The aim of the present study was to find out whether adaption to chronic hypoxia affects the expresion of TNF-α and IL-10 in rat myocardium. TNF-α is a proinflammatory cytokine, which amplifies inflammatory reaction, while IL-10 has opposite antiinflammatory effect. We also measured concentration of nitrotyrosine as a marker of nitrosative stress. We used male Wistar rats divided into four groups: 1) normoxic controls; 2) exposed to continous normobaric hypoxia (10% O2) for three days or 3) for three weeks and 4) exposed to intermittent normobaric hypoxia (10% O2) for three weeks with one hour daily reoxygenation. Cytosolic and membrane proteins (cytosolic and particulate fractions) were obtained from the left ventricle, right ventricle and interventricular septum. Concentrations of TNF-α and IL-10 in both fractions were measured by ELISA. Continous hypoxia increased TNF-α production in particulate fractions from all ventricular parts and decreased the ratio of IL-10/TNF-α in particulate and cytosolic fractions. Intermittent hypoxia redistributed TNF-α from cytosol into the particulate fraction and prevented the drop of IL-10/TNF-α ratio in the cytosolic fraction. The highest concentration of nitrotyrosine was found in the particulate fraction from the right ventricle after three days of hypoxia....

The cardiovascular disease, particularly acute myocardial infarction, is the most common cause of death worldwide. It is well documented that adaptation to chronic hypoxia increases resistance to ischemia-reperfusion (I/R) injury in heart tissue. Reactive oxygen species (ROS) play an important signalling role by the activation of the protective pathways during I/R, although, the excess of ROS during reperfusion leads to cardiac tissue injury. As the cellular antioxidant system is responsible for the maintenance of redox homeostasis, the main aim of this thesis was to investigate the relationship between myocardial tolerance to I/R injury and regulation of main components of antioxidant systems, related transcription factors and their target genes in protective and non- protective regimens of chronic hypoxia. We found differences in cardioprotective phenotype in rats exposed to three regimens of chronic normobaric hypoxia (FiO2 0.1, 3 weeks). The adaptation to continual (CNH) and intermittent (CNH-8; 8 h/day) regimen of hypoxia increased myocardial resistance to I/R damage, whereas 1-hour daily interruption of hypoxic adaptation (INH-23) abolished cardioprotective effect and decreased the ratio of reduced and oxidized glutathione (GSH/GSSG). Both cardioprotective regimens significantly increased...

Der Hirninfarkt ist einer der drei häufigsten Todesursachen in Deutschland. Er wird durch eine Unterversorgung des Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen, häufig infolge von Gefäßverschlüssen, ausgelöst. Die bisher einzige Therapiemöglichkeit ist die Thrombolyse. Deshalb sind neue Therapieansätze nötig. Voraussetzung dafür sind geeignete Modelle. In dieser Arbeit wurden zellbasierte Hypoxiemodelle etabliert und charakterisiert. Es wurde der Einfluss von Sauerstoff- und/oder Glucoseentzug an humanen primären Makrophagen untersucht. Für Screeninguntersuchungen wurden neuronale und periphere (Makrophagen) Zelllinien von Ratte und Mensch verwendet. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Modelle genutzt, um die Wirkung von Adenin, eine rezeptorvermittelte Therapieoption, und des Phytopharmakons STW5 auf mögliche protektive Wirkungen zu untersuchen. Es wurden zellbiologische (MTT-Test, LDH-Test, DAPI-Färbung), immunologische (TNF α- ELISA, immunhistochemische Färbung), elektrophysiologische (Patch Clamp-Technik) und molekularbiologische (RT-PCR, Real-Time-PCR) Methoden angewendet. Es wurde erstmals der Adeninrezeptor an den untersuchten Zelllinien nachgewiesen und der pharmakologische Hinweis für eine bisher unbekannte humane Variante des Rezeptors erbracht. An neuronalen Zellen kam es zu einer Rezeptorinteraktion zwischen Adenin- und Adenosin-A1-Rezeptor. Antagonisten am Adeninrezeptor scheinen zur Behandlung hypoxiebedingter Zellschäden geeignet zu sein. STW5 hemmte unter hypoxischen Bedingungen die TNF α-Freisetzung humaner primärer Makrophagen. Der antiinflammatorischen Wirkung liegt die Blockierung erhöhter Kaliumströme zugrunde. An den untersuchten Zelllinien wirkte STW5 der hypoxieinduzierten Zellschädigung entgegen.

Zielsetzung der vorgestellten Arbeit war die Etablierung und Validierung einer Zellkultur isolierter equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen für morphologische und funk-tionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen. Ein solches In-vitro-System könnte insbesondere für Studien zur der Pathogenese der Endometrose zum Einsatz kommen. Zu diesem Zweck wurden Endometriumbioptate und Uteri von gynäkologisch unauffälli-gen Stuten entnommen. Die Isolierung der Zellen erfolgte nach mechanischer Zerklei-nerung des Gewebes mittels enzymatischer Verdauung durch Kollagenase. Für die Se-paration und Aufreinigung der Epithel- und Stromazellen kam, nach unbefriedigenden Ergebnissen bezüglich Zellausbeute und –reinheit bei Verwendung der Verfahren allein, eine Kombination aus Filtration, diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz zum Einsatz. So konnten Kreuzkontaminationen der beiden Zell-fraktionen von ≤ 2 % erreicht werden. Die Kultivierung der so gewonnenen Zellen er-folgte bei 37 °C, in Raumluft mit 5 % CO2 in wasserdampfgesättigter Atmosphäre in RPMI 1640 als Medium mit 10 % fötalem Kälberserum. Der Proliferationsvergleich auf unterschiedlichen Oberflächenbeschichtungen (Kunst-stoff, Kollagen, Matrigel®) zeigte einen Wachstumsvorteil der Epithelzellen auf dem ECM-Substrat Matrigel®. Im Gegensatz zu den stromalen Zellen, deren Wachstum auf dieser gegenüber den anderen Beschichtungen verlangsamt war. Die Stromazellen konnten über 1 Jahr bis zur Passage 19 in Kultur gehalten werden bevor deutliche De-generationserscheinungen auftraten. Bei den epithelialen Zellen war die Subkultivierung nach Trypsinierung nicht erfolgreich. Eine morphologische und funktionelle Charakterisierung der kultivierten Zellen fand mit-tels Lichtmikroskopie mit verschiedenen Färbungen, Immunhistologie sowie Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie statt. Für diesen Zweck erfolgte die Kultivierung der Zellen auf chamber slides und in Matrigel®-beschichteten Membraneinsätzen als Mono- und Kokultur. Die Epithelzellen stellten sich auf unbeschichteten Kunststoffoberflächen als flache, po-lygonale Zellen dar. Bei Bereitstellung von Matrigel® bildeten sie Organoide aus polari-sierten Zellverbänden mit Mikrovilli und Protrusionen an der Oberfläche aus. Als Zellver-bindungen traten Interdigitationen, tight junctions und Desmosomen auf. Im Zytoplas-ma waren neben rauem endoplasmatischen Retikulum, Golgi-Apparat und Mitochond-rien auch Sekretvakuolen zu finden. Immunhistologisch reagierten die Epithelien auch in vitro Zytokeratin-positiv. Dieses Charakteristikum diente als Unterscheidungsmerkmal von den Stromazellen, da nach einer Woche Kulturzeit auch der Vimentinnachweis bei den epithelialen Zellen positiv ausfiel. Progesteron- und Östrogenrezeptoren waren mit-tels Immunhistologie bei beiden kultivierten Zelltypen nicht nachweisbar. Die spindeligen bis sternförmigen Stromazellen wiesen keine Oberflächenmodifikationen auf. Intrazytoplasmatisch waren Mitochondrien, raues endoplasmatische Retikulum und ein Golgi-Apparat nachweisbar. Die stromalen Zellen waren immunhistologisch durch einen Vimentinnachweis gekennzeichnet. Zusätzlich konnte nach wenigen Tagen in der Kultur -Aktin und teils auch Desmin nachgewiesen werden. Diese Differenzierung zu Myofibroblasten trat unter hypoxischen Kulturbedingungen (1 % O2) verstärkt auf. Die morphologische und immunhistologische Charakterisierung zeigte, dass die Diffe-renzierung sowohl der epithelialen als auch der stromalen Zellen unter den eingesetzten Kulturbedingungen der von Endometrose betroffenen Zellen oder den Zellen in inakti-ven Endometrien während des Winteranöstrus in situ ähnelt. Die etablierte Zellkultur equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen aus Biopsiema-terial bildet die Grundlage für morphologische und funktionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen zur Erforschung der Pathogenese der En-dometrose. Aus praktischer und ethischer (tierschutzrechtlicher) Sicht bietet sie eine hervorragende Möglichkeit experimenteller Untersuchungen an endometrialen Zellen der Stute.

Articular cartilage damage caused by sports accidents, trauma or gradual wear and tear can lead to degeneration and the development of osteoarthritis because cartilage tissue has only limited capacity for intrinsic healing. Osteoarthritis causes reduction of mobility and chronic pain and is one of the leading causes of disability in the elderly population. Current clinical treatment options can reduce pain and restore mobility for some time, but the formed repair tissue has mostly inferior functionality compared to healthy articular cartilage and does not last long-term. Articular cartilage tissue engineering is a promising approach for the improvement of the quality of cartilage repair tissue and regeneration. In this thesis, a promising new cell type for articular cartilage tissue engineering, the so-called articular cartilage progenitor cell (ACPC), was investigated for the first time in the two different hydrogels agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) in comparison to mesenchymal stromal cells (MSCs). In agarose, ACPCs´ and MSCs´ chondrogenic capacity was investigated under normoxic (21 % oxygen) and hypoxic (2 % oxygen) conditions in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer. In the newly developed hyaluronic acid (HA)-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G), chondrogenesis of ACPCs and MSCs was also evaluated in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs like in agarose hydrogel. Additionally, the contribution of the bioactive molecule hyaluronic acid to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated in 2D monolayer, 3D pellet and HA-SH hydrogel culture. It was shown that both ACPCs and MSCs could chondrogenically differentiate in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels. In agarose hydrogel, ACPCs produced a more articular cartilage-like tissue than MSCs that contained more glycosaminoglycan (GAG), less type I collagen and only little alkaline phosphatase (ALP) activity. Hypoxic conditions did not increase extracellular matrix (ECM) production of ACPCs and MSCs significantly but improved the quality of the neo-cartilage tissue produced by MSCs. The creation of zonal agarose constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer led to an ECM production in zonal hydrogels that lay in general in between the ECM production of non-zonal ACPC and MSC hydrogels. Even though zonal co-culture of ACPCs and MSCs did not increase ECM production, the two cell types influenced each other and, for example, modulated the staining intensities of type II and type I collagen in comparison to non-zonal constructs under normoxic and hypoxic conditions. In HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogel, MSCs produced more ECM than ACPCs, but the ECM was limited to the pericellular region for both cell types. Zonal HASH/P(AGE-co-G) hydrogels resulted in a native-like zonal distribution of ECM as MSCs in the lower zone produced more ECM than ACPCs in the upper zone. It appeared that chondrogenesis of ACPCs was supported by hydrogels without biological attachment sites such as agarose, and that chondrogenesis of MSCs benefited from hydrogels with biological cues like HA. As HA is an attractive material for cartilage tissue engineering, and the HA-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) appeared to be beneficial for MSC chondrogenic differentiation, the contribution of HA to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated. An upregulation of chondrogenic gene expression was found in 2D monolayer and 3D pellet culture of MSCs in response to HA supplementation, while gene expression of osteogenic and adipogenic transcription factors was not upregulated. MSCs, encapsulated in a HA-based hydrogel, showed upregulation of gene expression for chondrogenic, osteogenic and adipogenic differentiation markers as well as for stemness markers. In a 3D bioprinting process, using the HA-based hydrogel, gene expression levels of MSCs mostly did not change. Nevertheless, expression of three tested genes (COL2A1, SOX2, CD168) was downregulated in printed in comparison to cast constructs, underscoring the importance of closely monitoring cellular behaviour during and after the printing process. In summary, it was confirmed that ACPCs are a promising cell source for articular cartilage engineering with advantages over MSCs when they were cultured in a suitable hydrogel like agarose. The performance of the cells was strongly dependent on the hydrogel environment they were cultured in. The different chondrogenic performance of ACPCs and MSCs in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels highlighted the importance of choosing suitable hydrogels for the different cell types used in articular cartilage tissue engineering. Hydrogels with high polymer content, such as the investigated HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels, can limit ECM distribution to the pericellular area and should be developed further towards less polymer content, leading to more homogenous ECM distribution of the cultured cells. The influence of HA on chondrogenic gene expression and on the balance between differentiation and maintenance of stemness in MSCs was demonstrated. More studies should be performed in the future to further elucidate the signalling functions of HA and the effects of 3D bioprinting in HA-based hydrogels. Taken together, the results of this thesis expand the knowledge in the area of articular cartilage engineering with regard to the rational combination of cell types and hydrogel materials and open up new possible approaches to the regeneration of articular cartilage tissue. / Gelenkknorpeldefekte, die durch Sportverletzungen, Unfälle oder graduelle Abnutzung ent-stehen, können zu Degeneration des Gewebes und zur Entstehung von Arthrose führen, da Knorpelgewebe nur über eine eingeschränkte Fähigkeit zur Selbstheilung verfügt. Arthrose reduziert die Beweglichkeit und verursacht chronische Schmerzen. Sie ist vor allem bei älte-ren Menschen einer der häufigsten Gründe für körperliche Behinderung. Die zurzeit verfüg-baren operativen Behandlungsmöglichkeiten können die Symptome meist für einige Zeit lindern, aber das dabei gebildete Ersatzgewebe zeigt meistens nur eingeschränkte Funktiona-lität im Vergleich zu natürlichem gesunden Knorpelgewebe und bleibt nur für eine begrenzte Zeit stabil. Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Qualität des Ersatzgewebes und der Knorpelregeneration zu verbessern. Diese Arbeit untersuchte einen neuen vielversprechenden Zelltyp für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe, sogenannte Gelenkknorpel-Vorläuferzellen (ACPCs). Diese Zellen wurden erstmals in zwei verschiedenen Hydrogelen, Agarose und HA-SH/P(AGE-co-G), mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) verglichen. Die chondrogene Kapazität von ACPCs und MSCs in Agarose wurde unter normoxischen (21 % Sauerstoff) und hypoxischen (2 % Sauerstoff) Bedingungen in Monokultur und zonal geschichteter Kokultur untersucht. In den zonalen Kokulturen befanden sich ACPCs in einer oberen Schicht und MSCs in einer unte-ren Schicht. In dem neu entwickelten Hyaluronsäure (HA)-basierten Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) wurde die chondrogene Differenzierung von ACPCs und MSCs ebenfalls in Monokultur und in zonal geschichteter Kokultur, wie im Agarose-Hydrogel, analysiert. Außerdem wurde der Beitrag des biologisch aktiven Moleküls Hyaluronsäure zur chondro-genen Genexpression von MSCs in 2D-, 3D-Pellet- und HA-SH-Hydrogel-Kulturen unter-sucht. Diese Arbeit zeigte, dass sowohl ACPCs als auch MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen chondrogen differenzieren konnten. ACPCs produzierten im Agarose-Hydrogel ein Gewebe, das dem Gelenkknorpel ähnlicher war als das von MSCs produzierte Gewebe, da es mehr Glykosaminoglykane (GAG), weniger Typ I Kollagen und nur geringe Aktivität der Alkalinen Phosphatase (ALP) aufwies. Hypoxische Bedingungen konnten die Produktion von extrazellulärer Matrix (ECM) durch ACPCs und MSCs nicht erhöhen, aber sie verbesserten die Qualität des von MSCs produzierten Gewebes. Die Herstellung von zon-alen Agarose-Konstrukten mit ACPCs in der oberen Schicht und MSCs in der unteren Schicht führte zu einer ECM-Produktion in zonalen Hydrogelen, die im Allgemeinen zwi-schen der ECM-Produktion der ACPC-Monokultur und der MSC-Monokultur lag. Zonale Kokultur von ACPCs und MSCs führte zwar nicht zu einer erhöhten ECM-Produktion, al-lerdings beeinflussten die beiden Zelltypen sich gegenseitig und modulierten zum Beispiel die Intensitäten der Typ II und Typ I Kollagen Färbungen im Vergleich zu Monokulturen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Im HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel produzierten die MSCs mehr ECM als die ACPCs, allerdings war die Verteilung der gebilde-ten ECM bei beiden Zelltypen auf den perizellulären Bereich beschränkt. Zonale HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogele führten zu einer zonalen Verteilung von ECM, die der natürli-chen Struktur von Gelenkknorpel ähnlich war, da