Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T15:24:58Z No. of bitstreams: 2 TESE Manuela de Souza.pdf: 8389907 bytes, checksum: 5002b2436d9b695b176799e52ad52b6a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T15:24:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Manuela de Souza.pdf: 8389907 bytes, checksum: 5002b2436d9b695b176799e52ad52b6a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-04-19 / FACEPE / Doenças neuropsiquiátricas afetam cerca de 450 milhões de pessoas em todo mundo e dentre estas patologias os Transtornos do Humor (TH) e Doença de Alzheimer (DA) são as mais comuns. Em relação à sua etiologia as doenças neuropsiquiátricas são resultados de variações em um grupo de genes e de fatores ambientais. Pesquisas recentes vêm mostrando associação positiva entre variações genéticas em genes envolvidos nos sistemas de neurotransmissores com o desenvolvimento de doenças neuropsiquiátricas. Por isso, os estudos sobre polimorfismos genéticos, nas doenças psiquiátricas são de grande importância para a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos e podem auxiliar no diagnóstico das mesmas. Neste cenário, mutações encontradas no DNA têm sido amplamente estudadas, a fim de elucidar aspectos genéticos relacionados às neuropatologias. Os polimorfismos do tipo SNPs (Polimorfismo de Base Única) e INDELs (inserções e deleções de fragmentos de DNA) têm se destacado devido as fortes associações com os TH e DA. Diversos métodos de biologia molecular têm sido utilizados para detectar estes tipos de polimorfismos, os experimentos moleculares geram grande quantidade de dados a serem analisados, fazendo-se necessário a utilização de ferramentas computacionais para se extrair informações a partir desses dados gerados. Assim, o objetivo desse estudo foi o uso de bioinformática e de genotipagem em larga escala na busca de novos polimorfismos genético em TH e aplicação de ferramentas computacionais em banco de dados de GWAS referente à DA. Para obter os resultados referentes à TH optamos por utilizar o software CLCbio Workbench®, sequenciamento automatizado mega Bace 1000 e experimentos preliminares da técnica de DNA pooling. Já para a DA, utilizamos o teste de associação e método de regressão linear do software PLINK e o pacote genetics da linguagem de programação R, para correlacionar os níveis da proteína βamiloide no plasma e líquido cefalorraquidiano e um total de 598.821 SNPs, ambos os dados oriundos do banco de dados ADNI (Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative). Após uma sequência de passos in silico identificamos variações anteriormente descritas e novos polimorfismos candidatos à fisiopatologia dos TH, na fase de validação dessas variações, por meio de sequenciamento, falsos positivos foram frequentemente identificados, sendo descartados após a verificação na cadeia complementar. Apenas o SNP rs14068, localizado no exon 2 do gene GABRA5 foi validado em amostras de pacientes com TH. No estudo referente à DA, 5 SNPs nas regiões dos genes TOMM40, PAMR1, TRIM9 e CCDC112 e 3 SNPs em regiões de intron atingiram associação significativa, levantando a possibilidade de estejam relacionados a fisiopatologia da DA.

Submitted by Fernanda Silva Polverari (ferpolverari@gmail.com) on 2018-05-30T18:12:26Z No. of bitstreams: 1 Tese doutorado Fernanda Polverari_versão para repositório.pdf: 3157136 bytes, checksum: 063c77919abe771187d66897c9de20a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-06-04T18:59:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 polverari_fs_dr_araiq_int.pdf: 3019599 bytes, checksum: cac87174a4589a63a284c7075604c847 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-04T18:59:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 polverari_fs_dr_araiq_int.pdf: 3019599 bytes, checksum: cac87174a4589a63a284c7075604c847 (MD5) Previous issue date: 2018-04-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A análise dos polimorfismos do DNA é a melhor ferramenta encontrada para resolução de casos de identificação humana, sendo os marcadores STRs (short tandem repeat) localizados em regiões autossômicas os principais e mais utilizados para esta finalidade. Apesar da indiscutível reprodutibilidade destes marcadores, quando são analisados em amostras degradadas podem não apresentar bons resultados, o que dificulta a resolução dos casos. Assim, há a necessidade de uma alternativa e, atualmente, a mais indicada é a utilização dos polimorfismos bialélicos. A análise do cromossomo sexual X também vem ganhando importância significativa no contexto forense, devido ao seu padrão de transmissão entre os genitores. Neste trabalho, caracterizamos as populações brasileiras do estado do Mato Grosso e do Distrito Federal pela análise de 32 polimorfismos de inserção/deleção no cromossomo X (X-InDels), tendo em vista que os dados destes polimorfismos nestas populações são ainda inéditos, e para que esses marcadores também possam no futuro auxiliar a resolução de casos forenses em nosso país. Para identificar a diversidade genética foram analisados os perfis genotípicos de 303 indivíduos não aparentados nascidos no estado do Mato Grosso e 179 indivíduos não aparentados e residentes em Brasília. Os resultados indicam que o painel dos 32 X-Indels é bastante eficiente para a sua finalidade, sendo que praticamente todos os marcadores se mostraram altamente informativos para as populações estudadas. O teste de equilíbrio de HardyWeinberg foi realizado nas amostras femininas de ambas as populações e não foram verificados desvios significativos. O painel demonstrou alta eficiência forense, confirmado pelo alto poder de discriminação para Mato Grosso (PDF=0,999999999997 e PDM=0,99999997) e para Brasília ((PDF=0,999999999998 e PDM=0,99999998), e pelo elevado poder de exclusão observado em trios: suposto pai/mãe/filha (0,999998/Mato Grosso e 0,999997/Brasília) e duos: suposto pai/filha (0,9996/Mato Grosso e 0,9995/Brasília). No estudo comparativo com outras populações, Mato Grosso e Brasília estão mais próximos ao estado de São Paulo, à três departamentos colombianos e às populações europeias. A proporção de ancestralidade confirmou a miscigenação das populações estudadas, sendo identificado uma contribuição praticamente equilibrada para europeus, africanos e nativo-americanos. Conclui-se que o conhecimento acerca dos marcadores de inserção/deleção no cromossomo X pode ser