Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401649-Texto+Completo-0.pdf: 937750 bytes, checksum: 1be2b50a72c9a07775715c1800439014 (MD5) Previous issue date: 2008 / The granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is a cytokine that belongs to a group of glycoprotein that regulates the proliferation and differentiation of hematopoietic cells, more specifically granulocytes and macrophages. The human GM-CSF is a 14. 4 kDa protein consisting of 127 amino acid polypeptide chain and shares 52% of similarities with murine protein. The human protein has 4 cysteine residues that forms two disulphide bonds; only the Cysteine 54 and 96 are required for the biologic activity of it. This biopharmaceutical has been widely used in neutropenic patients who receive high-dose chemotherapy or were transplanted. Therefore, GM-CSF is used to restore hematopoietic dysfunctions, to stimulate the hyper-production of functionally primed effectors cells and to augment host defense against infection and malignant diseases. Its use is associated with significant decreases in chemotherapy-associated infections, antibiotic use, length of hospital day and mortality. The international patent of the biopharmaceutical Molgramostim (generic name) expired in 2006, and thus became an interesting product to pharmaceutical industries, including those settled in Brazil. Presently, Molgramostim is sold in Brazil as an imported biopharmaceutical, which, in turn becomes very costly to the Brazilian government. Therefore, the aim of this work is to develop a methodology for subsequent production of a national Molgramostim. In this work the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene was assembled by PCR. It was cloned into pET30a(+) expression vector and the best condition for expression of the protein was in the BL21(DE3) strain from Escherichia coli. To the isolation of inclusion bodies an efficient protocol was developed using multi step washing procedure and purification method of the recombinant protein from inclusion bodies using only a cationic and then an anionic exchange column. The immunoassay and N-terminal sequencing confirmed the identity of rhGM-CSF. The result of the biological activity assay, in vitro, showed that the rhGM-CSF produced has an equivalent biological potential to the standard reference. The protein rhGM-CSF was produced through simple, cost effective and economically feasible process and is extremely important to the industrial procedure and healthcare community. / O fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) é uma citocina pertencente a um grupo de glicoproteínas que regula a proliferação e a diferenciação de células hematopoiéticas, mais especificamente macrófagos e granulócitos. O GM-CSF humano é uma proteína de 14,5 kDa constituída de 127 aminoácidos e possui 52% de similaridade com a proteína de rato. A proteína humana possui 4 resíduos de cisteína formando duas pontes dissulfeto, porém apenas as cisteínas 54 e 96 são requeridas para a atividade biológica da mesma. Este biofármaco tem sido usado em pacientes neutropênicos que receberam altas doses de quimioterapia ou transplantados. Além disso, GM-CSF é usado para restabelecer disfunções hematopoiéticas, estimular a hiper-produção de células efetoras pré-induzidas (“primed”) funcionalmente e promover a defesa do hospedeiro contra doenças infecciosas e malignas. O uso dos mesmos está relacionado à redução no número de infecções associadas à quimioterapia, no uso de antibióticos e no tempo total de internação do paciente bem como no número de mortes. A patente internacional do biofármaco Molgramostima (nome genérico) expirou em 2006 e, além disso, tornou-se um interessante produto para indústrias farmacêuticas, inclusive para aquelas estabelecidas no Brasil. Molgramostima é vendida no Brasil como um biofármaco importado, o qual, desta forma, torna-se muito custoso para o governo brasileiro. Contudo, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma metodologia para a posterior produção industrial de uma molgramostima a nível nacional. Neste trabalho, o gene para o hGM-CSF foi construído por PCR, clonado no vetor de expressão pET30a(+) e expresso na cepa BL21(DE3) de Escherichia coli na sua forma insolúvel. Para o isolamento e solubilização dos corpos de inclusão um eficiente protocolo foi desenvolvido utilizando múltiplos passos de lavagem e um método de purificação usando somente duas colunas cromatográficas de troca catiônica e aniônica, respectivamente. O teste de atividade biológica in vitro demonstrou que o rhGM-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrão internacional utilizado. A proteína foi obtida por meio de um processo simples e econômico, sendo de extrema importância em procedimento industrial e para saúde da população.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-29Bitstream added on 2014-08-13T17:59:53Z : No. of bitstreams: 1 000770166.pdf: 4471991 bytes, checksum: d06f7bf044c47db0420eecb64e0086d9 (MD5) / A esquistossomose é uma das principais doenças parasitárias nos trópicos e subtrópicos, causada pelo Schistosoma mansoni. Uma alternativa para o tratamento desta doença é a quimioterapia, especialmente com praziquantel (PZQ), o qual é altamente permeável, porém apresenta baixa solubilidade em água, o que interfere na sua biodisponibilidade. Muitas estratégias utilizam polímeros no desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos com intuito de modificar as propriedades farmacotécnicas e biofarmacêuticas. Dentre elas, destacam-se os hidrogéis de dextrano, que apresenta várias propriedades vantajosas, algumas delas são: baixa toxicidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade. Em trabalho anterior, foram desenvolvidos hidrogéis de dextrano 70 (DEX-70) e 148kDa (DEX-148) contendo praziquantel por um método simples, econômico, de fácil execução, sem a utilização de reticulantes químicos, o que gerou perfis de liberação diferentes do fármaco incorporado, graças a capacidade de intumescimento dos hidrogéis formados com cada um dos polímeros. Com base no observado neste trabalho avaliamos a utilização de blendas, que pode apresentar uma vantagem tecnológica importante, desenvolvendo novos materiais com propriedades diferentes, sem perder suas características e agregando suas propriedades vantajosas que podem ser usadas no desenvolvimento de sistemas de liberação, para a modulação das propriedades farmacotécnicas e biofarmacêuticas, de forma a desenvolver uma nova plataforma tecnológica em termos de Sistemas de liberação de fármacos. Os hidrogéis foram caracterizados, empregando o RMN-H1, o qual constatou um interação entre dextrano e praziquantel no hidrogel 1:1:1 (PZQ:DEX-70:DEX-148). A difração de Raios-X, juntamente com o DSC, mostrou que parte do fármaco está disperso na matriz polimérica na forma de cristalitos, ajudando a melhorar sua solubilidade, como comprovado pelo estudo de ... / Schistosomiasis is a major parasitic diseases in the tropics and subtropics, caused by Schistosoma mansoni. An alternative treatment for this condition is chemotherapy, especially with praziquantel (PZQ), which is highly permeable, but has a very low solubility in water, which interferes with its bioavailability. Many strategies have been use polymers in the development of systems for controlled drug release in order to modify pharmacotechnical and biopharmaceutical properties. Amongst them, highlight the dextran hydrogels, which present various advantageous properties, some of them are: low toxicity, biocompatibility and biodegradability. In previous studies, dextran 70 (DEX-70) and 148kDa (DEX-148) hydrogels containing praziquantel had been developed by a simple, economical, of easy execution, without the use of chemical crosslinking, which generated different release profiles of drug incorporated, due swelling capacity of the hydrogels formed from each one of polymers. Based on observed in this study, the utilization of blends, which can present a major technological advantage by developing new materials with different properties, without losing its characteristics and adding their advantageous properties that can be used in the development of delivery systems, was evaluated, to provide a modulation of its pharmacotechnical and biopharmaceutical propertiesin order to develop a new technological platform in terms of systems for drug delivery. Hidrogels were characterized, employing 1H-NMR, which found an interaction between dextran and praziquantel into 1:1:1 (PZQ:DEX-70:DEX-148) hydrogel. The X-ray diffraction along with DSC showed that part of drug is dispersed in the polymer matrix in the form of crystallites, helping to improve its solubility, as evidenced by solubility studies. In in vivo studies, the sample 1:2:1 and 1:2:2, were the ones that were more effective. Finally, it was found that preparation of dextran blends containing ...

Orientador : Maria Palmira Daflon Gremião / Banca: Clovis Augusto Ribeiro / Banca: Silmara Marques Allegretti / Banca: Mara Cristina Pinto / Banca: Adélia Emília de Almeida / Resumo: A esquistossomose é uma das principais doenças parasitárias nos trópicos e subtrópicos, causada pelo Schistosoma mansoni. Uma alternativa para o tratamento desta doença é a quimioterapia, especialmente com praziquantel (PZQ), o qual é altamente permeável, porém apresenta baixa solubilidade em água, o que interfere na sua biodisponibilidade. Muitas estratégias utilizam polímeros no desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos com intuito de modificar as propriedades farmacotécnicas e biofarmacêuticas. Dentre elas, destacam-se os hidrogéis de dextrano, que apresenta várias propriedades vantajosas, algumas delas são: baixa toxicidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade. Em trabalho anterior, foram desenvolvidos hidrogéis de dextrano 70 (DEX-70) e 148kDa (DEX-148) contendo praziquantel por um método simples, econômico, de fácil execução, sem a utilização de reticulantes químicos, o que gerou perfis de liberação diferentes do fármaco incorporado, graças a capacidade de intumescimento dos hidrogéis formados com cada um dos polímeros. Com base no observado neste trabalho avaliamos a utilização de blendas, que pode apresentar uma vantagem tecnológica importante, desenvolvendo novos materiais com propriedades diferentes, sem perder suas características e agregando suas propriedades vantajosas que podem ser usadas no desenvolvimento de sistemas de liberação, para a modulação das propriedades farmacotécnicas e biofarmacêuticas, de forma a desenvolver uma nova plataforma tecnológica em termos de Sistemas de liberação de fármacos. Os hidrogéis foram caracterizados, empregando o RMN-H1, o qual constatou um interação entre dextrano e praziquantel no hidrogel 1:1:1 (PZQ:DEX-70:DEX-148). A difração de Raios-X, juntamente com o DSC, mostrou que parte do fármaco está disperso na matriz polimérica na forma de cristalitos, ajudando a melhorar sua solubilidade, como comprovado pelo estudo de ... / Abstract: Schistosomiasis is a major parasitic diseases in the tropics and subtropics, caused by Schistosoma mansoni. An alternative treatment for this condition is chemotherapy, especially with praziquantel (PZQ), which is highly permeable, but has a very low solubility in water, which interferes with its bioavailability. Many strategies have been use polymers in the development of systems for controlled drug release in order to modify pharmacotechnical and biopharmaceutical properties. Amongst them, highlight the dextran hydrogels, which present various advantageous properties, some of them are: low toxicity, biocompatibility and biodegradability. In previous studies, dextran 70 (DEX-70) and 148kDa (DEX-148) hydrogels containing praziquantel had been developed by a simple, economical, of easy execution, without the use of chemical crosslinking, which generated different release profiles of drug incorporated, due swelling capacity of the hydrogels formed from each one of polymers. Based on observed in this study, the utilization of blends, which can present a major technological advantage by developing new materials with different properties, without losing its characteristics and adding their advantageous properties that can be used in the development of delivery systems, was evaluated, to provide a modulation of its pharmacotechnical and biopharmaceutical propertiesin order to develop a new technological platform in terms of systems for drug delivery. Hidrogels were characterized, employing 1H-NMR, which found an interaction between dextran and praziquantel into 1:1:1 (PZQ:DEX-70:DEX-148) hydrogel. The X-ray diffraction along with DSC showed that part of drug is dispersed in the polymer matrix in the form of crystallites, helping to improve its solubility, as evidenced by solubility studies. In in vivo studies, the sample 1:2:1 and 1:2:2, were the ones that were more effective. Finally, it was found that preparation of dextran blends containing ... / Doutor

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451784-Texto+Completo-0.pdf: 974193 bytes, checksum: b53f42e8acb1653e7c655d1d1345a38b (MD5) Previous issue date: 2013 / Annexin V is an endogenous human protein Ca+2 dependent, with a molecular weight of 35. 8 kDa, widely distributed intracellularly, with very high concentrations in the placenta and lower concentrations in endothelial cells, kidneys, myocardium, skeletal muscle, skin, red cells, platelets and monocytes. Annexin V binds preferably to phosphatidylserine, a phospholipid commonly present on inner leaflet of lipid bilayer, which during cell apoptosis is translocated to outer leaflet of cell membrane. Despite of Annexin V is a relatively large protein, it was shown early on that the protein can be internalized at sites of ischemic injury both in the heart and in the brain and cross the intact blood-brain barrier, being increasingly used as a tool to detect apoptosis in several diseases such as Alzheimer and Ischemia and in drug. Therefore, production of recombinant human Annexin V using recombinant DNA technique along with High Cell Density Culture and protein purification becomes applicable to commercialize it in Brazil, increasing and facilitating the access of pharmaceutical industries and research laboratories in purchase product. We developed a protocol to produce recombinant human annexin V in large scale, in which approximately 20 mg of recombinant protein was yielded from 3 g of E. coliBL21(DE3) wet cells. N-terminal amino acid sequencing and massspectrometry analysis provided evidence for the identity and purity of therecombinant protein, as well as an apoptosis/necrosis in vitro detectionkit produced performed similarities with an imported commercialized kit in Brazil. / A Anexina V é uma proteína humana endógena dependente de Ca+2, com peso molecular de 35,8 kDa, amplamente distribuída intracelularmente em altas concentrações na placenta e em concentrações mais baixas nas células endoteliais, renais, miocárdicas, epiteliais, esqueléticas musculares, eritrócitos, plaquetas e monócitos. Apresenta como principal característica a capacidade de se ligar à fosfatidilserina, um fosfolipídeo presente na camada interna da bicamada lipídica, que durante a apoptose celular é translocada para a camada externa da membrana celular. Apesar de ser uma proteína de tamanho relativamente grande, a Anexina V apresentou a capacidade de penetrar em sítios de injúria isquêmica tanto miocárdica quanto cerebral, atravessando a Barreira Hemato-Encefálica, sendo cada vez mais utilizada para deteção de apoptose em diversas doenças como Alzheimer e Isquemia e em monitoramento de drogas anticâncer. Por esses motivos, se torna relevante a produção da proteína Anexina V humana através da técnica do DNA recombinante em larga escala para que possa ser comercializada no Brasil, aumentando e facilitando o acesso de laboratórios de pesquisa e indústrias farmacêuticas na aquisição deste produto. Desenvolvemos um protocolo para cultivoem biorreator de grandes quantidades de Anexina V recombinante, no qual aproximadamente 20 mg de proteína recombinante podem ser obtidos a partir de 3 g de célula úmida de E. coli BL21(DE3). As análises porsequenciamento N-terminal de aminoácidos e espectrometria de massas proveram evidências para a identidade e pureza da proteína recombinante, assim como um desenvolvimento de um kit para marcação de apoptose in vitro apresentou muita semelhança com outro kit importado já comercializado no Brasil.

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451788-Texto+Completo-0.pdf: 1287455 bytes, checksum: d1990d71c198ca3db981a675db0e192b (MD5) Previous issue date: 2013 / The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a major hematopoietic cytokine involved in the immune defense against infectious agents, stimulating and regulating the proliferation, survival and differentiation of neutrophils precursor cells in the bone marrow. The G-CSF molecule has a 174 amino acids sequence, with a molecular weight of approximately 18. 8 kDa. As a strategy for neutropenia prevention, G-CSF (or filgrastim) has been successfully used in cancer patients whose treatment requires high doses of chemotherapy, in both adults and children. Moreover, this biopharmaceutical may be used to strengthen the immune system in patients with HIV, pneumonia, infections resulting from diabetes, leukemia and febrile neutropenia. Currently, filgrastim is not produced in Brazil, which obligates the government to import this medicine. Due to its wide clinical application, the large scale production of G-CSF is required to supply the demand of national market. In this work, a protocol to obtain this protein was developed using overexpression and cultivation in a bioreactor, solubilization and purification of recombinant G-CSF. The protein was expressed in Escherichia coli host cells C41(DE3) cultures grown in bioreactor using a fed-batch strategy. The expression of the recombinant protein was induced by IPTG. A linear ascending feeding strategy permitted high plasmid stability, low accumulation of acetate in the culture medium, a biomass of approximately 31 g/ L and high expression levels of the protein in the form of inclusion bodies which were solubilized using 2 M urea and alkaline pH. The recombinant protein was purified and yielded approximately 1. 22 mg of homogeneous recombinant protein per gram of wet cells, corresponding to a volumetric yield of 151. 5 mg of rhG-CSF per liter of culture medium. A mass spectrometry analysis was performed, confirming the identity of the recombinant protein. Our work shows a simple and effective strategy to obtain recombinant hG-CSF, stimulating and encouraging a future production of a national biosimilar. / O fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) é uma das principais citocinas hematopoiéticas envolvidas na defesa do sistema imune contra agentes infecciosos, estimulando e regulando a proliferação, sobrevivência e diferenciação das células precursoras de neutrófilos na medula óssea. É uma molécula que possui uma sequência de 174 aminoácidos, com peso molecular de aproximadamente 18,8 kDa. Como estratégia de prevenção da neutropenia, o G-CSF (ou filgrastima) é utilizado clinicamente com sucesso em pacientes com câncer, cujo tratamento requer altas doses de quimioterapia, tanto em adultos como em crianças. Além disso, o G-CSF pode ser utilizado para reforçar o sistema imunológico em pacientes com HIV, pneumonia, infecções decorrentes da diabetes, leucemia e neutropenia febril. Atualmente, a filgrastima não é produzida no Brasil, consequentemente, todo medicamento adquirido pelo governo é importado. Tendo em vista sua ampla aplicação clínica, a produção em larga escala do G-CSF se faz necessária para suprir a demanda do mercado nacional e diminuir os custos com importação desse biofármaco. Neste trabalho um protocolo para a produção desta proteína foi desenvolvido, utilizando técnicas de DNA recombinante por meio de experimentos de superexpressão e cultivo em biorreator, solubilização e purificação da G-CSF recombinante. A proteína foi expressa em células Escherichia coli C41(DE3) em cultivos de batelada alimentada em biorreactor, utilizando indução com IPTG e uma estratégia de alimentação linear ascendente, que nos permitiu obter um alto percentual de estabilidade plasmidial, baixo acúmulo de acetato no meio de cultivo, uma biomassa de aproximadamente 31 g/ L e elevados níveis de expressão da proteína em forma de corpos de inclusão, que foram solubilizados utilizando ureia 2 M e pH alcalino. A proteína recombinante foi purificada obtendo-se aproximadamente 1,22 mg de proteína recombinante homogênea por grama de células úmida, correspondendo a um rendimento volumétrico de 151,5 mg de rhG-CSF por litro de meio de cultura. Uma análise por espectrometria de massa também foi realizada, confirmando a identidade da proteína recombinante. Nosso trabalho mostra uma estratégia simples e eficaz para obter hG-CSF recombinante, contribuindo e estimulando a futura produção de um biossimilar nacional.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-20T13:50:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Pabllo Barbosa.pdf: 1956144 bytes, checksum: 36d500813f960974475f746372d2bc64 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-20T13:50:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Pabllo Barbosa.pdf: 1956144 bytes, checksum: 36d500813f960974475f746372d2bc64 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-20T13:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Pabllo Barbosa.pdf: 1956144 bytes, checksum: 36d500813f960974475f746372d2bc64 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / Oral administration and absorption of drugs depend essentially on the aqueous solubility and intestinal permeability of the molecule, which are key parameters for bioavailability and therapeutic efficacy. The excipients exert well-established roles in the composition of the medicaments, which may increase the stability, solubility, absorption and efficacy of the drug. Consequently, the inappropriate use of an excipient may impact the biopharmaceutical stage, especially in its solubilization and permeation, which will reflect in the pharmacokinetic stage. The Biopharmaceutical Classification System (BCS), based on the properties of solubility and permeability, is a tool that emerged in the 1990s to help predict the bioavailability of the drugs. BCS classifies the drug into four categories, where Class I drugs have high solubility and permeability, while Class IV drugs have low solubility and permeability. Furosemide is classified, according to BCS, as a Class IV drug and, therefore, is a substance of difficult solubilization and permeation. In vitro dissolution studies allow the dissolution profile of the drug to be evaluated by simulation of physiological conditions of the gastrointestinal tract (GIT) to determine its release or release