L'hyperaldostéronisme primaire (HAP) est la plus fréquente cause identifiable de l'hypertension, et résulte de la production autonome d'aldostérone par les glandes surrénales. Chez la souris, la délétion génétique des canaux TASK1 et TASK3 provoque des changements biochimiques qui imitent HAP humain. Ces canaux permet la sortie de K+ et polarise le potentiel de la membrane des cellules glomérules. Nous avons étudié la variation et l'expression de KCNK3 et 9 chez l'homme. Notre étude d'association à montré aucune association d'HAP avec n'importe quel SNP au niveau de l'ensemble du génome. Le séquençage de l'ADN de la lignée germinale dans 825 cas d'HAP, et 41 échantillons d'ADN tumoral a abouti à 14 variantes différents dans KCNK3 et 9 dans la lignée germinale, dont 6 non-synonyme, 8 synonyme. Des tests in vitro n'ont montré aucune perte de la fonction du canal. Aucun changement de séquence somatique à été trouvé. L'hybridation-in-situ dans 6 glandes surrénales contrôle (CA) et 20 glandes adénomes produisant l'aldostérone (APA) a montré que KCNK3 été fortement exprimée dans les trois couches du cortex, tandis que l'expression de KCNK9 était faible et limitée au glomérule en CA. Dans les APA, l'expression de KCNK3 a été détectée, alors que l'expression KCNK9 était faible et hétérogène. Le transcriptome de 43 APA et 11 CA a révélé une légère surexpression de KCNK3 dans les APA, en corrélation avec l'expression de CYP11B2. La surexpression de TASK1 dans les APA peut être secondaire à un phénomène épigénétique. Alors que la variation de l'ADN est incompatible avec un rôle causal, il peut y avoir une possible contribution des changements d'expression de TASK1 dans HAP humain. / Hypertension is the leading cause of human mortality globally. Representing about a tenth of all patients, Primary Aldosteronism (PA) is the commonest identifiable cause of hypertension, and results from the autonomous production of aldosterone by the adrenal glands. The two principal sub-types are Bilateral Adrenal Hyperplasia (BAH), and Aldosterone Producing Adenoma (APA), which account for two-thirds and one-third of the cases respectively. The molecular etiology of primary aldosteronism has remained elusive until recently, when through an exome sequencing study, mutations in the potassium channel-coding gene KCNJ5 were found to cause PA in humans. These mutations were found in up to 40% of APAs, and only in a rare familial variety of BAH. A subsequent exome sequencing study identified mutations in ATPase famile genes in about 7% of APAs, bringing the total genetic yield to about 47%. The molecular pathology of more than half of APAs and of most BAHs remain unexplained. In mouse models, the genetic deletion of TASK-1 and TASK-3 potassium channels cause biochemical changes that resemble those seen in human PA. TASK 1 and TASK 3 are background ‘leak’ potassium channels, which by permitting the outward flow of K+ ions, polarise the adrenal glomerulosa cell membrane potential. The genetic removal of these channels therefore results in a marked depolarization of the glomerulosa cells, leading to their increased aldosterone secretory function, diagnosed as PA. In humans, the contribution of TASK-1 and TASK-3 channel dysfunction to PA has been negated by sequencing studies of the genes that code for these channels (KCNK3 and KCNK9 respectively). However, these studies have included only a small number of patients, motivating a comprehensive molecular analysis of the genes in a large patient cohort. To this end, we investigated commonly and rarely occuring genetic variation in, and expression of, KCNK 3 and KCNK9. Our Genome Wide Association Study (GWAS) showed no association of PA (either APA or BAH subtypes or both) with any single SNP at the genome-wide level of statistical significance. At sub genome-wide levels, however, SNPs of KCNK3 did associate, and the association signal strengthened when specific combinations of the SNPs were tested for association at a time. While no inherited or acquired DNA sequence variation in KCNK3 and KCNK9 have ever been detected in PA patients, on sequencing germline DNA in 825 PA cases, and 41 tumoral DNA samples, 14 different coding single nucleotide variants in KCNK3 and KCNK9 were found in the germline DNA only, of which 6 were non-synonymous, and 8 synonymous. However, on heterologous expression and electrophysiology, these did not affect channel function. No somatic sequence changes