die MSCs in der unteren Schicht mehr ECM produzierten als die ACPCs in der oberen Schicht. Anscheinend wurde die chondroge-ne Differenzierung von ACPCs von Hydrogelen unterstützt, die, so wie Agarose, keine bio-logischen Bindestellen aufwiesen, und die Chondrogenese von MSCs profitierte von Hydro-gelen mit biologischen Signalen wie HA. Da HA ein attraktives Material für Tissue Engineering von Knorpel darstellt und das HA-basierte Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) anscheinend die chondrogene Differenzierung von MSCs begünstigte, wurde der Beitrag von HA zur chondrogenen Genexpression in MSCs untersucht. Eine Hochregulation der chondrogenen Genexpression ließ sich in 2D- und 3D-Pellet-Kulturen von MSCs als Reaktion auf HA beobachten, während die Genexpression von osteogenen oder adipogenen Transkriptionsfaktoren nicht hochreguliert wurde. Der Ein-schluss von MSCs in einem HA-basierten Hydrogel führte zu einer Erhöhung der Genex-pression von chondrogenen, osteogenen, adipogenen und Stemness-Markern. Ein 3D-Druck-Prozess mit dem HA-basierten Hydrogel veränderte die Genexpression von MSCs in den meisten Fällen nicht. Dennoch wurde die Expression von drei getesteten Genen (COL2A1, SOX2, CD168) in gedruckten im Vergleich zu gegossenen Konstrukten herunterreguliert. Dies unterstrich die Wichtigkeit einer genauen Kontrolle des Verhaltens der Zellen während und nach dem Druck-Prozess. Zusammenfassend ließen sich ACPCs als vielversprechender neuer Zelltyp für das Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe bestätigen. ACPCs haben Vorteile gegenüber MSCs, vor allem, wenn sie in einem passenden Hydrogel wie Agarose kultiviert werden. Die Leis-tung der Zellen war stark von den verschiedenen Hydrogelen und der Umgebung beeinflusst, die diese den Zellen darboten. Die unterschiedliche chondrogene Leistung von ACPCs und MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen zeigte deutlich die übergeordnete Relevanz der Auswahl von passenden Hydrogelen für die verschiedenen Zelltypen, die im Tissue Engineering von Gelenkknorpel Verwendung finden. Hydrogele mit einem hohen Polymergehalt, wie das eingesetzte HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel, können die Verteilung der gebildeten ECM auf den perizellulären Bereich beschränken und sollten weiterentwickelt werden, um einen niedrigeren Polymergehalt und damit eine homogenere ECM-Verteilung durch die kultivierten Zellen zu erreichen. Der Einfluss von HA auf die chondrogene Gen-expression und auf die Balance zwischen Differenzierung und Erhaltung der Stemness in MSCs ließ sich aufzeigen. In Zukunft sollten weitere Studien die Signalfunktionen von HA und den Einfluss des 3D-Drucks in HA-basierten Hydrogelen genauer zu untersuchen. Zusammengenommen erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit das Wissen im Bereich des Tissue Engineerings von Gelenkknorpelgewebe, vor allem in Bezug auf eine rationale Kom-bination von Zelltypen und Hydrogel-Materialien, und eröffnen neue Ansätze zur Knorpel-regeneration.

Vorangegangene Untersuchungen an Ratten zeigten unter normobarer Hypoxie eine linksventrikuläre systolische Dysfunktion und die Induktion eines Lungenödems. Weitere Analysen waren notwendig, um einerseits die Gründe der Depression des linken Ventrikels (LV) zu erforschen und zum anderen eine Beteiligung inflammatorischer Reaktionen an der Ödembildung in der Lunge nachzuweisen. Zentrale Fragestellungen waren dabei, inwiefern Hypoxie die myokardiale Energieversorgung beeinträchtigt bzw. Anzeichen für eine Inflammation in linkem oder rechtem Ventrikel zu erkennen sind. Im Lungengewebe sollte untersucht werden, ob es neben einer Inflammation zu einem Permeabilitätsödem infolge einer Zerstörung der alveolo-kapillären Barriere unter Hypoxie kommt. Besonderes Augenmerk lag auf der Erkennung frühzeitiger Schädigungsmechanismen unter akuter kurzzeitiger Hypoxieexposition. Adrenerge Mechanismen sind bei der Entstehung verschiedener Lungenödeme, wie das Neurogene Lungenödem (NPE) oder das Lungenödem beim Phäochromozytom, beteiligt. Auch im Tierexperiment verursacht Katecholaminstimulation ein sich sehr schnell entwickelndes Lungenödem unter Beteiligung sowohl α- als auch β-adrenerger Signalwege. Da Hypoxieexposition eine Sympathikusaktivierung hervorruft, stellte sich die Frage, ob Behandlungen mit adrenergen Agonisten oder Antagonisten vor allem die akuten pulmonalen Reaktionen auf Hypoxie abmildern können. Zusätzlich sollte durch die Verwendung unterschiedlicher Applikationsarten der Einfluss einer erhöhten Flüssigkeitszufuhr auf die kardialen und pulmonalen Schädigungen untersucht werden. Ratten wurden einer normobaren Hypoxie (10% O2) über 1,5 oder 6 h ausgesetzt und erhielten 0,9% NaCl oder adrenerge Blocker (Prazosin, Propranolol oder Prazosin und Propranolol) bzw. einen adrenergen Agonisten (Norepinephrin) entweder als Infusion (1 ml/h, erhöhte Flüssigkeitsbelastung) oder Injektion (0,5 ml, reduzierte Flüssigkeitsbelastung). Kontrolltiere verblieben in Normoxie und erhielten eine Infusion oder Injektion von 0,9% NaCl. Nach der Behandlungsdauer erfolgten die hämodynamischen Messungen und die Probenentnahmen von Herz- und Lungengeweben. Nach Gewebeextraktion erfolgte die RNA-Isolation für die mRNA-Anlaysen mittels Real-Time PCR (RT-PCR). Zur relativen Quantifizierung wurde das Housekeeping-Gen cyclic AMP phosphoprotein 19 (ARPP-19) verwendet. Bestimmungen der Gesamtproteinkonzentrationen erfolgten in Seren und bronchoalveolärerer Lavageflüssigkeit. Hämodynamisch induzierte akute Hypoxie eine systolische LV-Depression, vor allem unter Flüssigkeitsinfusion. Unter Injektion trat dieser Effekt deutlich schwächer auf. Die zusätzliche Gabe adrenerger Blocker aggravierte die LV-Funktionsbeeinträchtigung unter Hypoxie weiter, während adrenerge Stimulation sie nicht verhindern konnte. Die Funktion des rechten Ventrikels (RV) hingegen war unter Hypoxie unbeeinträchtigt. In der vorliegenden Arbeit wurden die mRNA-Expression der Hypoxiemarker aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 1 (ARNT1), hypoxia-inducible factor 1, α subunit (HIF1A), solute carrier family 2 facilitated glucose transporter member 1 (GLUT1), hypoxia-inducible gene domain family member 1A (HIGD1A) und vascular endothelial growth factor A (VEGF) sowie der Inflammationsmarker Interleukin 1α (IL-1α), IL-1ß, IL-6, tumor necrosis factor α-induced protein 1 (TNFAIP) und IL-10 in allen drei Geweben - Lunge, linkem und rechtem Ventrikel – untersucht. Die pulmonale mRNA-Expression inflammatorischer Marker (wie IL-6 oder TNFAIP) sollte Hinweise für die Beteiligung von Inflammationsprozessen am hypoxischen Lungenödem liefern. Mechanismen der Zelladaptation der Kardiomyozyten an Hypoxie sollten anhand der mRNA-Expressionsänderungen von Hypoxiemarkern (wie GLUT1 oder HIGD1A) abgeleitet werden, um mögliche Ursachen der linksventrikulären Funktionsverschlechterung und Aufschluss über die Energieversorgung des Myokards zu erhalten. Proteinkonzentrationen im Serum und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit sollten Aufschluss über eine gestörte kapilläre Permeabilität in der Lunge liefern. Aus den Ergebnissen der HIF-abhängigen Marker ARNT1, GLUT1, HIGD1A und VEGF ließen sich frühzeitig keine eindeutigen Hinweise auf einen beeinträchtigen Energiemetabolismus oder eine gestörte mitochondriale Funktion im Myokard unter akuter Hypoxie ableiten. Beispielsweise kann die Herabregulation der GLUT1-Expression unter kurzzeitiger Hypoxie und stärkerer Flüssigkeitsbelastung mit einem schlechten metabolischen Zustand im Myokard in Verbindung gebracht werden. Somit können kausale Zusammenhänge zur hypoxischen LV-Depression vermutet, aber nicht sicher bestätigt werden. Da sich unter kurzzeitiger Hypoxieexposition aus den untersuchten Markern keine eindeutigen Veränderungen des Stoffwechsels oder Energiemetabolismus in den Zellen ableiten ließen, sollten künftige Untersuchungen der myokardialen und pulmonalen Funktion in Hypoxie unter prolongierter Hypoxieexposition und auf der Basis von Proteinanalysen durchgeführt werden. In der Lunge erzeugt alveoläre Hypoxie einen inflammatorischen Phänotyp, wie er auch bei Bergsteigern nach raschem Aufstieg in große Höhen beobachtet werden konnte. Zwar wird das Höhenlungenödem (HAPE) ähnlich wie das hypoxische Lungenödem in dieser Tierstudie vorrangig durch hämodynamische Veränderungen verursacht, aber von inflammatorischen Prozessen begleitet, aufrechterhalten oder gar verschlimmert. Im Gegensatz zum Myokard zeigten frühzeitige Anstiege der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und TNFAIP pulmonale Inflammationsprozesse in der Lunge an, die mutmaßlich an der Aufrechterhaltung der hypoxischen Lungenschädigung schon nach 6 h beteiligt sind. Der Inflammationsprozess beinhaltet dabei Norepinephrin-abhängige Mechanismen, über eine Aktivierung der IL-6 Expression, und Mechanismen, die unabhängig von sympathischer Aktivierung über TNF-α Signalwege vermittelt werden. Folglich schwächte adrenerge Blockade — anders als ursprünglich angenommen — das Ausmaß der hypoxischen Lungenschädigung nicht ab. Analysen der Proteinkonzentrationen in Seren und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit lieferten keine Anhaltspunkte für eine erhöhte pulmonale Kapillarpermeabilität und somit für die Ausbildung eines alveolären Ödems und bestätigte die Beobachtungen eines interstitiellen Ödems in der Lungenhistologie. Erhöhte Flüssigkeitsapplikation förderte zusätzlich zur LV-Depression die Entwicklung des Lungenödems. Die hypoxie-induzierte LV-Depression stellt neben der direkten Hypoxiewirkung einen zusätzlichen kausalen Faktor für die Entstehung des Lungenödems durch pulmonale Kongestion dar, welche durch Flüssigkeitsbelastung weiter verstärkt wird. Flüssigkeitsreduktion hatte dagegen protektive Effekte: Die hypoxie-induzierte LV-Depression trat nur bei Infusion auf, dagegen blieb die inotrope LV-Funktion bei geringerer Flüssigkeitsbelastung erhalten. Auch die hypoxische Lungenschädigung (sowohl Lungenödem als auch Inflammation) wurde durch reduzierte Flüssigkeitsbelastung abgeschwächt. Aus den Ergebnissen dieser Untersuchung kann daher geschlussfolgert werden, dass die hypoxie-induzierte Sympathikusaktivierung einen eher geringen Beitrag zur hypoxischen Lungenschädigung leistet. Dagegen kommt einem angemessenen Flüssigkeitsmanagement eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der kardiopulmonalen Funktion unter Hypoxie zu.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Hypoxie 1 1.1.1 Definition Hypoxie 1 1.1.2 Hypobare und normobare Hypoxie 1 1.1.3 Erkennung von Hypoxämie 1 1.1.4 Anpassung an Hypoxie 2 1.1.4.1 Akute Reaktion des Körpers auf Hypoxie 2 1.1.4.2 Akklimatisierung 3 1.1.4.3 Höhenkrankheiten 4 1.1.4.3.1 Akute Höhenkrankheit und Höhenhirnödem 4 1.1.4.3.2 Höhenlungenödem 5 1.1.4.4 Hypoxiewirkungen auf das Herz 6 1.2 Katecholamin-induzierte Lungenödeme 7 1.2.1 Neurogenes Lungenödem (NPE) 7 1.2.2 Phäochromozytom 8 1.2.3 Medikamentös-induziertes Lungenödem 8 1.2.4 Experimentelles Lungenödem 9 1.3 Fragestellungen unseres Tiermodells 10 1.4 Untersuchte Marker 12 1.4.1 Hypoxiemarker 14 1.4.1.1 HIF1A und ARNT1 14 1.4.1.2 GLUT1 16 1.4.1.3 HIGD1A 17 1.4.1.4 VEGF 18 1.4.2 Inflammatorische Marker 19 1.4.2.1 Proinflammatorische Zytokine 19 1.4.2.1.1 IL-1α und IL-1β 19 1.4.2.1.2 IL-6 19 1.4.2.1.3 TNFAIP 20 1.4.2.2 Antiinflammatorisches Zytokin IL-10 20 1.4.3 Gesamtproteinkonzentrationen in Seren und BALF 20 1.5 Eigene Fragestellungen 21 2 Material und Methoden 23 2.1 Material 23 2.1.1 Chemikalien 23 2.1.2 Pharmaka 23 2.1.3 Geräte 24 2.1.4 Software 24 2.1.5 Sonstiges 24 2.2 Methoden 25 2.2.1 Tierversuche 25 2.2.1.1 Versuchstiere 25 2.2.1.2 Behandlung 26 2.2.1.3 Hämodynamische Messungen 27 2.2.1.4 Probengewinnung 28 2.2.2 RNA-Isolation 28 2.2.3 Reverse Transkription 29 2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion 29 2.2.5 DNA-Agarose-Gel 32 2.2.6 Proteinbestimmung 33 2.2.7 Statistische Analyse 34 3 Ergebnisse 35 3.1 Veränderungen im Herzen 35 3.1.1 Marker für Hypoxie, Zellstoffwechsel und Angiogenese im LV und RV 35 3.1.2 Pro- und antiinflammatorische Marker im LV und RV 41 3.2 Veränderungen in der Lunge 45 3.2.1 Marker für Hypoxie, Zellstoffwechsel und Angiogenese in der Lunge 45 3.2.2 Pro- und antiinflammatorische Marker in der Lunge 49 3.3 Proteinkonzentrationen im Serum und in der BALF 52 4 Diskussion 53 4.1 Kardiovaskuläre Funktion unter Hypoxie 53 4.1.1 Hämodynamische Veränderungen in unserem Tiermodell 53 4.1.2 HIF-abhängige Marker für zellulären Energiemetabolismus und Angiogenese 54 4.1.2.1 Adaptationen der LV Myozyten an Hypoxie 54 4.1.2.2 Adaptationen der RV Myozyten an Hypoxie 59 4.1.3 Inflammatorische Zytokine 60 4.2 Pulmonale Effekte von Hypoxie, Flüssigkeitsbelastung und adrenerger Behandlung 61 4.2.1 Hypoxie-spezifische Gene in der Lunge 61 4.2.2 Beteiligung inflammatorischer Prozesse am hypoxischen Lungenödem 62 4.2.3 Pulmonale Kapillarpermeabilität 64 4.3 Limitationen 65 4.4 Schlussfolgerungen 66

Prospektive interventionelle Längsschnittstudie zur Untersuchung des Einflusses eines vierwöchigen Intervall-Hypoxie-Hyperoxie- Trainings (IHHT) auf die aerobe Leistungsfähigkeit und Blutparameter von Leistungssportlern unter leistungsphysiologischem Schwerpunkt

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’eutrophisation en milieux côtiers et estuariens est souvent reliée à une augmentation des apports en nutriments aux systèmes stimulant leur productivité et représente, à ce jour, l’un des plus gros enjeux associés aux impacts de la pollution par les activités anthropiques. Le Saint-Laurent, considéré comme l’un des plus grands systèmes hydrographiques au monde, fait désormais l’objet d’études cherchant à mieux comprendre les causes du développement d’une zone hypoxique (i.e. zone déficitaire en oxygène dissous) en eau profonde au niveau de son estuaire. Deux grandes causes principales pourraient expliquer cette diminution d’oxygène : une variation au niveau des températures et des teneurs en oxygène des courants de l’Atlantique ainsi qu’une augmentation de la demande en oxygène expliquée par la décomposition de la matière organique. Dans ce contexte, l’objectif principal de ce projet est de caractériser la répartition spatiale et saisonnière des éléments nutritifs de l’estuaire moyen et maritime, entre la ville de Québec et Pointe-des-Monts. Les données recueillies sont issues d’expéditions en mer menées au cours des quatre saisons entre l’automne 2017 et l’été 2019. Des incubations avec enrichissement de nitrate, d’ammonium ou d’urée marqué au ¹⁵N ont également été effectuées à différents points de l’estuaire afin de quantifier et de caractériser la prise d’azote par le phytoplancton. Les résultats indiquent la présence de gradients spatiaux dans les concentrations de nutriments associés à la zone de transition entre la portion d’eau douce et d’eau salée de l’estuaire. Les secteurs de Québec et de l’estuaire moyen présentent une variation saisonnière importante largement associée aux apports provenant de la portion fluviale du fleuve. Les données printanières suggèrent également que les concentrations de surface en nitrate de l’estuaire maritime sont influencées par la propagation des concentrations élevées observées en amont. Les ratios azote:phosphore (N:P) inorganiques dissous indiquent que la région de Québec est passée d’une limitation en phosphore à une limitation en azote depuis les années 1970. Les taux maximaux de prise d’azote par le phytoplancton ont été mesurés dans le secteur de Québec et de l’estuaire moyen au cours des quatre saisons. La contribution relative des différentes formes d’azote indique que le nitrate et l’ammonium sont préférés à l’urée quelle que soit la position dans l’estuaire. Ces travaux, qui pourront désormais servir de référence, permettent une meilleure compréhension de la dynamique des nutriments dans l’estuaire du Saint-Laurent. / Eutrophication in coastal and estuarine environments is often linked to an increase in nutrient inputs to ecosystems, stimulating their productivity and, to date, represents one of the biggest issues associated with the impacts of pollution from anthropogenic activities. The St. Lawrence System is considered one of the largest hydrographic systems in the world and is now the subject of studies that are looking into the causes of the development of a hypoxic zone (i.e. a zone lacking in dissolved oxygen) in the deep waters of its estuary. Two main causes have been identified to explain this decrease in dissolved oxygen: a variation in water temperature and oxygen levels in the Atlantic currents, and an increase in oxygen demand due to the decomposition of organic matter. In this context, the main objective of this project is to characterize the spatial and seasonal distribution of nutrients in the Upper and Lower Estuaries, between Quebec City and Pointe-des-Monts. The data has been collected on expeditions conducted in all four seasons between fall 2017 and summer 2019. Incubations with enrichment of ¹⁵N-labelled nitrate, ammonium or urea were also carried out at various stations in the estuary to quantify and characterize nitrogen uptake by phytoplankton. The results indicate the presence of spatial gradients in nutrients concentrations associated with the transition zone between the freshwater and marine portions of the estuary. The Quebec City and Upper Estuary sectors show significant seasonal variation largely associated with inputs from the upstream river. The spring data also suggest that surface nitrate concentrations in the Lower Estuary are influenced by the spread of high concentrations observed upstream. Dissolved in organic nitrogen:phosphorus ratios indicate that the Quebec City area has undergone a transition from phosphorus to nitrogen limitation since the 1970s. Maximum nitrogen uptake rates by phytoplankton were measured in the Quebec City area and the Upper Estuary in all four seasons. The relative contribution of the different forms of nitrogen indicates that nitrate and ammonium are preferred to urea regardless of position in the estuary. This work, which can now be used as a reference, provides a better understanding of the dynamics of nutrients in the St Lawrence Estuary.