rate kinetics, which are fundamental for the evaluation of pharmaceutical equivalence between different manufacturers of the same product. And in order to estimate whether there is truthfulness in the use of standard excipients for drug formulation, as well as whether or not the size of the capsule influences the dissolution of the drug, furosemide capsules number 2 and 4 were manipulated using the excipients recommended by the literature, and later compared to formulations of pharmacies. In this sense, the present study evaluated, by means of in vitro pharmacopoeial tests that determine the drug's drug availability, if the manipulation pharmacies of Manaus used the excipients proposed by the technical and scientific literature that guarantee the dissolution of manipulated furosemide in capsules, as well as the quality parameters for oral solid dosage forms. Not all pharmacies have met the minimum quality requirements recommended by pharmacopoeias. To assess drug release, dissolution profiles of furosemide were plotted in phosphate buffer pH 5.8. The results obtained indicated significant differences in the rate and amount of furosemide released, and only 1 pharmacy was approved in the dissolution test in the second stage, and capsule number 2 is the most indicated. Thus, it was found that for the biopharmaceutical factors of furosemide to be improved, it is necessary to add suitable excipients, and that they exert substantial influence on the rate of drug release. The inappropriate use of its excipients affect the solubility and permeability and, therefore, its bioavailability, impairing the clinical response and treatment of the patient. / Administração e absorção oral de fármacos dependem essencialmente da solubilidade aquosa e da permeabilidade intestinal da molécula, que são parâmetros fundamentais para a biodisponibilidade e eficácia terapêutica. Os excipientes exercem funções bem estabelecidas na composição dos medicamentos, podendo aumentar a estabilidade, solubilidade, absorção e eficácia do fármaco. Consequentemente, o uso inadequado de um excipiente pode impactar na etapa biofarmacêutica, sobretudo na sua solubilização e permeação, o que irá refletir na etapa farmacocinética. O Sistema de Classificação Biofarmacêutica (BCS), baseado nas propriedades de solubilidade e permeabilidade, é uma ferramenta que surgiu na década de 1990 para auxiliar na previsão da biodisponibilidade dos fármacos. O BCS classifica o fármaco em quatro categorias, em que os fármacos de Classe I possuem alta solubilidade e permeabilidade, ao passo que os fármacos de Classe IV possuem baixa solubilidade e permeabilidade. A furosemida é classificada, de acordo com o BCS, como fármaco de Classe IV e, desta forma, é uma substância de difícil solubilização e permeação. Os estudos de dissolução in vitro, permitem avaliar o perfil de dissolução do fármaco, mediante simulação de condições fisiológicas do trato gastrintestinal (TGI), para determinar a sua cinética de liberação ou liodisponibilidade, fundamentais para a avaliação da equivalência farmacêutica entre diferentes fabricantes do mesmo medicamento. E com intuito de estimar se há veracidade no uso de excipientes padronizados para formulação do fármaco, bem como se o tamanho da cápsula influencia ou não na dissolução do fármaco, foram manipuladas cápsulas de furosemida número 2 e 4 utilizando os excipientes recomendados pelas literaturas, e posteriormente comparadas com as formulações das farmácias. Neste sentido, o presente trabalho avaliou, por meio de testes farmacopeicos in vitro que determinam a liodisponibilidade do fármaco, se as farmácias de manipulação de Manaus utilizaram os excipientes propostos pelas literaturas técnicas e científicas que garantam a dissolução da furosemida manipulada em cápsulas, bem como os parâmetros de qualidade para as formas farmacêuticas sólidas orais. Nem todas as farmácias cumpriram com os requisitos mínimos de qualidade preconizados pelas farmacopeias. Para avaliar a liberação do fármaco, foram traçados perfis de dissolução da furosemida em tampão fosfato pH 5,8. Os resultados obtidos indicaram diferenças significativas na velocidade e quantidade de furosemida liberada, e apenas 1 farmácia foi aprovada no teste de dissolução, no segundo estágio, e que a cápsula número 2 é a mais indicada. Sendo assim, foi constatado que para os fatores biofarmacêuticos da furosemida sejam melhorados, se faz necessária à adição de excipientes adequados, e que eles exercem influência substancial na velocidade de liberação do fármaco. O uso inapropriado dos seus excipientes afetam a solubilidade e permeabilidade e, por conseguinte, sua biodisponibilidade, prejudicando a resposta clínica e tratamento do paciente.

A absorção oral de um fármaco é fundamentalmente dependente da solubilidade aquosa e da permeabilidade gastrintestinal. Estes são fatores determinantes da biodisponibilidade e, consequentemente, da eficácia clínica de um medicamento. O Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB), fundamentado nas propriedades de solubilidade e permeabilidade, consolidou-se nos últimos anos como ferramenta de auxílio na predição da biodisponibilidade de fármacos e tem sido empregado no desenvolvimento de formas farmacêuticas, contendo novos fármacos ou não, bem como no registro de medicamentos genéricos. O emprego do SCB para a isenção dos estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência para algumas classes de fármacos vem sendo adotado e discutido, uma vez que os ensaios de biodisponibilidade apresentam limitações técnicas, econômicas e éticas. Assim, nos últimos anos, Agências Regulatórias têm utilizado o SCB para permitir que testes de dissolução in vitro sejam usados para estabelecer bioequivalência no caso de fármacos altamente solúveis e altamente permeáveis. O presente trabalho tem como objetivos revisar e reunir a literatura relacionada ao SCB com vistas a discutir a possibilidade de isenção dos estudos de biodisponibilidade relativa / bioequivalência para os medicamentos. Com esta proposta, foram pesquisadas as bases de dados Pubmed, Medline, Legislações Brasileiras indexadas no Visalegis e Legislação Internacional. Buscou-se a literatura pertinente publicada no período entre 1980 e o primeiro semestre de 2009. Desde a introdução do SCB existe uma relutância na aplicação das bioisenções para o registro de genéricos uma vez que as indústrias farmacêuticas não querem arriscar uma rejeição à sua solicitação nos países onde esse sistema ainda não é aceito, principalmente devido à falta de harmonização da legislação global. No Brasil, o SCB não é aceito para isenção de estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência, pois os dados de permeabilidade são escassos na literatura científica para a grande maioria dos fármacos e ainda não existem protocolos validados para os estudos de permeabilidade. Além disto, o país ainda não possui um sistema de registro e controle de qualidade de princípios ativos e excipientes, ou seja, até o momento, não há regulamentação técnica para registro de matérias-primas de produtos farmacêuticos e cosméticos, ao contrário do que existe nos Estados Unidos. Para uma melhor aplicabilidade do SCB nas bioisenções as seguintes questões devem ser destacadas: continuidade do suporte científico para assegurar bioisenções para fármacos da Classe III; suporte científico para as metodologias de determinação de permeabilidade, com o objetivo de determinar a classificação biofarmacêutica dos fármacos; discutir a aplicação da Classificação Biofarmacêutica na fase de pesquisa e desenvolvimento de novas moléculas. / The oral absorption of a drug is fundamentally dependent on the aqueous solubility and gastrointestinal permeability. Those are determinant factors of the bioavailability of a drug and of the clinical efficacy of a pharmaceutical product. The Biopharmaceutics Classification System (BCS) is based on the properties of solubility and permeability and has been developed as a tool to predict bioavailability of drugs. BCS has also been used in the development of new dosage forms, including new molecules or not, as well as in the registration of generic drugs. The use of BCS as a \"waiver\" of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for some drug classes has been discussed, since bioavailability studies represent technical, economical and ethical limitations. Therefore, in the last years the Regulatory Agencies have used BCS to allow that in vitro dissolution tests be used to establish bioequivalence in the case of highly soluble and highly permeable drugs. The present study has the objective to review the literature related to BCS, focusing in the discussion of biowaivers. The research was conducted using the following databases: Pubmed, Medline, Brazilian legislation indexed in the ANVISA website (VISALEGIS) and international legislation. The research period was between 1980 and the first semester of 2009. Since the introduction of BCS there is reluctance in the application of a biowaiver because the pharmaceutical companies do not want to risk a rejection of their biowaiver request in the countries where this system has not been established yet and also due to the lack of global legislation harmonization. In Brazil the BCS is not accepted for waiving bioequivalence studies, since permeability data are not very common in the scientific literature, for the great majority of drugs. Besides, the country does not have a regulatory framework for the registration of active pharmaceutical ingredients and raw materials, as it happens in the United States. In order to give a better applicability of BCS in biowaiver requests, the following questions must be pointed out: continuity of scientific support to assure biowaivers for Class III drugs; scientific support for permeability methodologies determination; discuss the applicability of BCS in early development phase studies for new molecular entities.

Orientador: Anselmo Gomes de Oliveira / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Thalita Pedroni Formariz Pilon / Banca: Clovis Augusto Ribeiro / Banca: Francisco Benedito Teixeira Pessine / Resumo: 2-(2-nitrovinil)furano (G-0) apresenta atividade antiprotozoária, antibacteriana e antifúngica frente a elevado número de patógenos porém, a capacidade de sublimação, baixa velocidade de dissolução em meio aquoso, problemas de compatibilidade com excipientes e fotodegradação, tem limitado sua incorporação em formas farmacêuticas para uso humano e/ou veterinário. O propósito do presente trabalho foi avaliar duas alternativas para a estabilização do candidato a fármaco, através da formação de complexos de inclusão liofilizados (FD) com hidroxipropil-β-ciclodextrina e sulfobutiléter-β-ciclodextrina sódica e utilizando a microencapsulação com etilcelulose pelo método de emulsificação/evaporação do solvente. Uma vez formados e previamente caracterizados, os complexos foram submetidos ao ensaio de estabilidade acelerada a 40°C/75 %HR e ensaios de fotoestabilidade acelerada. A câmara de fotoestabilidade também foi utilizada para confirmar o perfil de degradação dos complexos. Os fotoprodutos foram isolados em coluna analítica e o maioritário foi caracterizado por espectroscopia de RMN. Foi avaliada também a volatilidade do G-0 na forma de complexos comparado com misturas físicas equivalentes através de TGA e CG-HS-FID, complementando assim um estudo desenvolvido anteriormente no modo isotérmico. As propriedades biofarmacêuticas da substância livre e na forma complexada foram estudadas em relação ao comportamento de dissolução em Fluido Vaginal Simulado e a permeação/retenção em muco... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: 2-(2-nitrovinyl)furan (G-0) has antiprotozoal, antibacterial and antifungal activity against a large number of pathogens, although the sublimation, low dissolution rate in aqueous medium, low compatibility with excipients and photodegradation, have hindered the incorporation in pharmaceutical dosage forms, to use in human and/or veterinary medicine. The aim of this work was to evaluate two alternatives for the stabilization of the drug candidate through freeze-drying inclusion complex formation (FD) with hydroxypropyl-β-cyclodextrin and sulfobutylether-β-cyclodextrin sodium salt and through microencapsulation with ethylcellulose by mean of emulsion/solvent evaporation method. Once the complexes were prepared and fully characterized previously, they were subjected to an accelerated stability study at 40°C/75 %RH, and a photostability assay under forced irradiation conditions. A photostability chamber was also used in order to confirm the degradation profile for the complexes. Photoproducts were isolated in analytical column and the main degradation product was characterized aided by NMR. Drug volatility was also evaluated when G-0 was complexed, and compared with equivalent physical mixtures through TGA and GC-HS-FID. Biopharmaceutical properties of free drug and in the complexes were studied in terms of dissolution rate in Simulated Vaginal Fluid and permeation/retention in bovine vaginal mucosa. Finally, the influence of both complexes on the "in vitro" antifungal activity a... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O cetoconazol (CTZ) é um antifúngico imidazólico de amplo espectro, administrado tipicamente pela via oral (200 ou 400 mg por dia) ou topicamente (creme 2% aplicado duas vezes ao dia). A efícácia da terapia tópica depende das características de liberação do fármaco, do veículo e da farmacocinética da substância ativa no tecido cutâneo, ou seja, de como ela se difunde através da pele. No presente trabalho, duas formulações comerciais (A e B), uma manipulada (C) e três desenvolvidas (D2:0; El: 1 e FO:2) contendo CTZ na concentração de 20 mg/g, foram estudadas quanto às características físico-químicas e quanto ao comportamento biofarmacêutico/bioequivalente tópico, através de medidas adequadas do ativo na camada do estrato córneo (EC). Uma metodologia in vivo denominada tape-stripping ou \'remoção do estrato córneo\' por fitas adesivas foi utilizada para medir a velocidade e extensão da penetração do CTZ no EC do antebraço de voluntários sadios. Um sistema bicompartimental de difusão vertical com membrana sintética (acetato de celulose) e membrana natural (pele suína) foi empregado para avaliar in vitro a taxa de liberação e a avaliação da penetração e eventual permeação do fármaco, respectivamente. Todas as amostras foram analisadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), com método previamente validado. Nos estudos in vivo, as quantidades de fármaco determinadas no EC (µg/mg) para cada tempo da aplicação foram analisadas estatisticamente empregando-se análise da variância (ANOVA) considerando dois fatores: Fator 1 = tratamento com dois níveis e Fator 2 = antebraços (esquerdo e direito). Dentre os produtos avaliados somente entre A e C houve diferença estatisticamente significativa (p < 0,05). Os ensaios de liberação, através da avaliação do fluxo de fármaco para o meio aceptor, evidenciaram agrupamento das formulações em duas categorias distintas entre si com fluxo entre 2,41, 2,16 e 2,49 µg/cm2/h compreendendo A, B e F0:2 (p = 0,171) e outra com fluxo entre 5,85, 6,28 e 7,21µg/cm2/h para C, D2:0 e E1:1 (p = 0,478) pela ANOVA com α = 0,05. A quantidade de CTZ nos estratos cutâneos da pele suína diminuiu com a profundidade, ou seja, na derme foi detectado menor quantidade de fármaco após aplicação das formulações A, B e F0:2 e não foi detectado sua presença na solução receptora. As formulações A, B e F0:2 não apresentaram um perfil de penetração cutânea na epiderme e na estatisticamente diferente ao nível de 5% (p =0,609 e p = 0,269, respectivamente). A bioequivalência foi avaliada empregando os dados obtidos nos estudos in vivo, de acordo com os critérios das razões (ASC0-240min) entre os produtos B, C e F0:2 em relação a A (considerado referência) com intervalo de confiança de 90% (IC 90%). Considerat1do o limite de 80-125%, as formulações não seriam bioequivalentes, pois existe uma grande diferença entre os produtos A e B, entre A e C, já A e F apresentam intervalo mais próximo do limite citado. Com base nesses resultados, a formulação do produto F poderia ser indicada a um possível desenvolvimento de genérico do produto A. / Ketoconazole (KTZ) is an imidazolic antifungal, of broad-spectrum, typically administered orally (200 or 400 mg per day) or topical1y (2% cream, applied twice daily). The efficacy of the topical therapy depend on the characteristics of the drug\'s release, of the vehicle and of the active substance\'s pharmacokinetic in the cutaneous tissue, in other words, on how this substance diffuses through the skin. On this paper, two commercial formulations (A and B), one manipulated (C) and three developed (D2:0; E1: 1 and F0:2) containing KTZ on the concentration of 20 mg/g, were studied in relation to the physical-chemical characteristics and to the bioavailability/bioequivalence topic behave by an adequate active layer\'s measurement of the stratum corneum (SC). The methodology in vivo called as tape stripping or \'stratum corneum remotion\' by adhesive tapes was proposed to measure the rate and KTZ penetration\'s extension in the SC of healthy volunteers\' forearm. A bicompartmental system of vertical diffusion with sintetic membrane (celullose acetate) and natural membrane (porcine skin) was used to evaluate in vitro the rate of release and the penetration evaluation and eventual drug permeation, respectively. All samples were then submitted to HPLC analysis by previously validated method. In the studies in vivo the amount of drug determined in the SC (µ/mg) for each application time was analyzed using variance\'s analysis (ANOVA) considering two factors: Factor 1 = treatment with two leveis and Factor 2 =forearm (left and right). Among the products evaluated there was only between A and C a statistical1y significant difference (p < 0,05). The assays of release, through the evaluation of the drug flow to the receptor chamber, evidenced the grouping of formulations in two categories, different among themselves, with flow among 2,41; 2,16 and 2,49 µg/cm2/h comprehending A, B and F(0:2) (p = 1,171) and other with flow among 5,85; 6,28 and 7,21µg/cm2/h and to C, D2:0 and E1:1 (p = 0,478) by ANOVA with a = 0,05. The amount of KTZ in the cutaneous stratum of porcine skin decreased with the depth, in other words, a lower value for drug was detected in the dermis after formulations\' application A, B and F0:2 and its presence was not detected in the receptor solution. Formulations A, B and F0:2 did not present a cutaneous penetration\'s profile, in the epidermis and dermis, statisticalIy different by level of 5% (p = 0,6097 e p = 0,269, respectively). Bioequivalence was evaluated using datas obtained from studies in vivo, according to criterias of reason_(ASC0-240min>) among the products B, C and F in relation to A (considered as reference) with interval of confidence of 90% (IC 90%). Considering the 80-125% limit, the formulations would not be bioequivalents, because there is a big difference among products A and B, A and C; now A and F present the nearest interval to thc quoted limito Basing on these results, the formulation of the product F could be indicated a possible generic development of product A.

O cetoconazol (CTZ) é um antifúngico imidazólico de amplo espectro, administrado tipicamente pela via oral (200 ou 400 mg por dia) ou topicamente (creme 2% aplicado duas vezes ao dia). A efícácia da terapia tópica depende das características de liberação do fármaco, do veículo e da farmacocinética da substância ativa no tecido cutâneo, ou seja, de como ela se difunde através da pele. No presente trabalho, duas formulações comerciais (A e B), uma manipulada (C) e três desenvolvidas (D2:0; El: 1 e FO:2) contendo CTZ na concentração de 20 mg/g, foram estudadas quanto às características físico-químicas e quanto ao comportamento biofarmacêutico/bioequivalente tópico, através de medidas adequadas do ativo na camada do estrato córneo (EC). Uma metodologia in vivo denominada tape-stripping ou \'remoção do estrato córneo\' por fitas adesivas foi utilizada para medir a velocidade e extensão da penetração do CTZ no EC do antebraço de voluntários sadios. Um sistema bicompartimental de difusão vertical com membrana sintética (acetato de celulose) e membrana natural (pele suína) foi empregado para avaliar in vitro a taxa de liberação e a avaliação da penetração e eventual permeação do fármaco, respectivamente. Todas as amostras foram analisadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), com método previamente validado. Nos estudos in vivo, as quantidades de fármaco determinadas no EC (µg/mg) para cada tempo da aplicação foram analisadas estatisticamente empregando-se análise da variância (ANOVA) considerando dois fatores: Fator 1 = tratamento com dois níveis e Fator 2 = antebraços (esquerdo e direito). Dentre os produtos avaliados somente entre A e C houve diferença estatisticamente significativa (p < 0,05). Os ensaios de liberação, através da avaliação do fluxo de fármaco para o meio aceptor, evidenciaram agrupamento das formulações em duas categorias distintas entre si com fluxo entre 2,41, 2,16 e 2,49 µg/cm2/h compreendendo A, B e F0:2 (p = 0,171) e outra com fluxo entre 5,85, 6,28 e 7,21µg/cm2/h para C, D2:0 e E1:1 (p = 0,478) pela ANOVA com α = 0,05. A quantidade de CTZ nos estratos cutâneos da pele suína diminuiu com a profundidade, ou seja, na derme foi detectado menor quantidade de fármaco após aplicação das formulações A, B e F0:2 e não foi detectado sua presença na solução receptora. As formulações A, B e F0:2 não apresentaram um perfil de penetração cutânea na epiderme e na estatisticamente diferente ao nível de 5% (p =0,609 e p = 0,269, respectivamente). A bioequivalência foi avaliada empregando os dados obtidos nos estudos in vivo, de acordo com os critérios das razões (ASC0-240min) entre os produtos B, C e F0:2 em relação a A (considerado referência) com intervalo de confiança de 90% (IC 90%). Considerat1do o limite de 80-125%, as formulações não seriam bioequivalentes, pois existe uma grande diferença entre os produtos A e B, entre A e C, já A e F apresentam intervalo mais próximo do limite citado. Com base nesses resultados, a formulação do produto F poderia ser indicada a um possível desenvolvimento de genérico do produto A. / Ketoconazole (KTZ) is an imidazolic antifungal, of broad-spectrum, typically administered orally (200 or 400 mg per day) or topical1y (2% cream, applied twice daily). The efficacy of the topical therapy depend on the characteristics of the drug\'s release, of the vehicle and of the active substance\'s pharmacokinetic in the cutaneous tissue, in other words, on how this substance diffuses through the skin. On this paper, two commercial formulations (A and B), one manipulated (C) and three developed (D2:0; E1: 1 and F0:2) containing KTZ on the concentration of 20 mg/g, were studied in relation to the physical-chemical characteristics and to the bioavailability/bioequivalence topic behave by an adequate active layer\'s measurement of the stratum corneum (SC). The methodology in vivo called as tape stripping or \'stratum corneum remotion\' by adhesive tapes was proposed to measure the rate and KTZ penetration\'s extension in the SC of healthy volunteers\' forearm. A bicompartmental system of vertical diffusion with sintetic membrane (celullose acetate) and natural membrane (porcine skin) was used to evaluate in vitro the rate of release and the penetration evaluation and eventual drug permeation, respectively. All samples were then submitted to HPLC analysis by previously validated method. In the studies in vivo the amount of drug determined in the SC (µ/mg) for each application time was analyzed using variance\'s analysis (ANOVA) considering two factors: Factor 1 = treatment with two leveis and Factor 2 =forearm (left and right). Among the products evaluated there was only between A and C a statistical1y significant difference (p < 0,05). The assays of release, through the evaluation of the drug flow to the receptor chamber, evidenced the grouping of formulations in two categories, different among themselves, with flow among 2,41; 2,16 and 2,49 µg/cm2/h comprehending A, B and F(0:2) (p = 1,171) and other with flow among 5,85; 6,28 and 7,21µg/cm2/h and to C, D2:0 and E1:1 (p = 0,478) by ANOVA with a = 0,05. The amount of KTZ in the cutaneous stratum of porcine skin decreased with the depth, in other words, a lower value for drug was detected in the dermis after formulations\' application A, B and F0:2 and its presence was not detected in the receptor solution. Formulations A, B and F0:2 did not present a cutaneous penetration\'s profile, in the epidermis and dermis, statisticalIy different by level of 5% (p = 0,6097 e p = 0,269, respectively). Bioequivalence was evaluated using datas obtained from studies in vivo, according to criterias of reason_(ASC0-240min>) among the products B, C and F in relation to A (considered as reference) with interval of confidence of 90% (IC 90%). Considering the 80-125% limit, the formulations would not be bioequivalents, because there is a big difference among products A and B, A and C; now A and F present the nearest interval to thc quoted limito Basing on these results, the formulation of the product F could be indicated a possible generic development of product A.