were found.Expression of KCNK3 and KCNK9 was investigated by in-situ hybridization in 6 control adrenal glands and 20 adrenals from patients with APA. In the control adrenal, the KCNK3 gene was highly expressed in all three layers of the adrenal cortex, while KCNK9 expression was barely detectable, and restricted to the zona glomerulosa. In APAs, KCNK3 expression was detected in a majority of patients, while KCNK9 expression was low and heterogeneous among samples. Strikingly, KCNK9 was highly expressed in the hyperplastic peritumoral zona glomerulosa, possibly due to a positive feed-back by high circulating aldosterone or low potassium levels on KCNK9 expression. Transcriptome profiling of 43 APA and 11 control adrenals revealed a slight, but significantly increased expression of KCNK3 in adenomas compared to controls that correlated positively with CYP11B2 expression. The quantitative changes of TASK1 expression observed in APAs may be secondary to a primary epigenetic phenomenon or be secondary to increased aldosterone production due to dysregulation of master transcription factors or upstream signaling cascades in the aldosterone biosynthetic pathway.

Les tumeurs du cortex surrénalien sont variées et fréquentes dans la population. Bien que des mutations aient été identifiées dans certains syndromes familiaux, les causes génétiques menant à la formation de tumeur du cortex surrénalien ne sont encore que peu connues. Un sous-type de ces tumeurs incluent les hyperplasies macronodulaires et sont pressenties comme la voie d’entrée de la tumorigenèse du cortex surrénalien. L’événement génétique le plus fréquemment observé dans ces tumeurs est l’expression aberrante d’un ou plusieurs récepteurs couplés aux protéines G qui contrôle la production de stéroïdes ainsi que la prolifération cellulaire. L’événement génétique menant à l’expression aberrante de ces récepteurs est encore inconnu. En utilisant le récepteur au peptide insulinotropique dépendant du glucose (GIP) comme modèle, cette étude se propose d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression aberrante du récepteur au GIP (GIPR) dans les tumeurs du cortex surrénalien. Une partie clinique de cette étude se penchera sur l’identification de nouveaux cas de tumeurs surrénaliennes exprimant le GIPR de façon aberrante. Les patients étudiés seront soumis à un protocole d’investigation in vivo complet et les tumeurs prélevées seront étudiées extensivement in vitro par RT-PCR en temps réel, culture primaire des tumeurs, immunohistochimie et biopuces. Le lien entre le GIP et la physiologie normal sera également étudiée de cette façon. Une autre partie de l’étude utilisera les nouvelles techniques d’investigation à grande échelle en identifiant le transcriptome de différents cas de tumeurs exprimant le GIPR de façon aberrante. L’importance fonctionnelle des gènes identifiée par ces techniques sera confirmée dans des modèles cellulaires. Cette étude présente pour la première des cas de tumeurs productrices d’aldostérone présentant des réponses aberrantes, auparavant confinées aux tumeurs productrice de cortisol ou d’androgènes surrénaliens. Le cas probant présenté avait une production d’aldostérone sensible au GIP, le GIPR était surexprimé au niveau de l’ARNm et un fort marquage a été identifié dans la tumeur spécifiquement. Dans les surrénales normales, cette étude démontre que le GIP est impliqué dans le contrôle de la production d’aldostérone. Ces résultats ont été confirmés in vitro. Finalement, le profilage à grande échelle des niveaux d’expression de tous les gènes du génome a permis d’isoler une liste de gènes spécifiquement liés à la présence du GIPR dans des hyperplasies du cortex surrénalien. Cette liste inclus la périlipine, une protéine de stockage des lipides dans les adipocytes et la glande surrénale, dont l’expression est fortement réprimée dans les cas GIP-dépendant. Des études dans un modèle cellulaire démontrent que la répression de ce gène par siRNA est suffisante pour induire l’expression du récepteur au GIP et que cette protéine est impliquée dans la stimulation de la stéroïdogénèse par le GIP. En alliant des méthodes d’investigation in vivo de pointe à des techniques in vitro avancée, cette étude offre de nouveaux regards sur les liens entre le GIP et la physiologie de la glande surrénale, que ce soit dans des conditions normales ou pathologiques. / Tumors of the adrenal cortex are varied and frequently found