Recent population studies provide evidence that individuals with high circulating insulin levels have a poor prognosis and/or increased risk of cancer development; however, laboratory studies concerning the role of insulin in breast cancer biology are sparse. We compared the growth of 4T1 murine breast cancer allografts in control mice, alloxan-induced hypoinsulinemic mice, and mice treated with the insulin/insulin-like growth factor-1 receptor tyrosine kinase inhibitor BMS-536924. Both interventions significantly decreased tumor growth versus control and decreased pathway activation downstream of the insulin receptor as reflected by Aktser473 phosphorylation status in the neoplastic tissue. Alloxan-treated mice exhibited signs of insulin deficiency, while BMS-536924-treated animals showed only minor metabolic derangements. Skeletal muscle displayed reduced pAktser473 in alloxan-treated mice. In contrast, BMS-536924 treatment increased pAktser473 in muscle. This raises the possibility that the relative lack of metabolic toxicity of BMS-536924 involves varying tissue levels of the drug. These results support the view that host insulin physiology is a potentially modifiable determinant of breast cancer behaviour.

Introdução O sistema dos fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF) desempenha importante papel no crescimento e desenvolvimento celular normal. Hiperexpressão do gene IGF1R tem sido demonstrada em diversos tumores, sugerindo que a expressão deste receptor represente um pré-requisito fundamental para transformação celular. Nosso grupo de pesquisa demonstrou o aumento de expressão de IGF1R em tumores adrenocorticais pediátricos. Objetivos: Induzir o silenciamento do gene IGF1R por siRNA na linhagem de tumor adrenocortical humano NCI H295R, bem como avaliar os efeitos in vitro por meio da análise de proliferação celular e apoptose desta linhagem celular. Adicionalmente, avaliar a expressão de IGF-1R e de microRNAs relacionados a sua transcrição em tumores adrenocorticais humanos. Pacientes e métodos: A linhagem celular de carcinoma adrenocortical humano NCI H295R foi cultivada e submetida ao tratamento com 2 siRNAs específicos para IGF-1R. Todos os experimentos foram realizados em quatro grupos: (1) células não tratadas com siRNA, (2) células tratadas com siRNA # 1, (3) células tratadas com siRNA # 2 e (4) células tratadas com o siRNA controle negativo. A expressão gênica e proteica de IGF-1R foram determinadas por meio das técnicas de PCR em tempo real e Western Blot, respectivamente. Os efeitos do silenciamento de IGF-1R in vitro foram avaliados por ensaios de proliferação celular e análise de atividade de caspases. Além disso, 202 pacientes com tumor adrenocortical foram selecionados para o estudo de expressão proteica de IGF-1R por imunohistoquímica. Para avaliação de expressão de microRNAs relacionados à expressão de IGF-1R (miR-100, 375, 145 e 126) por PCR em tempo real foram selecionados 32 pacientes dos 202 disponíveis. Resultados: A expressão de IGF-1R foi significantemente diminuída nas células tratadas com siRNA # 1 e siRNA # 2. Os valores relativos de RNA mensageiro de IGF1R diminuíram aproximadamente 50% e as análises de Western Blot revelaram uma redução de 30% na proteína de IGF-1R. A diminuição de expressão foi acompanhada por uma redução de 40% na taxa de crescimento celular in vitro e um aumento de 45% das taxas de apoptose. A análise de expressão dos microRNAs 100, 375, 145 e 126 demostrou que a expressão de IGF-1R não se correlaciona com a expressão destes RNAs pequenos. Adicionalmente, a análise de expressão proteica de IGF-1R em tumores adrenocorticais humanos revelou que expressão forte (20%) de IGF-1R foi mais comum em carcinomas de adultos. Além disso, a imunolocalização do IGF-1R nos carcinomas (19%) foi mais frequentemente nuclear em relação aos adenomas de adultos. Conclusões: Os dados obtidos reforçam a importância de IGF-1R nas vias tumorigênicas das neoplasias malignas do córtex da glândula suprarrenal. A inibição deste receptor foi capaz de inibir o crescimento tumoral in vitro por meio da redução das taxas de proliferação celular e aumento da apoptose em linhagem celular de carcinoma adrenocortical humano. Além disso, a expressão proteica nuclear de IGF-1R foi mais comum entre os carcinomas, sugerindo representar um marcador biológico desta neoplasia / Introduction: The insulin-like growth factor (IGF) system plays a key role in normal cell growth and development. IGF1R overexpression has been demonstrated in several tumors suggesting that its expression is a prerequisite for cell transformation. We demonstrated IGF1R overexpression in pediatric adrenocortical tumors. Objectives: To induce IGF1R silencing by siRNA in a human adrenocortical cell line NCI H295R and evaluate its effects on cell proliferation and apoptosis. Additionally, evaluate the expression of IGF-1R protein and microRNAs related to its transcription in human adrenocortical tumors. Patients and methods: The human adrenocortical tumor cell line NCI H295R was cultured and treated with 2 specific IGF1R siRNA. All experiments were carried out in four groups: (1) untreated NCI H295R cells, (2) NCI H295R cells transfected with specific IGF1R siRNA # 1, (3) NCI H295R cells transfected with specific IGF1R siRNA # 2 and (4) NCI H295R cells transfected with a negative control. IGF-1R gene and protein expression was determined by the techniques of real-time PCR and Western blot, respectively. We assessed the effects of IGF-1R silencing on cell proliferation and apoptosis. Moreover, 202 patients with adrenocortical tumors were selected for the study of IGF-1R protein expression by immunohistochemistry. In the analysis of microRNAs that are related to IGF1R (miR-100, 375, 145 e 126) by real time PCR, 32 out 202 patients were selected. Results: IGF-1R levels were significantly decreased in cells that were treated with IGF-1R siRNA # 1 and siRNA # 2. The relative values of IGF1R mRNA decreased approximately 50% and Western blot analysis revealed a 30% of reduction in IGF-1R protein. Downregulation of this gene was accompanied by a reduction in 40% of cell growth in vitro and an increase in 45% of apoptosis. The analysis of microRNAs demonstrated that IGF1R expression is not correlated with the expression of these small RNAs. Additionally, the analysis of IGF-1R protein expression in human adrenocortical tumors revealed that strong expression (20%) of IGF-1R was more common in adult carcinomas. Moreover, the nuclear IGF-1R was more frequent in carcinomas diagnosed in adults (19%) when compared to adenomas. Conclusions: These data demonstrate the importance of IGF-1R in tumorigenic pathways of malignant neoplasms of the adrenocortical gland. IGF-1R silencing could inhibit tumor growth in vitro by reducing cell proliferation and increasing apoptosis in a cell line of human adrenocortical carcinoma. Furthermore, nuclear IGF-1R expression was more frequent in carcinomas diagnosed in adults, suggesting that IGF-1R may be a biological marker of this neoplasia

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Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas destes hormônios é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. As mutações inativadoras e deleções do gene do IGF1R em heterozigose vêm sendo relatadas de forma crescente nos últimos 9 anos em pacientes com história de déficit de crescimento pré e pós-natal. Postula-se que pelo menos 2 a 3% das crianças nascidas PIG poderiam apresentar defeitos no IGF1R. O quadro clínico destes pacientes apresenta grande variabilidade quanto à gravidade do retardo de crescimento pré- e pós-natal e aos parâmetros hormonais. Objetivo: Caracterizar in vitro a resistência ao IGF-1 de pacientes com defeitos no IGF1R, identificados em nosso ambulatório. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal. Destes pacientes, um paciente (SGA1) era portador de mutação missense em heterozigose no gene IGF1R (p.Arg511Trp) e os demais apresentavam baixa expressão dos IGF1R em leucócitos periféricos quando avaliados por PCR em tempo real. Um destes pacientes (SGA2) apresentava também a variante alélica p.Gly6Arg do IGF1R em heterozigose, alteração esta encontrada também em controles e familiares sem déficit de crescimento. As ações do IGF-1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da expressão do IGF-1R e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (via PI3K). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 proliferaram respectivamente 55%, 66%, 64% e 28% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, foi observada redução na expressão do IGF1R nas linhagens SGA2, SGA3 e SGA4 em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Por outro lado, a linhagem SGA1 mostrou expressão aumentada do IGF1R e no conteúdo da proteína em relação aos controles. Em relação á ativação da via PI3K, todas as linhagens dos pacientes apresentaram menor fosforilação de AKT após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles. Conclusão: Demonstramos a presença de insensibilidade parcial ao IGF-1 nas linhagens estudadas. A baixa expressão do IGF1R observada em leucócitos periféricos nas linhagens SGA2, SGA3 e SGA4 foi confirmada em fibroblastos tanto em nível de RNAm quanto da sua proteína. Nestas linhagens a insensibilidade ao IGF-1 é secundária a diminuição da expressão deste receptor. Em contraste a na linhagem com a mutação p.Arg511Trp (SGA1) observou-se expressão normal do IGF-1R na superfície celular. Pacientes com alterações no gene IGF1R não apresentam um fenótipo característico que os diferencie de outras crianças nascidas PIG sem alterações neste gene, mostrando a importância dos estudos moleculares neste grupo de pacientes / Small for gestational age (SGA) children are at a greater risk of having a short stature in adulthood. The type 1 and 2 insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factors determining fetal growth, and most of the known actions of these hormones are mediated via a receptor tyrosine kinase, IGF-1R. Inactivating mutations and deletions of the IGF1R gene in heterozygosis have been reported with increasing frequency in the last 9 years in patients with a history of a failure to thrive pre- and postnatally. It is postulated that at least 2-3% of the children born SGA could be defective for the IGF1R. The clinical presentation of these patients is highly variable with regard to the severity of growth retardation and pre- and post-natal hormonal parameters. Objectives: The goal of this study was to identify the in vitro insensitivity to IGF-1 in patients with defects in IGF1R. Methods: We developed fibroblast