Made available in DSpace on 2013-10-29T16:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451788-Texto+Completo-0.pdf: 1287455 bytes, checksum: d1990d71c198ca3db981a675db0e192b (MD5) Previous issue date: 2013 / The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a major hematopoietic cytokine involved in the immune defense against infectious agents, stimulating and regulating the proliferation, survival and differentiation of neutrophils precursor cells in the bone marrow. The G-CSF molecule has a 174 amino acids sequence, with a molecular weight of approximately 18. 8 kDa. As a strategy for neutropenia prevention, G-CSF (or filgrastim) has been successfully used in cancer patients whose treatment requires high doses of chemotherapy, in both adults and children. Moreover, this biopharmaceutical may be used to strengthen the immune system in patients with HIV, pneumonia, infections resulting from diabetes, leukemia and febrile neutropenia. Currently, filgrastim is not produced in Brazil, which obligates the government to import this medicine. Due to its wide clinical application, the large scale production of G-CSF is required to supply the demand of national market. In this work, a protocol to obtain this protein was developed using overexpression and cultivation in a bioreactor, solubilization and purification of recombinant G-CSF. The protein was expressed in Escherichia coli host cells C41(DE3) cultures grown in bioreactor using a fed-batch strategy. The expression of the recombinant protein was induced by IPTG. A linear ascending feeding strategy permitted high plasmid stability, low accumulation of acetate in the culture medium, a biomass of approximately 31 g/ L and high expression levels of the protein in the form of inclusion bodies which were solubilized using 2 M urea and alkaline pH. The recombinant protein was purified and yielded approximately 1. 22 mg of homogeneous recombinant protein per gram of wet cells, corresponding to a volumetric yield of 151. 5 mg of rhG-CSF per liter of culture medium. A mass spectrometry analysis was performed, confirming the identity of the recombinant protein. Our work shows a simple and effective strategy to obtain recombinant hG-CSF, stimulating and encouraging a future production of a national biosimilar. / O fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) é uma das principais citocinas hematopoiéticas envolvidas na defesa do sistema imune contra agentes infecciosos, estimulando e regulando a proliferação, sobrevivência e diferenciação das células precursoras de neutrófilos na medula óssea. É uma molécula que possui uma sequência de 174 aminoácidos, com peso molecular de aproximadamente 18,8 kDa. Como estratégia de prevenção da neutropenia, o G-CSF (ou filgrastima) é utilizado clinicamente com sucesso em pacientes com câncer, cujo tratamento requer altas doses de quimioterapia, tanto em adultos como em crianças. Além disso, o G-CSF pode ser utilizado para reforçar o sistema imunológico em pacientes com HIV, pneumonia, infecções decorrentes da diabetes, leucemia e neutropenia febril. Atualmente, a filgrastima não é produzida no Brasil, consequentemente, todo medicamento adquirido pelo governo é importado. Tendo em vista sua ampla aplicação clínica, a produção em larga escala do G-CSF se faz necessária para suprir a demanda do mercado nacional e diminuir os custos com importação desse biofármaco. Neste trabalho um protocolo para a produção desta proteína foi desenvolvido, utilizando técnicas de DNA recombinante por meio de experimentos de superexpressão e cultivo em biorreator, solubilização e purificação da G-CSF recombinante. A proteína foi expressa em células Escherichia coli C41(DE3) em cultivos de batelada alimentada em biorreactor, utilizando indução com IPTG e uma estratégia de alimentação linear ascendente, que nos permitiu obter um alto percentual de estabilidade plasmidial, baixo acúmulo de acetato no meio de cultivo, uma biomassa de aproximadamente 31 g/ L e elevados níveis de expressão da proteína em forma de corpos de inclusão, que foram solubilizados utilizando ureia 2 M e pH alcalino. A proteína recombinante foi purificada obtendo-se aproximadamente 1,22 mg de proteína recombinante homogênea por grama de células úmida, correspondendo a um rendimento volumétrico de 151,5 mg de rhG-CSF por litro de meio de cultura. Uma análise por espectrometria de massa também foi realizada, confirmando a identidade da proteína recombinante. Nosso trabalho mostra uma estratégia simples e eficaz para obter hG-CSF recombinante, contribuindo e estimulando a futura produção de um biossimilar nacional.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451788.pdf: 1287455 bytes, checksum: d1990d71c198ca3db981a675db0e192b (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a major hematopoietic cytokine involved in the immune defense against infectious agents, stimulating and regulating the proliferation, survival and differentiation of neutrophils precursor cells in the bone marrow. The G-CSF molecule has a 174 amino acids sequence, with a molecular weight of approximately 18.8 kDa. As a strategy for neutropenia prevention, G-CSF (or filgrastim) has been successfully used in cancer patients whose treatment requires high doses of chemotherapy, in both adults and children. Moreover, this biopharmaceutical may be used to strengthen the immune system in patients with HIV, pneumonia, infections resulting from diabetes, leukemia and febrile neutropenia. Currently, filgrastim is not produced in Brazil, which obligates the government to import this medicine. Due to its wide clinical application, the large scale production of G-CSF is required to supply the demand of national market. In this work, a protocol to obtain this protein was developed using overexpression and cultivation in a bioreactor, solubilization and purification of recombinant G-CSF. The protein was expressed in Escherichia coli host cells C41(DE3) cultures grown in bioreactor using a fed-batch strategy. The expression of the recombinant protein was induced by IPTG. A linear ascending feeding strategy permitted high plasmid stability, low accumulation of acetate in the culture medium, a biomass of approximately 31 g/ L and high expression levels of the protein in the form of inclusion bodies which were solubilized using 2 M urea and alkaline pH. The recombinant protein was purified and yielded approximately 1.22 mg of homogeneous recombinant protein per gram of wet cells, corresponding to a volumetric yield of 151.5 mg of rhG-CSF per liter of culture medium. A mass spectrometry analysis was performed, confirming the identity of the recombinant protein. Our work shows a simple and effective strategy to obtain recombinant hG-CSF, stimulating and encouraging a future production of a national biosimilar. / O fator estimulador de col?nias de granul?citos (G-CSF) ? uma das principais citocinas hematopoi?ticas envolvidas na defesa do sistema imune contra agentes infecciosos, estimulando e regulando a prolifera??o, sobreviv?ncia e diferencia??o das c?lulas precursoras de neutr?filos na medula ?ssea. ? uma mol?cula que possui uma sequ?ncia de 174 amino?cidos, com peso molecular de aproximadamente 18,8 kDa. Como estrat?gia de preven??o da neutropenia, o G-CSF (ou filgrastima) ? utilizado clinicamente com sucesso em pacientes com c?ncer, cujo tratamento requer altas doses de quimioterapia, tanto em adultos como em crian?as. Al?m disso, o G-CSF pode ser utilizado para refor?ar o sistema imunol?gico em pacientes com HIV, pneumonia, infec??es decorrentes da diabetes, leucemia e neutropenia febril. Atualmente, a filgrastima n?o ? produzida no Brasil, consequentemente, todo medicamento adquirido pelo governo ? importado. Tendo em vista sua ampla aplica??o cl?nica, a produ??o em larga escala do G-CSF se faz necess?ria para suprir a demanda do mercado nacional e diminuir os custos com importa??o desse biof?rmaco. Neste trabalho um protocolo para a produ??o desta prote?na foi desenvolvido, utilizando t?cnicas de DNA recombinante por meio de experimentos de superexpress?o e cultivo em biorreator, solubiliza??o e purifica??o da G-CSF recombinante. A prote?na foi expressa em c?lulas Escherichia coli C41(DE3) em cultivos de batelada alimentada em biorreactor, utilizando indu??o com IPTG e uma estrat?gia de alimenta??o linear ascendente, que nos permitiu obter um alto percentual de estabilidade plasmidial, baixo ac?mulo de acetato no meio de cultivo, uma biomassa de aproximadamente 31 g/ L e elevados n?veis de express?o da prote?na em forma de corpos de inclus?o, que foram solubilizados utilizando ureia 2 M e pH alcalino. A prote?na recombinante foi purificada obtendo-se aproximadamente 1,22 mg de prote?na recombinante homog?nea por grama de c?lulas ?mida, correspondendo a um rendimento volum?trico de 151,5 mg de rhG-CSF por litro de meio de cultura. Uma an?lise por espectrometria de massa tamb?m foi realizada, confirmando a identidade da prote?na recombinante. Nosso trabalho mostra uma estrat?gia simples e eficaz para obter hG-CSF recombinante, contribuindo e estimulando a futura produ??o de um biossimilar nacional.