in the population. Aside from rare family cases in which mutations have been identified, the genetic events leading to the formation of adrenocortical tumors remain obscure. A subtype of these tumors includes macronodular hyperplasias, now percieved as the entry point of adrenocortical tumorigenesis. The most commonly observed molecular event in these cases is the presence of aberrantly expressed G-protein coupled receptor that drive steroid production and cellular proliferation. The genetic events leading to these aberrant levels of expression are unknown. This study will use the Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) receptor as a model to identify the molecular mecanisms leading to the aberrant expression of the GIP receptor (GIPR) in adrenocortical tumors. The first part of the study will be a clinical investigation of new cases of adrenocortical tumors to screen for aberrant responses to GIP in various types of these tumors. The patients will be evaluated by a thorough clinical investigation protocol and the resected tumors will be extensively analysed in vitro, using real-time RT-PCR, immunohistochemistry, microarray and primary cultures of the tumors. The link between GIP and the normal physiology of the adrenal cortex will also be assessed in normal subjects. The second part of the study will use novel large-scale investigation techniques to determine the transcriptome of different cases of adrenocortical tumors expressing aberrant levels of the GIPR. The functional importance of identified genes will be assessed in cellular models. This study presents the first cases of aldosterone-producing tumors with aberrant responses to hormones, previously confined to cortisol- or androgen producing tumors. The case presented showed an aldosterone production sensitive, among others, to GIP. The GIPR’s mRNA was strongly over expressed and a specific staining was observed in immunohistochemistry. The responses were confirmed in primary cultures of the tumor. In normal adrenals, a role for the control of aldosterone by GIP was also demonstrated. Finally, large-scale profiling of the transcriptome led to the identification of a list of genes with expression levels strictly related to the presence of the GIPR in adrenocortical hyperplasias. One of these genes, perilipin, was strongly repressed specifically in GIP-dependent cases. siRNA techniques were used in a cellular model and confirmed that the repression of perilipin is sufficient to induce the expression of GIPR and that this protein is implicated in the GIP induced steroidogenesis. Allying state-of-the-art in vivo investigation methods to advanced in vitro techniques, the present study identifies novel insights on the link between GIP and the normal adrenal physiology, in normal and pathological conditions.

Les tumeurs du cortex surrénalien sont variées et fréquentes dans la population. Bien que des mutations aient été identifiées dans certains syndromes familiaux, les causes génétiques menant à la formation de tumeur du cortex surrénalien ne sont encore que peu connues. Un sous-type de ces tumeurs incluent les hyperplasies macronodulaires et sont pressenties comme la voie d’entrée de la tumorigenèse du cortex surrénalien. L’événement génétique le plus fréquemment observé dans ces tumeurs est l’expression aberrante d’un ou plusieurs récepteurs couplés aux protéines G qui contrôle la production de stéroïdes ainsi que la prolifération cellulaire. L’événement génétique menant à l’expression aberrante de ces récepteurs est encore inconnu. En utilisant le récepteur au peptide insulinotropique dépendant du glucose (GIP) comme modèle, cette étude se propose d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression aberrante du récepteur au GIP (GIPR) dans les tumeurs du cortex surrénalien. Une partie clinique de cette étude se penchera sur l’identification de nouveaux cas de tumeurs surrénaliennes exprimant le GIPR de façon aberrante. Les patients étudiés seront soumis à un protocole d’investigation in vivo complet et les tumeurs prélevées seront étudiées extensivement in vitro par RT-PCR en temps réel, culture primaire des tumeurs, immunohistochimie et biopuces. Le lien entre le GIP et la physiologie normal sera également étudiée de cette façon. Une autre partie de l’étude utilisera les nouvelles techniques d’investigation à grande échelle en identifiant le transcriptome de différents cas de tumeurs exprimant le GIPR de façon aberrante. L’importance fonctionnelle des gènes identifiée par ces techniques sera confirmée dans des modèles cellulaires. Cette étude présente pour la première des cas de tumeurs productrices d’aldostérone présentant des réponses aberrantes, auparavant confinées aux tumeurs productrice de cortisol ou d’androgènes surrénaliens. Le cas probant présenté avait une production d’aldostérone sensible au GIP, le GIPR était surexprimé au niveau de l’ARNm et un fort marquage a été identifié dans la tumeur spécifiquement. Dans les surrénales normales, cette étude démontre que le GIP est impliqué dans le contrôle de la production d’aldostérone. Ces résultats ont été confirmés in vitro. Finalement, le profilage à grande échelle des niveaux d’expression de tous les gènes du génome a permis d’isoler une liste de gènes spécifiquement liés à la présence du GIPR dans des hyperplasies du cortex surrénalien. Cette liste inclus la périlipine, une protéine de stockage des lipides dans les adipocytes et la glande surrénale, dont l’expression est fortement réprimée dans les cas GIP-dépendant. Des études dans un modèle cellulaire démontrent que la répression de ce gène par siRNA est suffisante pour induire l’expression du récepteur au GIP et que cette protéine est impliquée dans la stimulation de la stéroïdogénèse par le GIP. En alliant des méthodes d’investigation in vivo de pointe à des techniques in vitro avancée, cette étude offre de nouveaux regards sur les liens entre le GIP et la physiologie de la glande surrénale, que ce soit dans des conditions normales ou pathologiques. / Tumors of the adrenal cortex are varied and frequently found in the population. Aside from rare family cases in which mutations have been identified, the genetic events leading to the formation of adrenocortical tumors remain obscure. A subtype of these tumors includes macronodular hyperplasias, now percieved as the entry point of adrenocortical tumorigenesis. The most commonly observed molecular event in these cases is the presence of aberrantly expressed G-protein coupled receptor that drive steroid production and cellular proliferation. The genetic events leading to these aberrant levels of expression are unknown. This study will use the Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) receptor as a model to identify the molecular mecanisms leading to the aberrant expression of the GIP receptor (GIPR) in adrenocortical tumors. The first part of the study will be a clinical investigation of new cases of adrenocortical tumors to screen for aberrant responses to GIP in various types of these tumors. The patients will be evaluated by a thorough clinical investigation protocol and the resected tumors will be extensively analysed in vitro, using real-time RT-PCR, immunohistochemistry, microarray and primary cultures of the tumors. The link between GIP and the normal physiology of the adrenal cortex will also be assessed in normal subjects. The second part of the study will use novel large-scale investigation techniques to determine the transcriptome of different cases of adrenocortical tumors expressing aberrant levels of the GIPR. The functional importance of identified genes will be assessed in cellular models. This study presents the first cases of aldosterone-producing tumors with aberrant responses to hormones, previously confined to cortisol- or androgen producing tumors. The case presented showed an aldosterone production sensitive, among others, to GIP. The GIPR’s mRNA was strongly over expressed and a specific staining was observed in immunohistochemistry. The responses were confirmed in primary cultures of the tumor. In normal adrenals, a role for the control of aldosterone by GIP was also demonstrated. Finally, large-scale profiling of the transcriptome led to the identification of a list of genes with expression levels strictly related to the presence of the GIPR in adrenocortical hyperplasias. One of these genes, perilipin, was strongly repressed specifically in GIP-dependent cases. siRNA techniques were used in a cellular model and confirmed that the repression of perilipin is sufficient to induce the expression of GIPR and that this protein is implicated in the GIP induced steroidogenesis. Allying state-of-the-art in vivo investigation methods to advanced in vitro techniques, the present study identifies novel insights on the link between GIP and the normal adrenal physiology, in normal and pathological conditions.