L’ADN tumoral circulant (ADNtc) porte des altérations spécifiques de la tumeur des patients, qui sont détectables par un acte minimalement invasif. L’ADNtc représente donc un biomarqueur d’intérêt pour le suivi de l’évolution du cancer. Sa détection requière une technique hautement sensible et quantitative. Dans ce contexte, ce travail de thèse a porté sur la quantification et le suivi de l’ADNtc par PCR digitale en gouttelettes (PCRdg). Cet outil permet la détection d’altérations à l’échelle d’un ADN unique, offrant ainsi une sensibilité allant jusqu’à 0.001%. La détection de cet ADNtc a été réalisée par l’évaluation des biomarqueurs tels qu’une mutation spécifique de la tumeur, la fragmentation de l’ADNtc et l’hyperméthylation de séquences cibles. D’une part, nous avons observé que chez les patients atteints de cancer, l’ADN muté circulant est plus fragmenté que l’ADN non muté, et que cet ADN circulant de patients est globalement plus fragmenté que chez les sujets sains. D’autre part, une corrélation entre les pourcentages d’ADN muté et d’ADN hyperméthylé circulants a été observée au cours du suivi de patients. Ceci suggère la possibilité d’un suivi précis et quantitatif de l’ADNtc par l’évaluation de l’hyperméthylation en alternative à la détermination du statut mutationnel. Nous avons ensuite appliqué nos tests de détection de l’ADNtc dans le cadre de deux études cliniques. L’étude PLACOL, incluant 82 patients atteints de cancer colorectal métastatique, a permis de mettre en évidence deux facteurs pronostiques : un seuil de 0.1 ng/mL et la mesure de la pente de décroissance de la concentration en ADN muté ou hyperméthylé circulant. Dans la seconde étude, portant sur le mélanome métastatique dans le contexte d’une thérapie ciblée (vémurafenib), une corrélation inverse entre les concentrations d’ADNtc et de vémurafenib a été observée. Ces résultats suggèrent le potentiel clinique de l’ADNtc pour l’orientation thérapeutique des patients atteints de cancer avancé. / Circulating tumor DNA (ctDNA) carries tumor-specific alterations that are detectable by minimally invasive sampling. It represents a highly pertinent marker for cancer monitoring during patients’ follow-up. CtDNA detection requires a highly sensitive and quantitative technique. In this context, this project focused on ctDNA quantification and monitoring by picoliter-droplet digital PCR. Thanks to the compartmentalization in millions of picoliter droplets, this tool allowed the detection of single DNA molecule with a sensitivity reaching 0.001%. Testing of ctDNA was performed through the evaluation of different potential biomarkers: specific mutations, ctDNA fragmentation, and hypermethylation of target sequences. On one hand, we observed in cancer patients that ctDNA is more fragmented than wild-type DNA, and, globally more fragmented than circulating DNA in healthy individuals. On the other hand, a strong correlation between percentages of hypermethylated and mutated DNA was observed during the follow-up of patients. Such results suggest the feasibility to precisely and quantitatively monitor ctDNA by the evaluation of hypermethylation as an alternative to the determination of mutational status. We have applied such ctDNA detection strategies in the context of two clinical studies. The PLACOL study, enrolling 82 metastatic colorectal cancer patients, allowed to highlight two prognostic factors: a ctDNA concentration threshold of 0.1 ng / mL, and the evaluation of ctDNA decreasing slope. In the second study, ctDNA was monitored in 11 melanoma patients in the context of a targeted therapy (vemurafenib). An inverse correlation between the concentrations of vemurafenib and ctDNA was demonstrated. These results suggest the clinical relevancy of ctDNA in advanced cancer patients, for the optimization of therapeutic management.

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Le suppresseur de tumeur DOK1 (downstream of tyrosine kinases1) est une protéine régulatrice de voies de signalisation impliquées dans des processus cellulaires tel que la prolifération, la migration et l'apoptose. Le rôle suppresseur de tumeur de DOK1 a été démontré dans des modèles animaux. Les souris knock-out pour DOK1 présentent une forte susceptibilité de développer des leucémies, des tumeurs malignes hématologiques, des adénocarcinomes pulmonaires, ainsi que des sarcomes histiocytaires agressifs. En outre, nous avons rapporté précédemment que le gène DOK1 peut être muté et son expression réprimée dans différentes tumeurs malignes humaines, telles que les lignées cellulaires de lymphome de Burkitt (BL) et la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Cependant, les mécanismes de dérégulation de DOK1 restent inconnus, notamment dans les processus de carcinogenèse induite ou non par des oncovirus. Dans ce projet de thèse, nous avons d'abord caractérisé le promoteur de DOK1 et le rôle du facteur de transcription E2F1 comme le principal régulateur de l'expression de DOK1. Nous avons démontré pour la première fois la contribution de DOK1 dans la réponse cellulaire au stress par son rôle suppresseur de prolifération cellulaire et promoteur d'apoptose. Nous avons trouvé que l'expression du gène DOK1 est réprimée dans une variété de cancers humains, y compris le cancer de la tête et du cou, les lymphomes de Burkitt et les cancers du poumon. Cette répression est due à l'hyperméthylation aberrante de DOK1. Nous avons donc étudié les événements épigénétiques, qui sont souvent altérés dans les cancers, et leurs implications dans la répression de DOK1 dans les lignes cellulaire cancéreuses de la tête et du cou. Nous nous sommes par la suite intéressés aux mécanismes de dérégulation de DOK1 par le virus d'Epstein Barr dans le cadre de sa propriété oncogénique dans les lymphocytes B humains ainsi que dans les lignes cancéreuses du lymphome de Burkitt. Nos résultats apportent de nouvelles informations sur les mécanismes de régulation de l'expression de DOK1 dans la carcinogenèse induite ou non par des oncovirus, ce qui pourrait le définir comme un biomarqueur potentiel de cancer et comme une cible intéressante pour des thérapies épigénétiques / The newly identified tumor suppressor DOK1 (downstream of tyrosine kinases1) inhibits cell proliferation, negatively regulates MAP kinase activity, opposes leukemogenesis, and promotes cell spreading, motility, and apoptosis. DOK1 also plays a role in the regulation of immune cell activation, including B cells. The tumor suppressor role of DOK1 was demonstrated in animal models. DOK1 knockout mice show a high susceptibility to develop leukemia, hematological malignancies as well as lung adenocarcinomas and aggressive histiocytic sarcoma. In addition, we previously reported that the DOK1 gene can be mutated and its expression is down-regulated in human malignancies such as Burkitt’s lymphoma cell lines (BL) and chronic lymphocytic leukemia (CLL). However, very little is known about the mechanisms underlying DOK1 gene regulation and silencing in viral- and non viral-related tumorigenesis. In the present project, we first characterized the DOK1 promoter. We have shown the role of E2F1 transcription factor as the major regulator of DOK1 expression and how DOK1 plays a role in DNA stress response though opposing cell proliferation and promoting apoptosis. We demonstrated that DOK1 gene expression is repressed in a variety of human cancers, including head and neck, Burkitt’s lymphoma and lung cancers, as a result of aberrant hypermethylation. We investigated the link between the epigenetic events and DOK1 silencing in non viral head and neck cancer cell lines, and by Epstein Barr virus in relation to its oncogenic activity in human B cells and neoplasia such as Burkitt’s lymphoma. These data provide novel insights into the regulation of DOK1 in viral and non viral-related carcinogenesis, and could define it as a potential cancer biomarker and an attractive target for epigeneticbased therapy

Introduction: Le gène O6-méthylguanine-ADN méthyltransferase (MGMT) code pour une enzyme spécifique réparatrice de l’ADN qui protège les cellules de la toxicité des agents alkylants. Ainsi, l’activité du MGMT est un mécanisme majeur de résistance aux agents alkylants. Il a été démontré qu’une diminution de l’expression du gène MGMT par une hyperméthylation du promoteur résulte en une amélioration de la survie chez les patients avec certains types de tumeurs qui sont traitées avec des agents chimiothérapeuthique alkylants. Objectifs: Déterminer la prévalence de la méthylation du gène MGMT chez des patients avec des cancers épidermoïdes localement avancés de la sphère ORL traités avec chimioradiothérapie et évaluer l’impact de cette méthylation sur la survie. Méthodes: Sur 428 patients consécutifs, traités avec chimioradiothérapie à notre institution et suivis pour un période médiane de 37 mois, 199 spécimens chirurgicaux paraffinés ont été récupérés. L’ADN était extrait et modifié par le traitement au bisulfite. Une réaction en chaîne de la polymérase, spécifique à la méthylation était entreprise pour évaluer l’état de méthylation du promoteur du gène du MGMT. Les résultats de laboratoire étaient corrélés avec la réponse clinique. L’analyse statistique était exécutée à l’aide du test de Fisher pour les données catégoriques et à l’aide des courbes de Kaplan-Meier pour les échecs au traitement. Résultats : Des 199 extraits d’ADN initiaux, 173 (87%) étaient modifiés au bisulfite avec succès. Des ces spécimens modifiés, 71 (41%) ont démontré une hyperméthylation du MGMT. Pour les cas de méthylation et nonméthylation du MGMT, les caractéristiques des patients n’étaient pas significativement différentes. Les taux de réponse étaient 71 et 73% (p=NS) respectivement. Le contrôle locorégional était respectivement 87 et 77% (p=0.26), la survie sans maladie était 80 et 60% (p=0.38), la survie sans métastase à distance était 92 et 78% (p=0.08) et la survie globale était 64 et 62% (p=0.99) à 3 ans. Conclusions : L’état de méthylation du MGMT est fortement prévalent (41%) et semble avoir un possible impact bénéfique sur la survie quand la chimioradiothérapie est administrée aux patients avec des stades avancés de cancers tête et cou. / Background: The O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) gene encodes a specific DNA repair enzyme that protects cells from toxicity of alkylating agents. Thus, MGMT activity is a major mechanism of resistance to alkylating drugs. It has been shown that decreased MGMT gene expression by promoter hypermethylation results in improved survival in patients with certain types of tumors that are treated with alkylating chemotherapeutic agents. Objectives: To determine the prevalence of MGMT methylation in patients with locally advanced Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) treated with chemoradiation therapy and to evaluate the impact of this methylation on survival. Methods: Out of 428 consecutive patients treated with chemoradiation therapy at our institution and followed for a median of 37 months, 199 paraffin embedded biopsy or surgical specimens were retrieved. DNA was extracted and subjected to bisulfite treatment. A methylation specific PCR (MSP) was conducted to assess the methylation status of the MGMT gene promoter. Laboratory data was correlated with clinical response. Statistical analysis was performed using Fisher’s test for categorical data and Kaplan-Meier’s curves and logrank statistics for failure times. Results: From the initial 199 DNA extracts, 173 (87%) were successfully modified with bisulfite. Out of these, 71 (41%) demonstrated hypermethylation of MGMT. For MGMT methylated cases and nonmethylated cases, patients characteristics were not significantly different. Response rates were 71 and 73% (p=NS), respectively. Local control rate (LCR) was respectively 87 and 77% (p=0.26), Disease-free survival (DFS) was 80 and 60% (p=0.38), distant metastasis free survival (DMFS) was 92 and 78% (p=0.08) and overall survival (OS) was 64 and 62% (p=0.99) at 3 years respectively. Conclusions: MGMT methylation status is highly prevalent (41%) and seems to have a possible beneficial impact on survival when chemoradiation therapy is given to patients with advanced stage HNSCC.

Introduction: Le gène O6-méthylguanine-ADN méthyltransferase (MGMT) code pour une enzyme spécifique réparatrice de l’ADN qui protège les cellules de la toxicité des agents alkylants. Ainsi, l’activité du MGMT est un mécanisme majeur de résistance aux agents alkylants. Il a été démontré qu’une diminution de l’expression du gène MGMT par une hyperméthylation du promoteur résulte en une amélioration de la survie chez les patients avec certains types de tumeurs qui sont traitées avec des agents chimiothérapeuthique alkylants. Objectifs: Déterminer la prévalence de la méthylation du gène MGMT chez des patients avec des cancers épidermoïdes localement avancés de la sphère ORL traités avec chimioradiothérapie et évaluer l’impact de cette méthylation sur la survie. Méthodes: Sur 428 patients consécutifs, traités avec chimioradiothérapie à notre institution et suivis pour un période médiane de 37 mois, 199 spécimens chirurgicaux paraffinés ont été récupérés. L’ADN était extrait et modifié par le traitement au bisulfite. Une réaction en chaîne de la polymérase, spécifique à la méthylation était entreprise pour évaluer l’état de méthylation du promoteur du gène du MGMT. Les résultats de laboratoire étaient corrélés avec la réponse clinique. L’analyse statistique était exécutée à l’aide du test de Fisher pour les données catégoriques et à l’aide des courbes de Kaplan-Meier pour les échecs au traitement. Résultats : Des 199 extraits d’ADN initiaux, 173 (87%) étaient modifiés au bisulfite avec succès. Des ces spécimens modifiés, 71 (41%) ont démontré une hyperméthylation du MGMT. Pour les cas de méthylation et nonméthylation du MGMT, les caractéristiques des patients n’étaient pas significativement différentes. Les taux de réponse étaient 71 et 73% (p=NS) respectivement. Le contrôle locorégional était respectivement 87 et 77% (p=0.26), la survie sans maladie était 80 et 60% (p=0.38), la survie sans métastase à distance était 92 et 78% (p=0.08) et la survie globale était 64 et 62% (p=0.99) à 3 ans. Conclusions : L’état de méthylation du MGMT est fortement prévalent (41%) et semble avoir un possible impact bénéfique sur la survie quand la chimioradiothérapie est administrée aux patients avec des stades avancés de cancers tête et cou. / Background: The O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) gene encodes a specific DNA repair enzyme that protects cells from toxicity of alkylating agents. Thus, MGMT activity is a major mechanism of resistance to alkylating drugs. It has been shown that decreased MGMT gene expression by promoter hypermethylation results in improved survival in patients with certain types of tumors that are treated with alkylating chemotherapeutic agents. Objectives: To determine the prevalence of MGMT methylation in patients with locally advanced Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) treated with chemoradiation therapy and to evaluate the impact of this methylation on survival. Methods: Out of 428 consecutive patients treated with chemoradiation therapy at our institution and followed for a median of 37 months, 199 paraffin embedded biopsy or surgical specimens were retrieved. DNA was extracted and subjected to bisulfite treatment. A methylation specific PCR (MSP) was conducted to assess the methylation status of the MGMT gene promoter. Laboratory data was correlated with clinical response. Statistical analysis was performed using Fisher’s test for categorical data and Kaplan-Meier’s curves and logrank statistics for failure times. Results: From the initial 199 DNA extracts, 173 (87%) were successfully modified with bisulfite. Out of these, 71 (41%) demonstrated hypermethylation of MGMT. For MGMT methylated cases and nonmethylated cases, patients characteristics were not significantly different. Response rates were 71 and 73% (p=NS), respectively. Local control rate (LCR) was respectively 87 and 77% (p=0.26), Disease-free survival (DFS) was 80 and 60% (p=0.38), distant metastasis free survival (DMFS) was 92 and 78% (p=0.08) and overall survival (OS) was 64 and 62% (p=0.99) at 3 years respectively. Conclusions: MGMT methylation status is highly prevalent (41%) and seems to have a possible beneficial impact on survival when chemoradiation therapy is given to patients with advanced stage HNSCC.

The development of shape in multicellular organisms has intrigued human minds for millenia. Empowered by modern genetic techniques, molecular biologists are now striving to not only dissect developmental processes, but to exploit their modularity for the design of custom living systems used in bioproduction, remediation, and regenerative medicine. Currently, our capacity to harness this potential is fundamentally limited by a lack of spatiotemporal control over gene expression in multicellular systems. While several synthetic genetic circuits for control of multicellular patterning have been reported, hierarchical induction of gene expression domains has received little attention from synthetic biologists, despite its fundamental role in biological self-organization. In this thesis, I introduce the first synthetic genetic system implementing population-based AND logic for programmed hierarchical patterning of bacterial populations of Escherichia coli, and address fundamental prerequisites for implementation of an analogous genetic circuit into the emergent multicellular plant model Marchantia polymorpha. In both model systems, I explore the use of bacteriophage T7 RNA polymerase as a gene expression engine to control synthetic patterning across populations of cells. In E. coli, I developed a ratiometric assay of bacteriophage T7 RNA polymerase activity, which I used to systematically characterize different intact and split enzyme variants. I utilized the best-performing variant to build a three-color patterning system responsive to two different homoserine lactones. I validated the AND gate-like behavior of this system both in cell suspension and in surface culture. Then, I used the synthetic circuit in a membrane-based spatial assay to demonstrate programmed hierarchical patterning of gene expression across bacterial populations. To prepare the adaption of bacteriophage T7 RNA polymerase-driven synthetic patterning from the prokaryote E. coli to the eukaryote M. polymorpha, I developed a toolbox of genetic elements for spatial gene expression control in the liverwort: I analyzed codon usage across the transcriptome of M. polymorpha, and used insights gained to design codon-optimized fluorescent reporters successfully expressed from its nuclear and chloroplast genomes. For targeting of bacteriophage T7 RNA polymerase to these cellular compartments, I functionally validated nuclear localization signals and chloroplast transit peptides. For spatiotemporal control of bacteriophage T7 RNA polymerase in M. polymorpha, I characterized spatially restricted and inducible promoters. For facilitated posttranscriptional processing of target transcripts, I functionally validated viral enhancer sequences in M. polymorpha. Taking advantage of this genetic toolbox, I introduced inducible nuclear-targeted bacteriophage T7 RNA polymerase into M. polymorpha. I showed implementation of the bacteriophage T7 RNA polymerase/PT7 expression system accompanied by hypermethylation of its target nuclear transgene. My observations suggest operation of efficient epigenetic gene silencing in M. polymorpha, and guide future efforts in chassis engineering of this multicellular plant model. Furthermore, my results encourage utilization of spatiotemporally controlled bacteriophage T7 RNA polymerase as a targeted silencing system for functional genomic studies and morphogenetic engineering in the liverwort. Taken together, the work presented enhances our capacity for spatiotemporal gene expression control in bacterial populations and plants, facilitating future efforts in synthetic morphogenesis for applications in synthetic biology and metabolic engineering.