cultures from two controls (C1 and C2) and 4 patients born SGA (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4) with a suspected insensitivity to IGF-1 by the absence of catch-up growth during their postnatal life. Of these patients, one (SGA1) carried a heterozygous missense mutation in the IGF1R gene (p.Arg511Trp), and the others exhibited low expression levels of IGF1R in their peripheral leukocytes, as evaluated using real-time PCR. One of these patients (SGA2) was also heterozygous for the allelic variant p.Gly6Arg of IGF1R, an alteration also found in the controls and family members not displaying growth restriction. The actions of IGF-1 were determined using proliferation assays, an analysis of the expression of IGF- 1R and phosphorylation studies of proteins of the IGF-1 signaling pathway in fibroblasts (via PI3K).Results: The SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4 fibroblasts proliferated 55%, 66%, 64% and 28%, respectively, less under the stimulation of IGF-1 compared to the control lines. Using real-time PCR, the IGF1R mRNA expression showed reduced levels of IGF1R in the SGA2, SGA3 and SGA4 cells compared to the controls, and the total IGF-1R protein was also decreased in these cells. Moreover, the SGA1 cells showed increased expression levels of IGF1R mRNA and protein compared to the controls. In relation to the activation of PI3K, all of the cells showed decreased phosphorylation of AKT after the stimulation with IGF-1 compared to the control cells. Conclusion: We demonstrated the presence of a partial insensitivity to IGF-1 in the studied samples. The low expression of IGF1R observed in the peripheral leukocytes in the SGA2, SGA3 and SGA4 fibroblasts was confirmed at both the mRNA and protein levels, and the Andréa de Castro Leal Doutorado insensitivity of the cells to IGF-1 is secondary to the decreased expression of the receptor. In contrast, the cells with the mutation p.Arg511Trp (SGA1) displayed normal IGF-1R expression on the cell surface. The patients with alterations in the IGF1R gene do not exhibit a characteristic phenotype that differentiates them from other children born SGA and with no changes in this gene, thus showing the importance of molecular studies for this group of patients

Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulina-símile 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. Na vida pós-natal o GH, principal hormônio promotor de crescimento, exerce a maior parte de seus efeitos por meio do IGF-1. A grande maioria das ações conhecidas do IGF-1 e IGF-2 são mediadas via receptor tirosina quinase conhecido como receptor tipo 1 de IGFs (IGF-1R). Os objetivos deste trabalho foram estudar os genes IGF1 e IGF1R em crianças nascidas pequenas para a idade gestacional que não recuperaram o crescimento na vida pós-natal. Foram selecionados 145 pacientes nascidos PIG, 72 sem catch up e 73 com catch up. Em 54 PIG sem catch up foi estudado toda a seqüência codificadora do gene IGF1 por meio de PCR e seqüenciamento direto, nos demais PIG sem catch up e nos 73 PIG com catch up foi estudado apenas o exon 6 do IGF-1 por PCR e seqüenciamento direto para avaliação de um polimorfismo encontrado nesta região. Nos pacientes que apresentavam concentração sérica de IGF-1 e IGFBP-3 acima da média para idade e sexo e seqüência do IGF1 normal (n=23) foi realizada coleta de sangue periférico com posterior separação de leucócitos mononucleares pelo gradiente de ficoll seguido por extração de RNA pelo método de Trizol® Posteriormente, a partir do RNA, sintetizamos o cDNA (DNA complementar) utilizando primers randômicos. Foi realizado PCR e seqüenciamento direto do cDNA, além de análise da expressão do IGF1R por PCR em tempo real. Nenhuma mutação foi encontrada no gene IGF1. Entretanto um locus altamente polimórfico foi encontrada na região 3\' não traduzida do exon 6 deste gene, região esta envolvida no processo de poliadenilação. A freqüência das variantes alélicas foi semelhante em PIG com e sem catch-up e em controles nascidos AIG. Analisando o fenótipo de pacientes PIG que apresentavam a variante alélica wild type ou uma das três variantes alélicas mais freqüentemente encontradas, não observamos diferenças significativas entre peso e comprimento ao nascimento, níveis de IGF-1 e crescimento na vida pós-natal. No gene IGF1R encontramos duas variantes alélicas nunca descritas previamente. A primeira variante encontrada está localizada no exon 1, em uma região de peptídeo sinal do pro IGF-1R e consiste na troca do nucleotídeo guanina pelo nucleotídeo adenina na posição 16 da região codificadora (c.16G>A), levando a troca do aminoácido glicina por arginina na posição 6 da proteína (p.G6R). A outra mutação encontrada está localizada no exon 7 onde observamos uma troca do nucleotídeo citosina por timina na posição 1531 do cDNA (c.1531 C>T), levando a uma troca de arginina por triptofano na posição 511 do IGF1R (p.R511W). Adicionalmente, foi observada uma expressão do IGF1R diminuída em 5 pacientes estudados.Concluímos que as variantes alélicas encontradas na região de poliadenilação do IGF1 não influenciam significativamente as características ao nascimento e pós-natais de crianças nascidas PIG ou a altura adulta de indivíduos normais nascidos AIG. O estudo do IGF1R identificou duas novas variantes alélicas em heterozigose no gene IGF1R e, em cinco pacientes, observamos uma expressão reduzida deste gene. Pacientes com alterações no gene IGF1R não apresentam um fenótipo característico que os diferencie de outras crianças nascidas PIG sem alterações neste gene, mostrando a importância dos estudos moleculares. / Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of remaining short in adulthood. The insulin-like growth factors 1 and 2 (IGF-1 and IGF-2) are the main factors determining endocrine fetal growth. GH is the main promoter of linear growth in the postnatal life, exerting its effects mostly through the IGF-1. The vast majority of known actions of IGF-1 and IGF-2 are mediated by the insulin-like growth factor type 1 receptor (IGF-1R), a member of the tyrosine kinase receptors family. The aim of this study was to investigate IGF1 and IGF1R genes mutations in children born small for gestational age without catch up growth in postnatal life. We selected 145 patients born SGA, 72 without catch-up and 73 with catch up. The whole coding region of the IGF1 gene was sequenced in 54 patients without catchup. In the other SGA children without catch-up and in 73 SGA with catch-up, only the exon 6 of IGF1 was sequenced to assess the influence of allelic variants present in this region. In patients with normal IGF1 sequence and IGF-1 and IGFBP-3 serum levels above the mean for age and sex (n = 23) total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes followed by cDNA synthesis with random primers. The IGF1R cDNA was amplified using specific primers followed by direct sequencing. IGF1R expression was analyzed by real-time PCR. No mutations were found in the IGF1 gene. However a highly polymorphic sequence was identified in the upstream core polyadenylation signal (UCPAS) located in IGF1 3\' UTR at exon 6. The frequency of the identified allelic variants was similar in SGA children with and without catch-up and in controls. Furthermore, children homozygous for the wild-type allele and those carrying the allelic variants in homozygous or heterozygous state presented similar weight and length at birth, as well as serum IGF-1 levels and postnatal growth features. Two novel nonconservative allelic variants were identified in IGF1R in 23 SGA children (8.7%) in the heterozygous state. The first variant (c.16G>A) was located in the exon one, leading to a substitution of glicine by arginine in the pro-IGF-1R signaling peptide (p.G6R). The second variant was located in exon 7 (c.1531 C>T), leading to a substitution of arginine by tryptophan in the amino acid 511 of the IGF1-R (p.R511W). Moreover, a decreased IGF1R expression was observed in 5 of the 23 patients with elevated serum IGF-1 concentrations. We conclude that the UCPAS allelic variants did not significantly influence the birth and postnatal characteristics of children born SGA, neither the adult height of normal individuals born adequate for gestational age. The IGF1R study identified two novel allelic variants in two patients and a reduced expression of the IGF1R was observed in five patients. Patients with alterations in IGF1R did not have a distinctive phenotype when compared with other children born SGA without changes in this gene, indicating the importance of molecular studies.

Introdução: Uma elevada incidência de tumores adrenocorticais pediátricos e de adultos é observada nas regiões sul e sudeste do Brasil. Hiperexpressão dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4 tem sido descrita em tumores adrenocorticais. Apesar de hiperexpressão ser um evento comum em diversas neoplasias, ainda não são claros os mecanismos moleculares que seriam responsáveis por essa falha na regulação da expressão. Objetivos: Determinar o número de cópias dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4 em tumores adrenocorticais diagnosticados em crianças e adultos. Adicionalmente correlacionaremos os dados de expressão gênica e/ou protéica de IGF1R, SF1 e FGFR4 com o diagnóstico histológico e evolutivo dos tumores adrenocorticais. Pacientes e métodos: Sessenta e quatro pacientes com tumores adrenocorticais foram selecionados para o estudo. Todos os pacientes foram submetidos à avaliação clínica e tratamento cirúrgico. Oito glândulas adrenais normais obtidas em cirurgias renais ou autópsias foram utilizadas como controles. DNA genômico extraído dos tecidos normais e tumorais da glândula suprarrenal foram utilizados como substrato nas reações de multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) com o intuito de se determinar o número de cópias dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4. PCR em tempo real (SYBR Green) foi realizado para confirmar os dados de MLPA para os genes IGF1R e SF1. Resultados: Amplificação do gene IGF1R foi detectada por MLPA e confirmada por PCR em tempo real SYBR Green em apenas um carcinoma adrenocortical. Adicionalmente, amplificação gênica de outros loci (IGFBP3, FGFR4 e NSD1) bem como de sondas controles foi observada, sugerindo uma condição aneuplóide neste tumor maligno. Amplificação de SF1 foi detectada em 10 tumores adrenocorticais (8 pediátricos e 2 de adultos). Os valores de expressão gênica foram significantemente maiores em tumores associados com amplificação gênica quando comparados com tumores sem amplificação. Além disso, imunorreatividade para SF-1 foi detectada nos tumores com aumento no número de cópias. Doze amplificações do locus FGFR4 (3 pediátricos e 9 de adultos) foram demonstradas por MLPA. A amplificação do locus FGFR4 e hiperexpressão deste gene foram significantemente mais relacionados a carcinomas. Conclusões: Amplificação do gene IGF1R é um evento raro nos tumores adrenocorticais pediátricos e de adultos. A hiperexpressão de IGF1R em tumores adrenocorticais pediátricos não foi secundária à amplificação gênica. Amplificação do gene SF1 foi evidenciada predominantemente em tumores adrenocorticais pediátricos e se correlacionou com hiperexpressão gênica e protéica. Amplificação do locus FGFR4 foi demonstrada predominantemente em tumores adrenocorticais malignos de adultos. Amplificação de oncogenes representa um mecanismo molecular relevante na tumorigênese adrenocortical / Introduction: A high incidence of adrenocortical tumors in children and adults has been observed in Southern and Southeastern regions of Brazil. Overexpression of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes have been described in adrenocortical tumors. Despite of overexpression be a common event in several neoplasias, the molecular mechanism implicated in this upregulation remains unknown. Objectives: To determine the copy number of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes in pediatric and adult adrenocortical tumors. Additionally, correlate with IGF1R, SF1 and FGFR4 gene and/or protein expression data as well as with the histological diagnosis and evolution of the adrenocortical tumors. Patients and methods: Sixty and four patients with adrenocortical tumors were selected for this study. All patients were submitted to clinical evaluation and surgical treatment. Eight normal adrenal glands obtained in renal surgery or autopsies were used as controls. The MLPA reactions were performed with the DNA extracted from adrenal gland tissues in order to determine the copy number of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes. SYBR Green real-time PCR was carried out to confirm MLPA data for IGF1R and SF1 genes. Results: IGF1R amplification was detected by MLPA and confirmed by SYBR green real-time PCR in only one adrenocortical carcinoma. Additionally, other loci amplification was detected (IGFBP3, FGFR4 and NSD1) as well as for control probes, suggesting aneuploidy in this malignant tumor. SF1 amplifications were shown in 10 adrenocortical tumors (8 from children and 2 from adults). The SF1 mRNA levels were significantly higher in adrenocortical tumors associated with increased SF1 gene copies when compared with adrenocortical tumors without gene amplification. Moreover, all adrenocortical tumors with SF1 gene amplification showed a strong SF1 staining. Twelve FGFR4 locus amplifications (3 from children and 9 from adults) were demonstrated by MLPA. FGFR4 locus amplification and overexpression of this gene were significantly more related to carcinomas. Conclusions: IGF1R amplification is a rare event in adrenocortical tumors and it was not responsible for the IGF1R overexpression of pediatric and adult adrenocortical tumors. SF1 gene amplification was detected predominantly in pediatric adrenocortical tumors and was associated with gene and protein overexpression. FGFR4 locus amplification was demonstrated mainly in adult maligant adrenocortical tumors. FGFR4 amplification and upregulation were more associated to adrenocortical carcinomas. Oncogenes amplification represents an important molecular mechanism in adrenocortical tumorigenesis

Introdução: Uma elevada incidência de tumores adrenocorticais pediátricos e de adultos é observada nas regiões sul e sudeste do Brasil. Hiperexpressão dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4 tem sido descrita em tumores adrenocorticais. Apesar de hiperexpressão ser um evento comum em diversas neoplasias, ainda não são claros os mecanismos moleculares que seriam responsáveis por essa falha na regulação da expressão. Objetivos: Determinar o número de cópias dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4 em tumores adrenocorticais diagnosticados em crianças e adultos. Adicionalmente correlacionaremos os dados de expressão gênica e/ou protéica de IGF1R, SF1 e FGFR4 com o diagnóstico histológico e evolutivo dos tumores adrenocorticais. Pacientes e métodos: Sessenta e quatro pacientes com tumores adrenocorticais foram selecionados para o estudo. Todos os pacientes foram submetidos à avaliação clínica e tratamento cirúrgico. Oito glândulas adrenais normais obtidas em cirurgias renais ou autópsias foram utilizadas como controles. DNA genômico extraído dos tecidos normais e tumorais da glândula suprarrenal foram utilizados como substrato nas reações de multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) com o intuito de se determinar o número de cópias dos genes IGF1R, SF1 e FGFR4. PCR em tempo real (SYBR Green) foi realizado para confirmar os dados de MLPA para os genes IGF1R e SF1. Resultados: Amplificação do gene IGF1R foi detectada por MLPA e confirmada por PCR em tempo real SYBR Green em apenas um carcinoma adrenocortical. Adicionalmente, amplificação gênica de outros loci (IGFBP3, FGFR4 e NSD1) bem como de sondas controles foi observada, sugerindo uma condição aneuplóide neste tumor maligno. Amplificação de SF1 foi detectada em 10 tumores adrenocorticais (8 pediátricos e 2 de adultos). Os valores de expressão gênica foram significantemente maiores em tumores associados com amplificação gênica quando comparados com tumores sem amplificação. Além disso, imunorreatividade para SF-1 foi detectada nos tumores com aumento no número de cópias. Doze amplificações do locus FGFR4 (3 pediátricos e 9 de adultos) foram demonstradas por MLPA. A amplificação do locus FGFR4 e hiperexpressão deste gene foram significantemente mais relacionados a carcinomas. Conclusões: Amplificação do gene IGF1R é um evento raro nos tumores adrenocorticais pediátricos e de adultos. A hiperexpressão de IGF1R em tumores adrenocorticais pediátricos não foi secundária à amplificação gênica. Amplificação do gene SF1 foi evidenciada predominantemente em tumores adrenocorticais pediátricos e se correlacionou com hiperexpressão gênica e protéica. Amplificação do locus FGFR4 foi demonstrada predominantemente em tumores adrenocorticais malignos de adultos. Amplificação de oncogenes representa um mecanismo molecular relevante na tumorigênese adrenocortical / Introduction: A high incidence of adrenocortical tumors in children and adults has been observed in Southern and Southeastern regions of Brazil. Overexpression of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes have been described in adrenocortical tumors. Despite of overexpression be a common event in several neoplasias, the molecular mechanism implicated in this upregulation remains unknown. Objectives: To determine the copy number of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes in pediatric and adult adrenocortical tumors. Additionally, correlate with IGF1R, SF1 and FGFR4 gene and/or protein expression data as well as with the histological diagnosis and evolution of the adrenocortical tumors. Patients and methods: Sixty and four patients with adrenocortical tumors were selected for this study. All patients were submitted to clinical evaluation and surgical treatment. Eight normal adrenal glands obtained in renal surgery or autopsies were used as controls. The MLPA reactions were performed with the DNA extracted from adrenal gland tissues in order to determine the copy number of IGF1R, SF1 and FGFR4 genes. SYBR Green real-time PCR was carried out to confirm MLPA data for IGF1R and SF1 genes. Results: IGF1R amplification was detected by MLPA and confirmed by SYBR green real-time PCR in only one adrenocortical carcinoma. Additionally, other loci amplification was detected (IGFBP3, FGFR4 and NSD1) as well as for control probes, suggesting aneuploidy in this malignant tumor. SF1 amplifications were shown in 10 adrenocortical tumors (8 from children and 2 from adults). The SF1 mRNA levels were significantly higher in adrenocortical tumors associated with increased SF1 gene copies when compared with adrenocortical tumors without gene amplification. Moreover, all adrenocortical tumors with SF1 gene amplification showed a strong SF1 staining. Twelve FGFR4 locus amplifications (3 from children and 9 from adults) were demonstrated by MLPA. FGFR4 locus amplification and overexpression of this gene were significantly more related to carcinomas. Conclusions: IGF1R amplification is a rare event in adrenocortical tumors and it was not responsible for the IGF1R overexpression of pediatric and adult adrenocortical tumors. SF1 gene amplification was detected predominantly in pediatric adrenocortical tumors and was associated with gene and protein overexpression. FGFR4 locus amplification was demonstrated mainly in adult maligant adrenocortical tumors. FGFR4 amplification and upregulation were more associated to adrenocortical carcinomas. Oncogenes amplification represents an important molecular mechanism in adrenocortical tumorigenesis

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas destes hormônios é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. As mutações inativadoras e deleções do gene do IGF1R em heterozigose vêm sendo relatadas de forma crescente nos últimos 9 anos em pacientes com história de déficit de crescimento pré e pós-natal. Postula-se que pelo menos 2 a 3% das crianças nascidas PIG poderiam apresentar defeitos no IGF1R. O quadro clínico destes pacientes apresenta grande variabilidade quanto à gravidade do retardo de crescimento pré- e pós-natal e aos parâmetros hormonais. Objetivo: Caracterizar in vitro a resistência ao IGF-1 de pacientes com defeitos no IGF1R, identificados em nosso ambulatório. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal. Destes pacientes, um paciente (SGA1) era portador de mutação missense em heterozigose no gene IGF1R (p.Arg511Trp) e os demais apresentavam baixa expressão dos IGF1R em leucócitos periféricos quando avaliados por PCR em tempo real. Um destes pacientes (SGA2) apresentava também a variante alélica p.Gly6Arg do IGF1R em heterozigose, alteração esta encontrada também em controles e familiares sem déficit de crescimento. As ações do IGF-1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da expressão do IGF-1R e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (via PI3K). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 proliferaram respectivamente 55%, 66%, 64% e 28% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, foi observada redução na expressão do IGF1R nas linhagens SGA2, SGA3 e SGA4 em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Por outro lado, a linhagem SGA1 mostrou expressão aumentada do IGF1R e no conteúdo da proteína em relação aos controles. Em relação á ativação da via PI3K, todas as linhagens dos pacientes apresentaram menor fosforilação de AKT após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles. Conclusão: Demonstramos a presença de insensibilidade parcial ao IGF-1 nas linhagens estudadas. A baixa expressão do IGF1R observada em leucócitos periféricos nas linhagens SGA2, SGA3 e SGA4 foi confirmada em fibroblastos tanto em nível de RNAm quanto da sua proteína. Nestas linhagens a insensibilidade ao IGF-1 é secundária a diminuição da expressão deste receptor. Em contraste a na linhagem com a mutação p.Arg511Trp (SGA1) observou-se expressão normal do IGF-1R na superfície celular. Pacientes com alterações no gene IGF1R não apresentam um fenótipo característico que os diferencie de outras crianças nascidas PIG sem alterações neste gene, mostrando a importância dos estudos moleculares neste grupo de pacientes / Small for gestational age (SGA) children are at a greater risk of having a short stature in adulthood. The type 1 and 2 insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factors determining fetal growth, and most of the known actions of these hormones are mediated via a receptor tyrosine kinase, IGF-1R. Inactivating mutations and deletions of the IGF1R gene in heterozygosis have been reported with increasing frequency in the last 9 years in patients with a history of a failure to thrive pre- and postnatally. It is postulated that at least 2-3% of the children born SGA could be defective for the IGF1R. The clinical presentation of these patients is highly variable with regard to the severity of growth retardation and pre- and post-natal hormonal parameters. Objectives: The goal of this study was to identify the in vitro insensitivity to IGF-1 in patients with defects in IGF1R. Methods: We developed fibroblast cultures from two controls (C1 and C2) and 4 patients born SGA (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4) with a suspected insensitivity to IGF-1 by the absence of catch-up growth during their postnatal life. Of these patients, one (SGA1) carried a heterozygous missense mutation in the IGF1R gene (p.Arg511Trp), and the others exhibited low expression levels of IGF1R in their peripheral leukocytes, as evaluated using real-time PCR. One of these patients (SGA2) was also heterozygous for the allelic variant p.Gly6Arg of IGF1R, an alteration also found in the controls and family members not displaying growth restriction. The actions of IGF-1 were determined using proliferation assays, an analysis of the expression of IGF- 1R and phosphorylation studies of proteins of the IGF-1 signaling pathway in fibroblasts (via PI3K).Results: The SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4 fibroblasts proliferated 55%, 66%, 64% and 28%, respectively, less under the stimulation of IGF-1 compared to the control lines. Using real-time PCR, the IGF1R mRNA expression showed reduced levels of IGF1R in the SGA2, SGA3 and SGA4 cells compared to the controls, and the total IGF-1R protein was also decreased in these cells. Moreover, the SGA1 cells showed increased expression levels of IGF1R mRNA and protein compared to the controls. In relation to the activation of PI3K, all of the cells showed decreased phosphorylation of AKT after the stimulation with IGF-1 compared to the control cells. Conclusion: We demonstrated the presence of a partial insensitivity to IGF-1 in the studied samples. The low expression of IGF1R observed in the peripheral leukocytes in the SGA2, SGA3 and SGA4 fibroblasts was confirmed at both the mRNA and protein levels, and the Andréa de Castro Leal Doutorado insensitivity of the cells to IGF-1 is secondary to the decreased expression of the receptor. In contrast, the cells with the mutation p.Arg511Trp (SGA1) displayed normal IGF-1R expression on the cell surface. The patients with alterations in the IGF1R gene do not exhibit a characteristic phenotype that differentiates them from other children born SGA and with no changes in this gene, thus showing the importance of molecular studies for this group of patients

Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulina-símile 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. Na vida pós-natal o GH, principal hormônio promotor de crescimento, exerce a maior parte de seus efeitos por meio do IGF-1. A grande maioria das ações conhecidas do IGF-1 e IGF-2 são mediadas via receptor tirosina quinase conhecido como receptor tipo 1 de IGFs (IGF-1R). Os objetivos deste trabalho foram estudar os genes IGF1 e IGF1R em crianças nascidas pequenas para a idade gestacional que não recuperaram o crescimento na vida pós-natal. Foram selecionados 145 pacientes nascidos PIG, 72 sem catch up e 73 com catch up. Em 54 PIG sem catch up foi estudado toda a seqüência codificadora do gene IGF1 por meio de PCR e seqüenciamento direto, nos demais PIG sem catch up e nos 73 PIG com catch up foi estudado apenas o exon 6 do IGF-1 por PCR e seqüenciamento direto para avaliação de um polimorfismo encontrado nesta região. Nos pacientes que apresentavam concentração sérica de IGF-1 e IGFBP-3 acima da média para idade e sexo e seqüência do IGF1 