Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Du fait de leur haute stabilité et bas coût de production, les aptamères suscitent un intérêt croissant, depuis près de 20 ans, dans le design de biocapteurs en tant qu'élément de reconnaissance idéal. Le but de ce travail de thèse est de démontrer l'intérêt et la pertinence d'un outil tel qu'une biopuce à aptamères, associant les avantages des sondes aptamères à ceux d'une détection par SPRi (Surface Plasmon Resonance imaging), permettant une détection sans marquage et en temps réel d'interactions moléculaires. Dans ce but, deux aptamères anti-thrombine (APT1 = 5′- GGT-TGG-TGT-GGT-TGG -3′ et APT2 = 5′-AGT-CCG-TGG-TAG-GGG-AGG-TTG-GGG-TGA-CT-3′) ont été choisis comme objets d'étude modèles. Ce choix a permis d'orienter différents axes de recherche : utilisés indépendamment comme sondes lors de l'élaboration de notre biopuce, ils ont tout d'abord permis de réaliser une détection cinétique optimisée de la thrombine, avec des performances remarquables pour une détection de ce type, ainsi que le calcul de constantes de dissociation en solution et à la surface des biopuces. Mais au-delà d'un simple biocapteur, la biopuce a également pu être utilisée comme véritable plateforme d'étude de la thrombine et de ses interactions, au sein de structures plus complexes telles que la structure « sandwich » entre les deux aptamères, ou d'autres interactions impliquant la thrombine en tant qu'acteur de la cascade de coagulation (inhibition de la thrombine par l'antithrombine III et le cofacteur II de l'héparine, transformation de la prothrombine au sein du complexe prothrombinase). / For 20 years, aptamers have been raising an increasing interest for biosensor applications as replacements for antibodies, due to their high stability and low cost. The main objective of this Ph.D. thesis is to show the great capacities of an aptamer biochip that combines the advantages of aptamer probes associated with a SPRi (Surface Plasomn Resonance imaging) detection to monitor, in real-time and in a label-free manner, molecular interactions occurring on the surface of the biochip. Two aptamers selected against the thrombin protein (APT1 = 5′- GGT-TGG-TGT-GGT-TGG -3′ and APT2 = 5′-AGT-CCG-TGG-TAG-GGG-AGG-TTG-GGG-TGA-CT-3′) were chosen as models for our study. This choice led to the exploration of different lines of research. First, both aptamers were used independently to develop a kinetic biosensor with remarkable performances for the quantification of thrombin. This tool served to determine independently, and compare, both the solution- and surface-phase affinities of the trombin-APT2 interaction. But more than a simple and effective biosensor, this kind of biochip represents a true platform to study the protein and its interactions within complex structures, such as the sandwich-like architecture with APT1 and APT2, or its interactions with other factors of the coagulation cascade (inhibition of thrombin by antithrombin III and heparin cofactor II, conversion of prothrombin into thrombin by the prothrombinase complex).

Les chloroéthènes sont les polluants majeurs des eaux souterraines et des nappes phréatiques. De par leur toxicité et leur effet cancérigène, ils représentent une préoccupation majeure pour les autorités publiques et sanitaires. La restauration des sites contaminés est possible par des techniques de dépollution biologique impliquant les microorganismes (bioremédiation microbienne). Cependant, la réussite des traitements dépend à la fois des conditions physicochimiques du site pollué et des capacités de dégradation de la microflore indigène. Ainsi, pour optimiser les processus de décontamination, l’identification et le suivi des différentes populations microbiennes sont indispensables avant et pendant le traitement. Les biopuces ADN fonctionnelles (FGA, Functional Gene Array), outils moléculaires haut débit, sont particulièrement bien adaptées pour des applications en bioremédiation. Leur élaboration nécessite de disposer de logiciels performants pour le design de sondes qui combinent à la fois une forte sensibilité, une très bonne spécificité et un caractère exploratoire, ce dernier étant indispensable pour la détection des séquences connues mais surtout de celles encore jamais décrites au sein d’échantillons environnementaux. Un nouveau logiciel, autorisant la sélection de sondes combinant tous ces critères, a été développé et nommé HiSpOD. Son utilisation pour la construction d’une FGA dédiée aux voies de biodégradation des chloroéthènes a permis d’évaluer l’effet de traitements de biostimulation sur la microflore indigène pour plusieurs sites industriels contaminés. Les données révèlent différentes associations entre microorganismes déhalorespirants qui sont fonction des paramètres environnementaux. / Chlorinated solvents are among the most frequent contaminants found in groundwater and subsurface ecosystems. Because of their high toxicity and carcinogenicity, they represent a serious risk for human health and the environment. Thus, such polluted sites need a rehabilitation treatment. Among remediation solutions, microbial bioremediation represents a less invasive and expensive alternative than physico-chemical treatments. However, the process efficiency greatly depends on the environmental conditions and the microbial populations’ biodegradation capacities. Therefore, bioremediation treatment optimization requires the identification and monitoring of such capacities before and during the treatment. Functional Gene Arrays (FGA), by profiling environmental communities in a flexible and easy-to-use manner, are well adapted for an application in bioremediation. But, constructing efficient microarrays dedicated to microbial ecology requires a probe design step allowing the selection of highly sensitive, specific and explorative oligonucleotides. After a detailed state of the art on probe design strategies suitable for microbial ecology studies, we present new software, called HiSpOD, generating efficient explorative probes for FGA dedicated to environmental applications. Finally, this bioinformatics tool was used to construct a FGA targeting most genes involved in chloroethenes biodegradation pathways which allowed the evaluation of biostimulation treatments conducted on indigenous bacterial populations for several industrial contaminated sites.

La détection rapide et sensible des agents pathogènes est d’une très grande importance pour la biosécurité. Les biopuces sont bien adaptées à cet effet, car elles permettent la détection multiplexe des cibles. Une limitation cruciale des biopuces est leur manque de fiabilité et de sensibilité. L’objectif de cette thèse est de développer une architecture reproductible de biopuces à base de couche mince de silicium amorphe carboné (a-SiC:H) déposée sur un réflecteur en aluminium pour une détection fiable et sensible des pathogènes. Nous avons choisi comme système modèle l’interaction de la toxine alimentaire ochratoxine A (OTA) avec son aptamère AntiOTA de longueur 36mer. Les aptamères (simples brins d’ADN) sont de plus en plus utilisés comme sondes en raison de leur grande spécificité et affinité vis-à-vis d’une large gamme de cibles (i.e. protéines, bactéries…). La stratégie de fabrication consiste en un greffage de monocouches organiques d’acides carboxyliques via des liaisons Si-C robustes, suivi de l’accrochage covalent des aptamères par un couplage peptidique. Les processus de greffage ont été mis au point sur silicium cristallin permettant la quantification des couches greffées par spectroscopie infrarouge en mode ATR (Attenuated total reflexion). La quantification IR des interactions OTA – AntiOTA a été montrée pour la première fois sur des surfaces par IR-ATR. La spécificité de l’aptamère a été démontrée en utilisant une molécule chimiquement similaire (warfarin), pour laquelle l’AntiOTA ne montre aucune affinité. Ces protocoles bien contrôlés ont été transférés sur l’architecture de la biopuce a-SiC:H. Les aptamères immobilisés sont hybridés avec des brins complémentaires marqués avec des fluorophores. En présence de l’OTA une déshybridation des brins complémentaires est attendue, conduisant à une diminution du signal fluorescent. Différentes longueurs de brins complémentaires ont été comparées, montrant jusqu’à 13% de diminution due à l’interaction de l’OTA. / Rapid and sensitive detection of pathogenic targets play a crucial role in biosecurity. Biochips are ideal for this, as they allow easy and multiplex detection of targets. A crucial limitation in biochips is that they often suffer from low reliability and sensitivity. The goal of this thesis is to develop a stable and reproducible architecture for biochips based on an amorphous silicon carbon alloy (a-SiC:H) deposited on an aluminium back-reflector for reliable and sensitive detection of pathogens. On these biochips we introduced the interaction of the food and feed toxin ochratoxin A (OTA) with its 36mer aptamer AntiOTA as a model system. Aptamers (single strands of DNA) are ideal as probes for biochips as they display high specificity and affinity towards a wide range of targets (i.e. proteins, bacteria…). The well-controlled multi-step fabrication process consists of the reliable photochemical grafting of acid-terminated organic monolayers on silicon surfaces by robust Si C bonds, which in turn were functionalized with aptamers by stable peptide coupling. Carrying out this process on crystalline silicon allowed monitoring and quantification of every step by infrared spectroscopy (IR-ATR). The interaction OTA – AntiOTA was shown for the first time on surfaces by IR, and an IR in situ calibration allowed the quantification of OTA which was bound by the aptamers on the surface. The specificity of AntiOTA towards OTA was demonstrated by using a chemically similar molecule (warfarin), for which AntiOTA shows no affinity. The well-controlled protocols were transferred to the a-SiC:H biochip. The immobilized aptamers were hybridized with complementary and fluorescent-labeled DNA-strands. In presence of OTA, dehybridization of the complementary strands is expected, resulting in a decrease of fluorescent signal. Different lengths of complementary strands were compared, exhibiting up to 13% signal decrease due to OTA.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Résumé / Abstract

Comment la vie est-elle apparue sur la Terre ? Quelle chimie prébiotique1 a permis l'émergence d'une biochimie sur la Terre ? Des processus identiques ont-ils été, ou sont-ils encore, à l'oeuvre<br />ailleurs dans le Système solaire ? D'autres voies sont-elles possibles dans des environnements différents de ceux de la Terre primitive ? Quel est le degré de complexité chimique atteint dans<br />les différents environnements planétaires du Système solaire ?<br />Ces questions fondamentales servent de moteur à l'ensemble des travaux de recherche sur lesquels je travaille depuis le doctorat. En résumé, mes travaux sont orientés par des questions liées à<br />l'origine de la matière organique et aux processus qui participent à sa complexification dans les atmosphères et à la surface des corps du Système solaire. Mon outil d'investigation privilégié est la modélisation mais je m'intéresse aussi à l'observation des planètes et à l'analyse des molécules organiques dans la matière extraterrestre.

Outils miniaturisés, polyvalents et sensibles, les biopuces constituent un type d'instrument très prometteur pour la recherche de vie dans le Système solaire. Elles peuvent en effet détecter une grande variété de molécules organiques, ainsi que des bactéries, avec un haut degré de spécificité et de sensibilité. Les biopuces sont actuellement très usitées dans les domaines médical et environnemental, mais aucun instrument à base de biopuce n'a encore été conçu dans le cadre d'une mission spatiale. Pour adapter un tel instrument à ce nouvel environnement, il est nécessaire d'effectuer une étude approfondie de l'impact des contraintes spatiales sur l'ensemble de ses composants.<br /><br />Cette thèse s'insère dans le projet BiOMAS (Biochip for Organic Matter Analysis in Space), financé par le CNES, qui vise à développer une biopuce dédiée au spatial. Le principal objectif de la thèse est d'évaluer la résistance des composants de cette biopuce face aux diverses contraintes spatiales.<br />Dans un premier temps, nous avons étudié la résistance de la lame de la biopuce, c'est-à-dire le support solide de l'instrument. Plusieurs types de matériaux (verre, thermoplatiques, élastomère) ont été comparés en termes de dégazage, résistance aux solvants organiques et comportement thermique et mécanique, afin d'identifier celui qui répond le mieux au cahier des charges que nous avons établi. Parmi les différents candidats testés, le CycloOléfine Copolymère (COC) s'impose comme le meilleur matériau pour la réalisation d'une biopuce spatiale. <br />Dans un second temps, des études de résistance aux contraintes spatiales ont été menées pour la première fois sur des anticorps (qui servent de sondes de reconnaissance dans les biopuces). L'objectif est de déterminer l'évolution de leur comportement lors de cycles thermiques et sous divers types d'irradiations. Nous avons mis en place un outil de simulation performant, sur la base de l'outil Geant 4 du CERN, qui nous a permis de déterminer le type de particules ainsi que les gammes d'énergies pertinentes pour les expériences d'irradiation. Deux campagnes d'irradiation ont été menées sur la plateforme AIFIRA du CENBG à Bordeaux. Nous avons notamment démontré la bonne résistance des anticorps face à des flux de neutrons de faibles énergies.<br /><br />Ce travail de thèse, fortement pluridisciplinaire, a nécessité la mise en place de nombreuses collaborations complémentaires entre des planétologues, des biochimistes, des physiciens nucléaires et des experts en matériaux. Les résultats que nous avons obtenus sont d'une importance capitale pour la réalisation d'une biopuce spatiale opérationnelle et fiable.

La réparation de l'ADN est un processus cellulaire très important comme le montre son implication dans de nombreuses maladies génétiques et la carcinogenèse. Les mécanismes des différents systèmes de réparation présentent des interactions et des complémentarités. Les tests fonctionnels utilisés jusqu'alors pour étudier les activités de réparation ne prennent pas en compte toute cette complexité.<br />Nous avons développé un test in vitro offrant une mesure parallélisée, fonctionnelle et spécifique d'activités enzymatiques de réparation de l'ADN. Pour ce faire, nous avons adapté un test d'excision resynthèse au format biopuce.<br />Nous avons mis au point les différentes étapes du test : la fabrication de la biopuce, la normalisation et l'analyse des données, les conditions de réactions biologiques. Nous avons ensuite validé le test en démontrant que nous mesurions des activités enzymatiques de réparation. Enfin deux expériences applicatives de ce test ont été réalisées. Nous avons tout d'abord mis en évidence la similitude des profils de réparation de trois souches de fibroblastes humains issus de cultures primaires, mais aussi les différences des capacités de réparation qu'il existe entre les fibroblastes, kératinocytes, et cellules mononuclées du sang périphérique. Par la suite, nous avons démontré que la réparation de l'ADN est impliquée dans la réponse adaptative des cellules au rayonnement ionisant. <br />Les applications futures de ce test sont importantes, tant en recherche fondamentale qu'appliquée pour le criblage de molécules, ou encore dans le domaine diagnostic.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal