O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e o mais grave tumor de células da glia. O GBM é um tumor astrocítico de grau IV caracterizado pela proliferação descontrolada, infiltrado difuso, tendência à necrose, angiogênese, resistência a apoptose e grande heterogeneidade genética. Apesar da terapia abranger a remoção cirúrgica máxima, a radioterapia e a quimioterapia, o tumor torna-se resistente à drogas utilizadas no tratamento levando o paciente a recorrência e morte em menos de 15 meses após o diagnóstico. Uma alternativa para o tratamento do GBM é a imunoterapia, a qual é capaz de estimular o sistema imunológico do próprio paciente a gerar uma resposta específica e duradoura que pode proteger contra a recorrência da doença. Uma dessas alternativas envolve o uso de vacinas de DNA codificando antígenos tumorais e proteínas imunomoduladoras capazes de ativar eficientemente linfócitos B e T específicos aos antígenos presentes no tumor. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi construir vacinas de DNA utilizando-se os genes dos antígenos EGFRvIII, cERBB2, MAGE e GLEA de GBM e os genes das proteínas imunomoduladoras hsp65, hsp70, gp96 e gD e avaliar suas respectivas imunogenicidades. Os genes foram avaliados in silico, sintetizados in vitro e utilizados na construção das vacinas de DNA. Ferramentas de biologia molecular e o vetor pVAX foram utilizados para obtenção das vacinas. Elas foram caracterizadas por sequenciamento e western blot e utilizadas na imunização de camundongos C57BL/6. As imunizações foram realizadas com três doses em intervalos de 12 dias combinando um antígeno tumoral e uma proteína imunomoduladora na forma de vacina de DNA. A imunogenicidade foi avaliada 20 dias após a última dose. Os ensaios ex vivo foram realizados com o soro dos animais imunizados para dosagem de anticorpos específicos contra os antígenos tumorais e com as células do baço que foram re-estimuladas com as proteínas EGFRvIII, cERBB2, MAGE e GLEA para identificar a presença de células específicas aos antígenos tumorais. Como resultado, a vacina pVAXgDGLEA foi a única capaz de induzir anticorpos do subtipo IgG2a anti-GLEA. As vacinas pVAXgDGLEA, pVAXgDEGFRvIII e pVAXgDMAGE foram capazes de ativar células específicas aos antígenos que após o re-estímulo responderam rapidamente com produção de IFN-g e IL-10. A proteína imunomoduladora gD foi, portanto, capaz de ajudar na indução de um padrão de resposta Th1, específica aos antígenos de GBM, importante no combate ao tumor e a IL-10 pode favorecer e/ou balancear a resposta no cérebro que deve ser eficaz, mas não exacerbada. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common form of primary brain cancer and the most severe tumour affecting glia cells. GBM is a grade IV astrocytoma known by uncontrolled proliferation, diffused infiltrate, necrosis tendency, angiogenesis, apoptosis resistance and a wide genetic heterogeneity. The standard of care consists of maximal surgical resection, followed by a combination of radiation and chemotherapy. Despite that, tumour becomes resistant to drugs used to treatment, and the patient experiences recurrence followed by death in less than 15 months after diagnosis. An alternative in GBM treatment could be immunotherapy which aims to stimulate patients immunological system in order to obtain a specific and long-term response that can protect against recurrence. One of these alternatives involves the use of DNA vaccines codifying tumoral antigens and immunomodulatory proteins that can effectively activate tumour antigen specific B and T lymphocytes. In this context, the objective of this work was the construction of DNA vaccines using GBM antigen genes (EGFRvIII, cERBB2, MAGE e GLEA) and immunomodulatory proteins (hsp65, hsp70, gp96 e gD), followed by their immunogenicity evaluation. Genes were evaluated in silico, synthesized in vitro and used in DNA vaccines construction. Molecular biology tools and the pVAX vector were used to obtain the vaccine. They were characterized by sequencing, western blot and were used in the immunization of C57BL/6 mice. Immunizations were performed in 3 doses of a DNA vaccine combining a tumoral antigen and an immunomodulatory protein at each 12 days. Immunogenicity was evaluated 20 days after the last dose. The ex vivo assays were performed with the serum of immunized animals for antibody evaluation and spleen cells were stimulated with EGFRvIII, cERBB2, MAGE e GLEA proteins to assess tumoral antigen specific cells. The pVAXgDGLEA vaccine was the only able to induce IgG2a subtype anti-GLEA antibodies. Vaccines pVAXgDGLEA, pVAXgDEGFRvIII e pVAXgDMAGE were able to activate antigen-specific cells that produced IFN-g e IL-10 quickly after reestimulation. The gD immunomodulatory protein was able to induce a Th1 immune response, specific to GBM antigens, which is important in tumor combat while IL-10 could favor and/or balance the response in brain, which should be effective but not exacerbated.

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e o mais grave tumor de células da glia. O GBM é um tumor astrocítico de grau IV caracterizado pela proliferação descontrolada, infiltrado difuso, tendência à necrose, angiogênese, resistência a apoptose e grande heterogeneidade genética. Apesar da terapia abranger a remoção cirúrgica máxima, a radioterapia e a quimioterapia, o tumor torna-se resistente à drogas utilizadas no tratamento levando o paciente a recorrência e morte em menos de 15 meses após o diagnóstico. Uma alternativa para o tratamento do GBM é a imunoterapia, a qual é capaz de estimular o sistema imunológico do próprio paciente a gerar uma resposta específica e duradoura que pode proteger contra a recorrência da doença. Uma dessas alternativas envolve o uso de vacinas de DNA codificando antígenos tumorais e proteínas imunomoduladoras capazes de ativar eficientemente linfócitos B e T específicos aos antígenos presentes no tumor. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi construir vacinas de DNA utilizando-se os genes dos antígenos EGFRvIII, cERBB2, MAGE e GLEA de GBM e os genes das proteínas imunomoduladoras hsp65, hsp70, gp96 e gD e avaliar suas respectivas imunogenicidades. Os genes foram avaliados in silico, sintetizados in vitro e utilizados na construção das vacinas de DNA. Ferramentas de biologia molecular e o vetor pVAX foram utilizados para obtenção das vacinas. Elas foram caracterizadas por sequenciamento e western blot e utilizadas na imunização de camundongos C57BL/6. As imunizações foram realizadas com três doses em intervalos de 12 dias combinando um antígeno tumoral e uma proteína imunomoduladora na forma de vacina de DNA. A imunogenicidade foi avaliada 20 dias após a última dose. Os ensaios ex vivo foram realizados com o soro dos animais imunizados para dosagem de anticorpos específicos contra os antígenos tumorais e com as células do baço que foram re-estimuladas com as proteínas EGFRvIII, cERBB2, MAGE e GLEA para identificar a presença de células específicas aos antígenos tumorais. Como resultado, a vacina pVAXgDGLEA foi a única capaz de induzir anticorpos do subtipo IgG2a anti-GLEA. As vacinas pVAXgDGLEA, pVAXgDEGFRvIII e pVAXgDMAGE foram capazes de ativar células específicas aos antígenos que após o re-estímulo responderam rapidamente com produção de IFN-g e IL-10. A proteína imunomoduladora gD foi, portanto, capaz de ajudar na indução de um padrão de resposta Th1, específica aos antígenos de GBM, importante no combate ao tumor e a IL-10 pode favorecer e/ou balancear a resposta no cérebro que deve ser eficaz, mas não exacerbada. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common form of primary brain cancer and the most severe tumour affecting glia cells. GBM is a grade IV astrocytoma known by uncontrolled proliferation, diffused infiltrate, necrosis tendency, angiogenesis, apoptosis resistance and a wide genetic heterogeneity. The standard of care consists of maximal surgical resection, followed by a combination of radiation and chemotherapy. Despite that, tumour becomes resistant to drugs used to treatment, and the patient experiences recurrence followed by death in less than 15 months after diagnosis. An alternative in GBM treatment could be immunotherapy which aims to stimulate patients immunological system in order to obtain a specific and long-term response that can protect against recurrence. One of these alternatives involves the use of DNA vaccines codifying tumoral antigens and immunomodulatory proteins that can effectively activate tumour antigen specific B and T lymphocytes. In this context, the objective of this work was the construction of DNA vaccines using GBM antigen genes (EGFRvIII, cERBB2, MAGE e GLEA) and immunomodulatory proteins (hsp65, hsp70, gp96 e gD), followed by their immunogenicity evaluation. Genes were evaluated in silico, synthesized in vitro and used in DNA vaccines construction. Molecular biology tools and the pVAX vector were used to obtain the vaccine. They were characterized by sequencing, western blot and were used in the immunization of C57BL/6 mice. Immunizations were performed in 3 doses of a DNA vaccine combining a tumoral antigen and an immunomodulatory protein at each 12 days. Immunogenicity was evaluated 20 days after the last dose. The ex vivo assays were performed with the serum of immunized animals for antibody evaluation and spleen cells were stimulated with EGFRvIII, cERBB2, MAGE e GLEA proteins to assess tumoral antigen specific cells. The pVAXgDGLEA vaccine was the only able to induce IgG2a subtype anti-GLEA antibodies. Vaccines pVAXgDGLEA, pVAXgDEGFRvIII e pVAXgDMAGE were able to activate antigen-specific cells that produced IFN-g e IL-10 quickly after reestimulation. The gD immunomodulatory protein was able to induce a Th1 immune response, specific to GBM antigens, which is important in tumor combat while IL-10 could favor and/or balance the response in brain, which should be effective but not exacerbated.

O sistema NADPH oxidase é um complexo enzimático gerador de superóxido. O NF-kB é um fator de transcrição envolvido no controle da expressão de diversos genes ligados à resposta inflamatória. Defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g resultam em infecções recorrentes e à susceptibilidade mendeliana a micobacterioses, podendo diminuir a expressão do componente gp91-phox da NADPH oxidase. Estudamos qual é a relação direta do NF-kB e de defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g na regulação dos genes CYBA, NCF1, NCF2 e NCF4 do sistema NADPH oxidase humano em células U937, células B EBV transformadas provenientes de pacientes com EDA-ID, DGC, ou de pacientes com defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g. A expressão dos genes NCF1 e NCF2 foi diminuída em células com defeitos no eixo (IFNGR1 e INFGR2) e em células U937 IkB S32A/S36A. A expressão do gene NCF1 também foi diminuída em células EDA-ID S32I e em células EDA-ID NEMO/IKKg W420X. O NF-kB e os IFNGR1 e INFGR2 são necessários para a expressão dos genes NCF1 e NCF2 e para a ativação do sistema NADPH oxidase humano neste sistema modelo. / The NADPH oxidase system is an enzymatic complex that generates superoxide. The NF-kB is a transcriptional factor involved in the expression of several genes related to the inflammatory response. The IL-12/23-IFN-g axis defects lead to recurrent infections and to the mendelian susceptibility of mycobacterial disease (MSMD), and they can decrease the gp91-phox expression (a NADPH oxidase component). We studied the NF-kB and the IL-12/23-IFN-g axis defects consequences on the regulation of CYBA, NCF1, NCF2 and NCF4 genes of the human NADPH oxidase system in U937 cells, and in B EBV cells from patients with EDA-ID, DGC, or patients with IL-12/23-IFN-g axis defects. The NCF1 and NCF2 gene expression was decreased in IL-12/23-IFN-g axis defects cells (IFNGR1 and INFGR2) and in U937 IkB S32A/S36A cells. NCF1 gene expression was decreased in EDA-ID S32I and in EDA-ID NEMO/IKKg W420X cell lineages. The NF-kB and the IFNGR1 and INFGR2 are necessary for NCF1 and NCF2 gene expression and activation of the human NADPH oxidase in this model system.