normal (n=23) foi realizada coleta de sangue periférico com posterior separação de leucócitos mononucleares pelo gradiente de ficoll seguido por extração de RNA pelo método de Trizol® Posteriormente, a partir do RNA, sintetizamos o cDNA (DNA complementar) utilizando primers randômicos. Foi realizado PCR e seqüenciamento direto do cDNA, além de análise da expressão do IGF1R por PCR em tempo real. Nenhuma mutação foi encontrada no gene IGF1. Entretanto um locus altamente polimórfico foi encontrada na região 3\' não traduzida do exon 6 deste gene, região esta envolvida no processo de poliadenilação. A freqüência das variantes alélicas foi semelhante em PIG com e sem catch-up e em controles nascidos AIG. Analisando o fenótipo de pacientes PIG que apresentavam a variante alélica wild type ou uma das três variantes alélicas mais freqüentemente encontradas, não observamos diferenças significativas entre peso e comprimento ao nascimento, níveis de IGF-1 e crescimento na vida pós-natal. No gene IGF1R encontramos duas variantes alélicas nunca descritas previamente. A primeira variante encontrada está localizada no exon 1, em uma região de peptídeo sinal do pro IGF-1R e consiste na troca do nucleotídeo guanina pelo nucleotídeo adenina na posição 16 da região codificadora (c.16G>A), levando a troca do aminoácido glicina por arginina na posição 6 da proteína (p.G6R). A outra mutação encontrada está localizada no exon 7 onde observamos uma troca do nucleotídeo citosina por timina na posição 1531 do cDNA (c.1531 C>T), levando a uma troca de arginina por triptofano na posição 511 do IGF1R (p.R511W). Adicionalmente, foi observada uma expressão do IGF1R diminuída em 5 pacientes estudados.Concluímos que as variantes alélicas encontradas na região de poliadenilação do IGF1 não influenciam significativamente as características ao nascimento e pós-natais de crianças nascidas PIG ou a altura adulta de indivíduos normais nascidos AIG. O estudo do IGF1R identificou duas novas variantes alélicas em heterozigose no gene IGF1R e, em cinco pacientes, observamos uma expressão reduzida deste gene. Pacientes com alterações no gene IGF1R não apresentam um fenótipo característico que os diferencie de outras crianças nascidas PIG sem alterações neste gene, mostrando a importância dos estudos moleculares. / Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of remaining short in adulthood. The insulin-like growth factors 1 and 2 (IGF-1 and IGF-2) are the main factors determining endocrine fetal growth. GH is the main promoter of linear growth in the postnatal life, exerting its effects mostly through the IGF-1. The vast majority of known actions of IGF-1 and IGF-2 are mediated by the insulin-like growth factor type 1 receptor (IGF-1R), a member of the tyrosine kinase receptors family. The aim of this study was to investigate IGF1 and IGF1R genes mutations in children born small for gestational age without catch up growth in postnatal life. We selected 145 patients born SGA, 72 without catch-up and 73 with catch up. The whole coding region of the IGF1 gene was sequenced in 54 patients without catchup. In the other SGA children without catch-up and in 73 SGA with catch-up, only the exon 6 of IGF1 was sequenced to assess the influence of allelic variants present in this region. In patients with normal IGF1 sequence and IGF-1 and IGFBP-3 serum levels above the mean for age and sex (n = 23) total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes followed by cDNA synthesis with random primers. The IGF1R cDNA was amplified using specific primers followed by direct sequencing. IGF1R expression was analyzed by real-time PCR. No mutations were found in the IGF1 gene. However a highly polymorphic sequence was identified in the upstream core polyadenylation signal (UCPAS) located in IGF1 3\' UTR at exon 6. The frequency of the identified allelic variants was similar in SGA children with and without catch-up and in controls. Furthermore, children homozygous for the wild-type allele and those carrying the allelic variants in homozygous or heterozygous state presented similar weight and length at birth, as well as serum IGF-1 levels and postnatal growth features. Two novel nonconservative allelic variants were identified in IGF1R in 23 SGA children (8.7%) in the heterozygous state. The first variant (c.16G>A) was located in the exon one, leading to a substitution of glicine by arginine in the pro-IGF-1R signaling peptide (p.G6R). The second variant was located in exon 7 (c.1531 C>T), leading to a substitution of arginine by tryptophan in the amino acid 511 of the IGF1-R (p.R511W). Moreover, a decreased IGF1R expression was observed in 5 of the 23 patients with elevated serum IGF-1 concentrations. We conclude that the UCPAS allelic variants did not significantly influence the birth and postnatal characteristics of children born SGA, neither the adult height of normal individuals born adequate for gestational age. The IGF1R study identified two novel allelic variants in two patients and a reduced expression of the IGF1R was observed in five patients. Patients with alterations in IGF1R did not have a distinctive phenotype when compared with other children born SGA without changes in this gene, indicating the importance of molecular studies.

As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition