation hépatique chez les femmes ne présentant pas de réponses neutralisantes anti-VHC. Cette inflammation pourrait être reliée à la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), dont le rôle dans le contrôle de la virémie reste à déterminer. Les différentes avenues entreprises afin d’élaborer un essai permettant de quantifier la réponse ADCC spécifique au VHC seront exposées dans cet ouvrage. Cette étude a ainsi contribué à mieux comprendre le rôle des réponses humorales neutralisantes et l’implication probable de l’ADCC dans la pathogénèse de l’hépatite C en grossesse. / Almost 185 million people worldwide are infected with hepatitis C virus (HCV) and are at risk of developing cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In developed countries, the major cause of infection in children is mother-to-child transmission (MTCT), which occurs in <10% of cases during pregnancy or at delivery. For reasons that remain poorly understood, HCV viral load increases in the third trimester of gestation and decreases following delivery. This situation is often followed by elevated serum markers of liver inflammation and by an exacerbation of hepatic pathology in an important fraction of infected women. The development of in vitro culture models enabled the recognition of the implication of humoral immune responses in the clinical evolution of hepatitis C. Nonetheless, the impact of neutralizing antibodies (AB) and non-neutralizing AB in the pathology of hepatitis C in pregnancy has been under-investigated. In this study, we report evidence that the selective pressure exerted by the neutralizing responses against HCV is responsible for the diversification of HCV quasispecies in HCV mono-infected women and women co-infected with HCV and HIV. This diversification was associated with a reduced frequence of MTCT and with reduced hepatic inflammation in mono-infected patients only. In co-infected patients, quasispecies diversification and the presence of neutralizing antibodies are not sufficient to reduce the risk of MTCT. We also propose a role for non-neutralizing AB in the exacerbation of hepatic inflammation in women without neutralizing activity against HCV. The elevated hepatic inflammation could be linked to the antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), the role of which has yet to be defined in the control of HCV viremia. In the aim of elaborating a quantitative assay to measure ADCC specific for HCV, different approaches have been tested and will be presented in this monograph. This study has contributed to a better understanding of the role of neutralizing humoral responses and the likely implication of ADCC in the pathogenesis of hepatitis C in pregnancy.