O sistema NADPH oxidase é um complexo enzimático gerador de superóxido. O NF-kB é um fator de transcrição envolvido no controle da expressão de diversos genes ligados à resposta inflamatória. Defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g resultam em infecções recorrentes e à susceptibilidade mendeliana a micobacterioses, podendo diminuir a expressão do componente gp91-phox da NADPH oxidase. Estudamos qual é a relação direta do NF-kB e de defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g na regulação dos genes CYBA, NCF1, NCF2 e NCF4 do sistema NADPH oxidase humano em células U937, células B EBV transformadas provenientes de pacientes com EDA-ID, DGC, ou de pacientes com defeitos no eixo IL-12/23-IFN-g. A expressão dos genes NCF1 e NCF2 foi diminuída em células com defeitos no eixo (IFNGR1 e INFGR2) e em células U937 IkB S32A/S36A. A expressão do gene NCF1 também foi diminuída em células EDA-ID S32I e em células EDA-ID NEMO/IKKg W420X. O NF-kB e os IFNGR1 e INFGR2 são necessários para a expressão dos genes NCF1 e NCF2 e para a ativação do sistema NADPH oxidase humano neste sistema modelo. / The NADPH oxidase system is an enzymatic complex that generates superoxide. The NF-kB is a transcriptional factor involved in the expression of several genes related to the inflammatory response. The IL-12/23-IFN-g axis defects lead to recurrent infections and to the mendelian susceptibility of mycobacterial disease (MSMD), and they can decrease the gp91-phox expression (a NADPH oxidase component). We studied the NF-kB and the IL-12/23-IFN-g axis defects consequences on the regulation of CYBA, NCF1, NCF2 and NCF4 genes of the human NADPH oxidase system in U937 cells, and in B EBV cells from patients with EDA-ID, DGC, or patients with IL-12/23-IFN-g axis defects. The NCF1 and NCF2 gene expression was decreased in IL-12/23-IFN-g axis defects cells (IFNGR1 and INFGR2) and in U937 IkB S32A/S36A cells. NCF1 gene expression was decreased in EDA-ID S32I and in EDA-ID NEMO/IKKg W420X cell lineages. The NF-kB and the IFNGR1 and INFGR2 are necessary for NCF1 and NCF2 gene expression and activation of the human NADPH oxidase in this model system.

Background: Pembrolizumab and cetuximab are antibodies under investigation in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) either as single agents or combined with cisplatin and other chemotherapeutic drugs, e.g., 5-fluorouracil and/or docetaxel. However, also the combination of both antibodies may have potential in recurrent/ metastatic (R/M) HNSCC, in particular in cisplatin-resistant or -refractory cases or patients with comorbid disease, e.g. patients with impaired renal function. Methods: To clarify potential benefit that may result from such combination, we used the FLAVINO assay, a short-time ex vivo assay to compare responsiveness of HNSCC to pembrolizumab, cetuximab and both combined regarding colony formation of epithelial cells of biopsy-derived tumor samples and their cytokine production within three days either without or with stimulation with 10 ng/mL interferon gamma (IFN-g). Vascular endothelial growth factor A (VEGF), monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1 or CCL2), interleukin 6 (IL-6), IL-8, IFN-g, and interferon gamma-induced protein 10 (IP-10 or CXCL10) in supernatants were measured by ELISA. Results: We detected huge heterogeneity in response to cetuximab, pembrolizumab and both combined with and without IFN-g stimulation. Moreover, we detected a link between IFN-g induced IP-10 release and improved outcome in those HNSCC patients who were capable to respond to IFN-g and pembrolizumab, cetuximab and both combined with a further increase in IP-10 production. We derived an “IP-10 score” that independent from clinical characteristics of HNSCC patients and therapy regimens applied was able to predict their outcome. Conclusions: The heterogeneity in the ex vivo response of cetuximab, pembrolizumab and both combined with and without IFN-g stimulation identifies subgroups of HNSCC patients with deviating OS.