ampliado, uma vez que na literatura ainda há pouco material disponível sobre o assunto; entretanto os dados deste trabalho já demonstram seu potencial como método complementar para a análise de amostras forenses, pois foram identificados elevados valores de poder de discriminação e exclusão / The analysis of DNA polymorphisms is the best tool found for solving cases of human identification, and the Short Tandem Repeat (STR) markers used in the autosomal regions are the main and most marker used for this purpose. Despite the undeniable reproducibility of these markers, when analyzed in degraded samples they may not present good results, which makes it difficult to solve the cases. Because of this, there is a need for an alternative tool and currently the most indicated is the use of the biallelic polymorphisms. In this way, the analysis of the sex chromosome X has gained significant importance in the forensic context, due to its pattern of transmission between the parents. In this work, we characterize the Brazilian populations of the state of Mato Grosso and the Federal District by the analysis of 32 insertion/deletion polymorphisms on the X chromosome (X-InDels), considering that the data of this polymorphism in these populations are still unpublished, and for that these markers may also in the future help the resolution of forensic cases in our country. To identify the genetic diversity, the genotypic profiles of 303 unrelated individuals born in the state of Mato Grosso and 179 unrelated individuals living in Brasília were analyzed. The results shows that the 32 X-Indels panel is very efficient to its purpose, being almost all markers highly informative for the studied populations. The Hardy-Weinberg equilibrium test was performed on the female samples from both populations and no significant deviations were observed. The panel demonstrated high forensic efficiency, confirmed by the high discriminatory power for Mato Grosso (PDF= 0.9999999999997 and PDM=0.999999997) and Brasília (PDF=0.9999999999998 and PDM=0.999999998), and by the high exclusion power observed in trios: supposed father/mother/daughter (0.999998/Mato Grosso and 0,999997/Brasília) and duos: supposed father/daughter (0.9996/Mato Grosso and 0,9995/Brasília). In the comparative study with other populations, Mato Grosso and Brasília are closer to the state of São Paulo, to three departments in Colombia and to European populations. The proportion of ancestry confirmed the admixture of the populations studied, with a practically balanced contribution being identified for Europeans, Africans and American natives. We could concluded that knowledge about insertion/deletion markers on the X chromosome can be amplified, since in the literature there is still fewer available material on the subject, however the data of this work already demonstrates its potential as a complementary method for the analysis of forensic samples, since were identified high values of power of discrimination and exclusion.

Submitted by GUILHERME LUÍS PEREIRA null (guipicoia@hotmail.com) on 2017-05-22T14:29:57Z No. of bitstreams: 1 Tese_Guilherme_Luis_Pereira.pdf: 2598868 bytes, checksum: aeb7dc177e4d5e4c0f7a8c7a59a11697 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-23T17:26:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_gl_dr_jabo.pdf: 2598868 bytes, checksum: aeb7dc177e4d5e4c0f7a8c7a59a11697 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-23T17:26:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_gl_dr_jabo.pdf: 2598868 bytes, checksum: aeb7dc177e4d5e4c0f7a8c7a59a11697 (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Dentre os equinos selecionados para velocidade, a linhagem de corrida da raça Quarto de Milha se destaca pelo alto desempenho em provas de curtas distâncias, sendo considerados os mais velozes do mundo. Apesar de, no Brasil, o efetivo de animais ser relativamente menor na linhagem de corrida do que nas demais, sua importância econômica é substancial. Tendo em vista o interesse econômico e científico relacionado a esta característica atlética, poucos esforços têm sido realizados para a maior compreensão de seus mecanismos genéticos e fisiológicos. Este trabalho teve como objetivos: 1) realizar a imputação de genótipos em duas vias entre indivíduos de uma amostra populacional relativamente pequena de cavalos de corrida da raça Quarto de Milha genotipados com painéis de 54k ou de 65k, bem como avaliar a acurácia de imputação por meio de simulações; 2) realizar estudo de associação ampla do genoma (GWAS) em cavalos da linhagem de corrida da raça Quarto de Milha por meio da utilização de chips equinos de genotipagem de SNPs, visando a prospecção de regiões cromossômicas, genes e polimorfismos relacionados ao desempenho; 3) analisar exomas de equinos de corrida da raça Quarto de Milha contrastantes para Índice de Velocidade máximo (IV max) em regiões previamente associadas à característica por meio de GWAS, visando a prospecção de polimorfismos gênicos causais, ligados ou em forte desequilíbrio de ligação com o desempenho em corridas. A imputação foi realizada utilizando 116 cavalos genotipados com o arranjo de SNPs de 54k e 233 genotipados com arranjo de 65k. Nas simulações foram escolhidas amostras aleatórias para constituírem as populações imputadas e referências em dois cenários. O cenário A simulou a imputação genótipos na primeira via (65k para 54k) e o cenário B na segunda (54k para 65k). No cenário A foram considerados 113 indivíduos para a população referência e 236 para a imputada, dos quais 116 e 120 foram genotipados com os arranjos de 54k e 65k, respectivamente. No cenário B foram considerados 50 indivíduos para a população referência e 299 para a imputada, dos quais 66 e 233 foram genotipados com os arranjos de 54k e 65k, respectivamente. Com isso, após o controle de qualidade, os painéis de 54k e de 65k contaram com 7.048 e 16.940 marcadores exclusivos, respectivamente. As médias de taxa de concordância para os cenários A e B foram 0,9815 e 0,9751 e para r2 alélico foram 0,9791 e 0,9740, respectivamente. O GWAS foi realizado com base no método single step GBLUP por meio de duas abordagens: ssGWAS1, em que somente efeitos de SNPs são reestimados a cada iteração, e ssGWAS2, em que a cada iteração são reestimados efeitos de SNPs a partir de valores genético genômico (GEBVs) reestimados. Vinte e uma regiões foram encontradas explicando mais que 1% da variância genética total (gVar) da característica índice de velocidade máximo (IV max) para ssGWAS1 e doze parassGWAS2. No total mais de 40% da gVar foi explicada por estas regiões para ssGWAS1 e cerca de 30% para ssGWAS2. Entre os cromossomos que explicaram mais de 1% da variância genética, cinco foram comuns aos dois métodos (ECA 3, 10, 15, 22, 25). Foram identificados 108 genes na primeira abordagem e 59 na segunda. A partir de informações de GEBVs de cada cavalo foram formados dois grupos de animais contrastantes para desempenho em corridas (20 animais de IV max superior e 20 IV max inferior), para ser sequenciados. Foram observadas leituras de boa qualidade para toda extensão das reads sequenciadas (até 100pb) e cobertura média de 43x. Foram identificadas 1.203 variantes (1.105 SNPs e 93 InDels) em 33 regiões de interesse obtidas, anteriormente, por meio de estudo de GWAS, das quais 61,3% não estavam registradas/depositadas no banco de dados de variantes equino. Do total de polimorfismos, 29 (24 SNPs e 5 InDels) foram considerados de importância com base em três abordagens distintas e independentes: escores SIFT classificado como deletério (<0,05), grau de impacto na região consenso de cada polimorfismo, e frequências alélicas diferentes, identificadas pelo teste de Fisher (p< 0,01), entre os grupos de cavalos contrastantes para IV max. Com isso, oito genes descritos como candidatos em trabalhos anteriores (ABCG5, COL11A1, GEN1, SOCS3, MICAL1, SPTBN1, EPB41L3 e SHQ1), e oito genes candidatos novos (AKNA, ARMC2, FKBP15, LHX1, NOL10, TMEM192, ZFP37, FIG4 e HNRNPU) foram relacionados ao desempenho em corridas de cavalos da raça Quarto de Milha. Assim, os resultados obtidos neste trabalho mostraram que o desempenho em corridas na raça Quarto de Milha, dado pelo IV max, é característica quantitativa e que não há ocorrência de major genes. / Among horses selected for speed, the racing line of Quarter Horses is characterized by high performance in sprint races, with these animals being considered the fastest horses in the world. Although in Brazil the effective number of animals in the racing line is relatively smaller compared to the other lines, its economic importance is substantial. Despite economic and scientific interest in this athletic trait, few efforts have been made to better understand the genetic and physiological mechanisms underlying this trait. The objectives of this study were: 1) to perform two-step genotype imputation between individuals in a relatively small population sample of racing Quarter Horses genotyped with the 54k or 65k panel, and to evaluate the accuracy of imputation through simulations; 2) to perform genome-wide association studies (GWAS) in Quarter Horses of the racing line using equine SNP genotyping chips for prospecting chromosome regions, genes and polymorphisms related to performance; 3) analyze exomes and UTRs in regions previously associated with this trait by GWAS in Quarter Horse racehorses with contrasting maximum speed index (SImax), prospecting causal gene polymorphisms that are related to or are in strong linkage disequilibrium with racing performance. Genotypes were imputed using 116 horses genotyped with the 54k SNP array and 233 animals genotyped with the 65k array. For the simulations, random samples were chosen to compose the imputed and reference populations in two scenarios. Scenario A simulated the genotype imputation in the first step (from 65k to 54k) and scenario B in the second step (from 54k to 65k). Thus, after quality control, the 54k and 65k panels contained 7,048 and 16,940 exclusive markers, respectively. The mean concordance rate was 0.9815 and 0.9751 for scenarios A and B, and the mean allelic r2 was 0.9791 and 0.974, respectively. After imputation was performed by the single-step GBLUP method using two approaches: ssGWAS1 in which only SNP effects are recalculated at each iteration, and ssGWAS2 in which SNP effects are recalculated from genomic estimated breeding values (GEBVs) at each iteration. Twenty-one regions that explained more than 1% of the total genetic variance (gVar) in the maximum speed index were identified by ssGWAS1 and 12 by ssGWAS2. More than 40% of gVar was explained by these regions in ssGWAS1 and about 30% in ssGWAS2. Among chromosomes that explained more than 1% of genetic variance, five were common to both methods (ECA 3, 10, 15, 22, 25). A total of 108 genes were identified with the first approach and 59 with the second approach. To exome sequencing, GEBVs were used for the formation of two groups of animals with contrasting racing performance (20 animals with superior SI max and 20 with inferior SI max). Good quality data were obtained throughout the reads sequenced, with an average coverage of 43x. A total of 1,203 variants (1,105 SNPs and 93 InDels) were identified in 33 regions of interest obtained previously by GWAS; of these, 61.3% were not registered/deposited in the horse genomic variant database. Twenty-nine of the polymorphisms (24 SNPs and 5 InDels) were considered to be important based on three different and independent approaches: SIFT scores classified as deleterious (<0.05), degree of impact on the consensus region of each polymorphism, and different allele frequencies identified by Fisher’s exact test (p< 0.01) between the groups of horses with contrasting SImax. Thus, eight genes described as functional and positional candidates in previous studies (ABCG5, COL11A1, GEN1, SOCS3, MICAL1, SPTBN1, EPB41L3, and SHQ1) and eight new candidate genes (AKNA, ARMC2, FKBP15, LHX1, NOL10, TMEM192, ZFP37, FIG4, and HNRNPU), some of them with known function, were related to racing performance in Quarter Horses. Taken together, the present results show that the racing performance of Quarter Horses, given by the maximum speed index, is a quantitative trait and that no major genes exist.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os polimorfismos denominados Indels são variações de comprimento geradas por inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos em uma sequência de DNA. Estes marcadores genéticos vêm apresentando um grande potencial para fins forenses e populacionais por combinar características dos marcadores SNPs, tais como a capacidade de analisar fragmentos curtos (menores que 250pb) e baixas taxas de mutação, com a facilidade da genotipagem dos STR em uma única PCR, seguida de detecção dos fragmentos amplificados por eletroforese. Com o objetivo de avaliar a eficiência dos Indels em aplicações forenses e esclarecer os detalhes da formação de diferentes populações brasileiras através de dados genéticos, amostras populacionais de diferentes estados brasileiros foram genotipadas através de dois sistemas multiplex. O primeiro (indelplex-HID) foi otimizado para fins de Identificação Humana (HID) e inclui um grupo de 38 marcadores Indels selecionados por apresentarem altos valores de diversidade genética dentro das principais populações continentais. Já o segundo (46-AI-indels), foi selecionado para estudos de ancestralidade e é composto por um conjunto de 46 marcadores informativos de ancestralidade (AIMs). Nesse último caso, ao contrário do anterior, o sistema multiplex inclui marcadores com alta divergência nas frequências alélicas entre populações continentais. Na primeira etapa, o multiplex HID foi aplicado em uma amostra populacional do Rio de Janeiro e em uma amostra populacional dos índios Terena. Um banco de dados de frequências alélicas foi construído para essas duas amostras populacionais. Os valores das frequências alélicas foram utilizados nas comparações estatísticas e parâmetros de vínculos genéticos e forenses foram calculados. O Poder de Discriminação acumulado na população do Rio de Janeiro para os 38 loci testados foi de 0,9999999999999990 e na população dos índios Terena de 0,9999999999997, validando o uso desse sistema numa população heterogênea como a brasileira. A eficiência do indelplex-HID também mostrou-se elevada nas amostras de casos forenses comprometidas, apresentando melhor resultados que marcadores STR em termos de número de loci genotipados e de qualidade de amplificação. Na segunda etapa, o multiplex 46-AI-indels foi aplicado com objetivo de avaliar a ancestralidade em amostras de diferentes estados do Brasil por permitir a identificação de diferenças entre frequências alélicas de grupos populacionais separados geograficamente. A maioria das populações analisadas apresentou elevada herança européia. As populações do Rio de Janeiro, Pernambuco, Mato Grosso do Sul, Amazonas, Alagoas, Minas Gerais e São Paulo apresentaram cerca de 50% de ancestralidade européia, enquanto que nas populações que formam o sul do país e o Espírito Santo este percentual girou em torno de 70%. De uma maneira geral, as contribuições ameríndias e africanas variaram um pouco de acordo com a região. As amostras de Santa Isabel do Rio Negro e dos índios Terena (amostras indicadas como ameríndio-descendentes) de fato mostraram majoritariamente ancestralidade ameríndia (>70%). Os resultados obtidos indicaram que os dados gerados a partir da tipagem dos AIMs estão em estreita concordância com os registros históricos e com outros estudos genéticos acerca da formação da população brasileira e os loci do sistema HID evidenciaram que os são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco. / Indels are length polymorphisms created by the insertion or deletion of one or more nucleotides in a DNA sequence. This type of genetic marker is potentially very useful for forensic and population genetic applications because it combines some desirable SNP features, such as the possibility of being analyzed in small fragments (less than 250bp), and low mutation rate, and in the same way as for the STRs it is easily genotyped in a single PCR followed by capillary electrophoresis detection of the amplified fragments. In order to evaluate the efficiency of Indels in forensic applications, and clarify some details on the formation of different Brazilian populations through genetic data, population samples from different Brazilian States were genotyped through two Indel multiplex systems. The first (Indelplex-HID) has been optimized for Human Identification (HID), and includes a group of 38 Indel markers selected by presenting similarly high values of genetic diversity within the main continental populations. The second (46-AI-indels) was selected for studies of ancestry, and it is composed by a set of 46 ancestry informative markers (AIMs). The latter, unlike the first one, includes markers with high divergence in allele frequencies among populations. In a first stage, the multiplex HID was used to study a population sample of Rio de Janeiro and a population sample of Terena Amerindians. Allele frequency databases were built for these two population samples. Allele frequency values were used in statistical comparisons, and to calculate relevant kinship and identification parameters. The cumulative discrimination power for the 38 loci in the population from Rio de Janeiro was 0.9999999999999990, and for the Terena Indians it was 0.9999999999997, demonstrating the utility of this system in a heterogeneous population like the Brazilian. The effectiveness of the indelplex-HID was also revealed to be high in low template samples that have been analyzed, which were previously selected from forensic cases, showing better results than STR markers in terms of number of genotyped loci and amplification quality. In the second stage, the multiplex 46-AI-indels was used to assess the ancestry makeup of different States of Brazil, since it allows the identification of differences among allele frequencies in geographically separated population groups. Most of the populations analyzed showed high European heritage. The populations from Rio de Janeiro, Pernambuco, Mato Grosso do Sul, Manaus, Alagoas, Minas Gerais and São Paulo presented about 50% European ancestry, while in Espirito Santo and south of Brazil the frequency of European ancestry was about 70%. In General, the Amerindian and African contributions varied somewhat according to the region. Santa Isabel do Rio Negro and Terena (indicated as Ameridians-descendants) in fact showed mostly Amerindian ancestry (>70%). The results of AIMs typing are in close agreement with the historical records and other genetic studies on the formation of Brazilian population. The loci of the HID system were highly informative, and constitute an important tool in human identification and kinship studies.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os polimorfismos denominados Indels são variações de comprimento geradas por inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos em uma sequência de DNA. Estes marcadores genéticos vêm apresentando um grande potencial para fins forenses e populacionais por combinar características dos marcadores SNPs, tais como a capacidade de analisar fragmentos curtos (menores que 250pb) e baixas taxas de mutação, com a facilidade da genotipagem dos STR em uma única PCR, seguida de detecção dos fragmentos amplificados por eletroforese. Com o objetivo de avaliar a eficiência dos Indels em aplicações forenses e esclarecer os detalhes da formação de diferentes populações brasileiras através de dados genéticos, amostras populacionais de diferentes estados brasileiros foram genotipadas através de dois sistemas multiplex. O primeiro (indelplex-HID) foi otimizado para fins de Identificação Humana (HID) e inclui um grupo de 38 marcadores Indels selecionados por apresentarem altos valores de diversidade genética dentro das principais populações continentais. Já o segundo (46-AI-indels), foi selecionado para estudos de ancestralidade e é composto por um conjunto de 46 marcadores informativos de ancestralidade (AIMs). Nesse último caso, ao contrário do anterior, o sistema multiplex inclui marcadores com alta divergência nas frequências alélicas entre populações continentais. Na primeira etapa, o multiplex HID foi aplicado em uma amostra populacional do Rio de Janeiro e em uma amostra populacional dos índios Terena. Um banco de dados de frequências alélicas foi construído para essas duas amostras populacionais. Os valores das frequências alélicas foram utilizados nas comparações estatísticas e parâmetros de vínculos genéticos e forenses foram calculados. O Poder de Discriminação acumulado na população do Rio de Janeiro para os 38 loci testados foi de 0,9999999999999990 e na população dos índios Terena de 0,9999999999997, validando o uso desse sistema numa população heterogênea como a brasileira. A eficiência do indelplex-HID também mostrou-se elevada nas amostras de casos forenses comprometidas, apresentando melhor resultados que marcadores STR em termos de número de loci genotipados e de qualidade de amplificação. Na segunda etapa, o multiplex 46-AI-indels foi aplicado com objetivo de avaliar a ancestralidade em amostras de diferentes estados do Brasil por permitir a identificação de diferenças entre frequências alélicas de grupos populacionais separados geograficamente. A maioria das populações analisadas apresentou elevada herança européia. As populações do Rio de Janeiro, Pernambuco, Mato Grosso do Sul, Amazonas, Alagoas, Minas Gerais e São Paulo apresentaram cerca de 50% de ancestralidade européia, enquanto que nas populações que formam o sul do país e o Espírito Santo este percentual girou em torno de 70%. De uma maneira geral, as contribuições ameríndias e africanas variaram um pouco de acordo com a região. As amostras de Santa Isabel do Rio Negro e dos índios Terena (amostras indicadas como ameríndio-descendentes) de fato mostraram majoritariamente ancestralidade ameríndia (>70%). Os resultados obtidos indicaram que os dados gerados a partir da tipagem dos AIMs estão em estreita concordância com os registros históricos e com outros estudos genéticos acerca da formação da população brasileira e os loci do sistema HID evidenciaram que os são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco. / Indels are length polymorphisms created by the insertion or deletion of one or more nucleotides in a DNA sequence. This type of genetic marker is potentially very useful for forensic and population genetic applications because it combines some desirable SNP features, such as the possibility of being analyzed in small fragments (less than 250bp), and low mutation rate, and in the same way as for the STRs it is easily genotyped in a single PCR followed by capillary electrophoresis detection of the amplified fragments. In order to evaluate the efficiency of Indels in forensic applications, and clarify some details on the formation of different Brazilian populations through genetic data, population samples from different Brazilian States were genotyped through two Indel multiplex systems. The first (Indelplex-HID) has been optimized for Human Identification (HID), and includes a group of 38 Indel markers selected by presenting similarly high values of genetic diversity within the main continental populations. The second (46-AI-indels) was selected for studies of ancestry, and it is composed by a set of 46 ancestry informative markers (AIMs). The latter, unlike the first one, includes markers with high divergence in allele frequencies among populations. In a first stage, the multiplex HID was used to study a population sample of Rio de Janeiro and a population sample of Terena Amerindians. Allele frequency databases were built for these two population samples. Allele frequency values were used in statistical comparisons, and to calculate relevant kinship and identification parameters. The cumulative discrimination power for the 38 loci in the population from Rio de Janeiro was 0.9999999999999990, and for the Terena Indians it was 0.9999999999997, demonstrating the utility of this system in a heterogeneous population like the Brazilian. The effectiveness of the indelplex-HID was also revealed to be high in low template samples that have been analyzed, which were previously selected from forensic cases, showing better results than STR markers in terms of number of genotyped loci and amplification quality. In the second stage, the multiplex 46-AI-indels was used to assess the ancestry makeup of different States of Brazil, since it allows the identification of differences among allele frequencies in geographically separated population groups. Most of the populations analyzed showed high European heritage. The populations from Rio de Janeiro, Pernambuco, Mato Grosso do Sul, Manaus, Alagoas, Minas Gerais and São Paulo presented about 50% European ancestry, while in Espirito Santo and south of Brazil the frequency of European ancestry was about 70%. In General, the Amerindian and African contributions varied somewhat according to the region. Santa Isabel do Rio Negro and Terena (indicated as Ameridians-descendants) in fact showed mostly Amerindian ancestry (>70%). The results of AIMs typing are in close agreement with the historical records and other genetic studies on the formation of Brazilian population. The loci of the HID system were highly informative, and constitute an important tool in human identification and kinship studies.

Orientador: Regina Maria Barreto Cicarelli / Resumo: Na rotina forense, há casos em que a amostra biológica se encontra degradada ou com baixa concentração de DNA, o uso exclusivo dos marcadores STRs pode gerar um resultado estatístico inconclusivo, tornando fundamental a análise de marcadores adicionais para a resolução do caso. Utilizado como método complementar, os polimorfismos de inserção e deleção (InDels) têm mostrado grande potencial para superar as limitações dos marcadores tradicionais. Adicionalmente, estudos de genética forense tem sido cada vez mais explorados no âmbito do cromossomo X, especialmente nos casos em que a análise dos autossômicos não é suficiente. Nessa perspectiva, este trabalho avaliou a utilidade de um conjunto de 32 polimorfismos de inserção/deleção do cromossomo X em amostras da população da região sudeste do Brasil. Afim de avaliar a diversidade genética destas populações, foram analisados os perfis genotípicos de 627 indivíduos sem relação genética pelo cromossomo X, residentes nos estados de Minas Gerais (90 mulheres e 116 homens), Espírito Santo (201 homens) e Rio de Janeiro (220 homens). Os resultados indicam que o painel dos 32 X-InDels é bastante eficiente para a sua finalidade, sendo que praticamente todos os marcadores se mostraram altamente informativos para as populações estudadas. O teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg foi realizado nas amostras femininas de Minas Gerais e não foram verificados desvios significativos. Em todas populações analisadas o painel demonstrou alta eficiência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the forensic routine, there are cases in which the biological sample is degraded or with a low concentration of DNA, the exclusive use of STR markers can generate an inconclusive statistical result, making the analysis of additional markers essential for the resolution of the case. Used as a complementary method, the insertion and deletion polymorphisms (InDels) have shown great potential to overcome the limitations of traditional markers. Additionally, the X chromosome has been increasing significant importance in forensic genetics studies, especially in cases where the analysis of autosomal is not enough. In this perspective, this work evaluated the usefulness of a set of 32 polymorphisms of insertion/deletion of the X chromosome in samples from the population of the southeastern region of Brazil. In order to evaluate the genetic diversity of these populations, the genotypic profiles of 627 individuals without genetic relationship were analyzed by the X chromosome, living in the states of Minas Gerais (90 females and 116 males), Espírito Santo (201 males) and Rio de Janeiro (220 males). The results indicate that the 32 X-InDels panel is enough efficient for its purpose, with practically all the markers proving to be highly informative for the studied populations. The Hardy-Weinberg equilibrium test was performed on female samples from Minas Gerais and no significant deviations were found. In all analyzed populations, the panel demonstrated high forensic efficiency, confi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os INDELs são polimorfismos de comprimento, gerados a partir de inserções e/ou deleções de um ou mais nucleotídeos. Os marcadores INDELs, que estão amplamente distribuídos pelo genoma e se caracterizam pela alta estabilidade devido à baixa taxa mutacional (10-9), podem ser analisados a partir da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A facilidade de análise e a possibilidade de construção de sistemas multiplex capazes de gerar amplicons curtos (menores que 100 pb) tornam os INDELs uma importante ferramenta para identificação humana por DNA. Para avaliar a eficiência e validar a metodologia que emprega os polimorfismos de inserção/deleção na identificação humana, utilizamos o sistema Indel-plex ID, capaz de amplificar simultaneamente 38 loci INDELs bialélicos de cromossomos autossomos. Diferentes amostras biológicas (cabelo, saliva, sangue, sêmen e urina) foram genotipadas apresentando reprodutibilidade entre todas as tipagens. A concentração mínima de DNA necessária para amplificação dos 38 loci INDELs foi de 0,5 ng. Artefatos do tipo split peaks foram observados em algumas amostras. Os produtos da PCR foram purificados em resina Sephadex proporcionando melhores condições de análise, redução de artefatos e aumento na intensidade média de fluorescência dos alelos amplificados. A eficiência do sistema Indel-plex ID na amplificação de DNA degradado foi verificada durante as análises das amostras de DNA extraídas de restos mortais (ossos e dentes). Comparativamente ao sistema Identifiler, o Indel-plex ID, se mostrou mais eficiente em termos de número de loci genotipados e qualidade de amplificação. Nas investigações de vínculos genéticos realizadas com o sistema Indel-plex ID foi possível corroborar resultados anteriores obtidos pela análise de marcadores STR. Nas análises com amostras in vivo foram obtidos valores máximos de Probabilidades de Paternidade de 99,99998%. Para casos envolvendo supostos pais falecidos, o sistema Indel-plex ID reforçou resultados obtidos com o sistema Identifiler e Minifiler. A Probabilidade de Paternidade de 99,953%, obtida com o sistema Indel-plex ID, conjugada com a Probabilidade de Paternidade de 99,957%, obtida como o sistema Minifiler, possibilitou um índice final de 99,99998%. Os resultados evidenciaram que os loci INDELs do sistema Indel-plex ID são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco / INDELs are length polymorphisms, generated from insertions and/or deletions of one or more nucleotides. The INDEL markers, which are widely distributed throughout the genome and characterized by high stability due to their low mutational rate (10-9), can be analyzed based on amplification by PCR (Polimerase Chain Reaction). This ease in being analyzed and the possibility of building multiplex systems capable of generating short amplicons (smaller than 100 pb), render INDELs an important tool for DNA-based human identification. So as to evaluate the efficiency and validate the methodology which makes use of insertion/deletion polymorphisms in human identification, we have employed the Indel-plex ID system, capable of simultaneously amplifying 38 INDEL loci of biallelic autosome chromosomes. Different biological samples (hair, saliva, blood, semen and urine) were genotyped showing reproducibility of all typing. The minimum DNA concentration for the amplification of the 38 INDEL loci is 0,5 ng. Artifacts of the split peaks type were observed in some samples. The purification of the PCRs products in Sephadex resin provided better conditions for analysis, reduction of artifacts and increased the average intensity of allele fluorescence. The efficiency of the Indel-plex ID system in the amplification of degraded DNA was verified in analysis of DNA samples extracted from mortal remains (bones and teeth). In comparison with the Identifiler system, the Indel-plex ID has proven more efficient in terms of the number of genotyped loci and amplification quality. During the investigation of genetic relations, carried out with the Indel-plex ID system, it was possible to corroborate previous results obtained through the analysis of STR markers. In investigations based on in vitro samples, maximum values of 99,99998% in Paternity Probabilities were obtained. In genetic investigations related to deceased supposed parents, the Indel-plex ID system corroborated results obtained with the Identifiler and Minifiler systems. The Paternity Probability of 99,953% obtained with the Indel-plex ID system, allied with the Paternity Probability of 99,957% obtained with the Minifiler rendered possible the final indicator of 99,99998%. The results have made evident that the INDEL loci of the Indel-plex ID system are highly informative and constitute an important tool for studies in both human identification and parenthood relations identification

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os INDELs são polimorfismos de comprimento, gerados a partir de inserções e/ou deleções de um ou mais nucleotídeos. Os marcadores INDELs, que estão amplamente distribuídos pelo genoma e se caracterizam pela alta estabilidade devido à baixa taxa mutacional (10-9), podem ser analisados a partir da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A facilidade de análise e a possibilidade de construção de sistemas multiplex capazes de gerar amplicons curtos (menores que 100 pb) tornam os INDELs uma importante ferramenta para identificação humana por DNA. Para avaliar a eficiência e validar a metodologia que emprega os polimorfismos de inserção/deleção na identificação humana, utilizamos o sistema Indel-plex ID, capaz de amplificar simultaneamente 38 loci INDELs bialélicos de cromossomos autossomos. Diferentes amostras biológicas (cabelo, saliva, sangue, sêmen e urina) foram genotipadas apresentando reprodutibilidade entre todas as tipagens. A concentração mínima de DNA necessária para amplificação dos 38 loci INDELs foi de 0,5 ng. Artefatos do tipo split peaks foram observados em algumas amostras. Os produtos da PCR foram purificados em resina Sephadex proporcionando melhores condições de análise, redução de artefatos e aumento na intensidade média de fluorescência dos alelos amplificados. A eficiência do sistema Indel-plex ID na amplificação de DNA degradado foi verificada durante as análises das amostras de DNA extraídas de restos mortais (ossos e dentes). Comparativamente ao sistema Identifiler, o Indel-plex ID, se mostrou mais eficiente em termos de número de loci genotipados e qualidade de amplificação. Nas investigações de vínculos genéticos realizadas com o sistema Indel-plex ID foi possível corroborar resultados anteriores obtidos pela análise de marcadores STR. Nas análises com amostras in vivo foram obtidos valores máximos de Probabilidades de Paternidade de 99,99998%. Para casos envolvendo supostos pais falecidos, o sistema Indel-plex ID reforçou resultados obtidos com o sistema Identifiler e Minifiler. A Probabilidade de Paternidade de 99,953%, obtida com o sistema Indel-plex ID, conjugada com a Probabilidade de Paternidade de 99,957%, obtida como o sistema Minifiler, possibilitou um índice final de 99,99998%. Os resultados evidenciaram que os loci INDELs do sistema Indel-plex ID são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco / INDELs are length polymorphisms, generated from insertions and/or deletions of one or more nucleotides. The INDEL markers, which are widely distributed throughout the genome and characterized by high stability due to their low mutational rate (10-9), can be analyzed based on amplification by PCR (Polimerase Chain Reaction). This ease in being analyzed and the possibility of building multiplex systems capable of generating short amplicons (smaller than 100 pb), render INDELs an important tool for DNA-based human identification. So as to evaluate the efficiency and validate the methodology which makes use of insertion/deletion polymorphisms in human identification, we have employed the Indel-plex ID system, capable of simultaneously amplifying 38 INDEL loci of biallelic autosome chromosomes. Different biological samples (hair, saliva, blood, semen and urine) were genotyped showing reproducibility of all typing. The minimum DNA concentration for the amplification of the 38 INDEL loci is 0,5 ng. Artifacts of the split peaks type were observed in some samples. The purification of the PCRs products in Sephadex resin provided better conditions for analysis, reduction of artifacts and increased the average intensity of allele fluorescence. The efficiency of the Indel-plex ID system in the amplification of degraded DNA was verified in analysis of DNA samples extracted from mortal remains (bones and teeth). In comparison with the Identifiler system, the Indel-plex ID has proven more efficient in terms of the number of genotyped loci and amplification quality. During the investigation of genetic relations, carried out with the Indel-plex ID system, it was possible to corroborate previous results obtained through the analysis of STR markers. In investigations based on in vitro samples, maximum values of 99,99998% in Paternity Probabilities were obtained. In genetic investigations related to deceased supposed parents, the Indel-plex ID system corroborated results obtained with the Identifiler and Minifiler systems. The Paternity Probability of 99,953% obtained with the Indel-plex ID system, allied with the Paternity Probability of 99,957% obtained with the Minifiler rendered possible the final indicator of 99,99998%. The results have made evident that the INDEL loci of the Indel-plex ID system are highly informative and constitute an important tool for studies in both human identification and parenthood relations identification

A fundamental problem in biology is the reconstruction of the relatedness of all (extant) species. Traditionally, systematists employ visually recognizable characters of organisms for classification and evolutionary analysis. Recent developments in molecular and computational biology, however, lead to a whole different perspective on how to address the problem of inferring relatedness. The discovery of molecules, carrying genetic information, and the comparison of their primary structure has, in a rather short period of time, revolutionized our understanding of the phylogenetic relationship of many organisms. These novel approaches, however, turned out to bear similar problems as previous techniques. Moreover, they created new ones. Hence, taxonomists came to realize that even with this new type of data not all problematic relationships could be unambiguously resolved. The search for complementary approaches has led to the utilization of rare genomic changes and other characters which are largely independent from the primary structure of the underlying sequence(s). These “higher order” characters are thought to be evolutionary conserved in certain lineages and largely unaffected by primary sequence data-based problems, allowing for a better resolution of the Tree of Life. The central aim of this thesis is the utilization of molecular characters of higher order in connection with their consistent and comparable extraction from a given data set. Two novel methods are presented that allow such an inference. This is complemented with the search for and analysis of known and novel molecular characteristics to study the relationships among Metazoa, both intra- as well as interspecific. The first method tackles a common problem in phylogenetic analyses: the inference of reliable data set. As part of this thesis a pipeline was created for the automated annotation of metazoan mitochondrial genomes. Data thus obtained constitutes a reliable and standardized starting point for all downstream analyses, e.g. genome rearrangement studies. The second method utilizes a subclass of gaps, namely those which define an approximate split of a given data set. The definition and inference of such split-inducing indels (splids) is based on two basic principles. First, indels at the same position, i.e. sharing the same end points in two sequences, are likely homologous. Second, independent single-residue insertions and deletions tend to occur more frequently than multi-residue indels. It is shown that trees based on splids recover most of the undisputed monophyletic groups while influence of the underlying alignment algorithm is relatively small. Mitochondrial markers are a valuable tool for the understanding of small and large scale population structure. The non-coding control region of mitochondrial DNA (mtDNA) often contains a higher amount of variability compared to genes encoding proteins and non-coding RNAs. A case study on a small scale population structure investigates the control region of the European Fire-bellied Toad in order to find highly variable parts which are of potential importance to develop informative genetic markers. A particular focus is placed on the investigation of the evolutionary dynamics of the repetitive region at an inter- and intraspecific level. This includes understanding mechanisms underlying its evolution, i.e. by exploring the impact of secondary structure on slipped strand mispairing during mtDNA replication. The 7SK RNA is a key player in the regulation of polymerase II (Pol-II) transcription, interacting with at least three known proteins: It mediates the inhibition of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) by the HEXIM1/2 proteins, thereby repressing transcript elongation by Pol-II. A highly specific interaction with LARP7 (La-Related Protein 7), on the other hand, regulates its stability. 7SK RNA is capped at its 5’ end by a highly specific methyltransferase MePCE (Methylphosphate Capping Enzyme). Employing sequence and structure similarity it is shown that the 7SK RNA as well as its protein binding partners have a much earlier evolutionary origin than previously expected. Furthermore, this study presents a good illustration of the pitfalls of using markers of higher order for phylogenetic inference.

Submitted by DANILO FAUSTINO BRAGANHOLI null (danilobraganholi@hotmail.com) on 2016-02-26T18:28:02Z No. of bitstreams: 1 TESE DOUTORADO DANILO FINAL.pdf: 5854320 bytes, checksum: 574fd8d3f97ad7193fe8490f98829058 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-29T13:48:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 braganholi_df_dr_araiq.pdf: 5854320 bytes, checksum: 574fd8d3f97ad7193fe8490f98829058 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-29T13:48:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 braganholi_df_dr_araiq.pdf: 5854320 bytes, checksum: 574fd8d3f97ad7193fe8490f98829058 (MD5) Previous issue date: 2016-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os marcadores STR são os mais utilizados na rotina de identificação humana e genética forense, entretanto, os marcadores INDELs vem chamando a atenção dos pesquisadores desta área, pois sua análise pode ser uma ferramenta interessante por serem analisados com um fragmento menor que os STR e apresentarem baixa taxa de mutação, podendo ser utilizados na identificação de indivíduos e na avaliação de ancestralidade. Neste trabalho, caracterizamos as populações brasileiras dos estados de São Paulo e Espírito Santo pela análise de marcadores INDEL através de dois sistemas: 38 HID-INDELs, verificando a eficiência forense nas duas populações e comparando os dados com os de STRs rotineiramente utilizados na população de São Paulo; e 46 AIM-INDELs, avaliando as proporções de ancestralidade nas duas populações, e comparando os dados com os de marcadores uniparentais na população do Espírito Santo. Ambos os métodos foram eficientes para suas respectivas finalidades, sendo que o sistema 38 HID-INDELs apresentou alto poder de discriminação, para Espírito Santo (PD = 0,9999999999999990) e para São Paulo (PD = 0,999999999999994); e o sistema 46 AIM-INDELs confirmou a miscigenação das populações estudadas, e neste caso, com maior ancestralidade genética de europeus, em comparação a africanos e nativo-americanos. Além disso, inserimos o marcador amelogenina no sistema multiplex 38 HID-INDELs como uma ferramenta complementar para identificação de sexo de amostras degradadas. / The STR markers are the most used in routine of human identification and forensic genetics, however, INDEL markers has attracted the attention of those researchers in this area, because their analysis can be an interesting tool to be analyzed with a smaller fragment that STR and to present low mutation rate, may be used to identify individuals and evaluating ancestry. In this work, we characterized the Brazilian populations of the states of São Paulo and Espírito Santo by INDEL markers analysis through two systems: 38 HID-INDELs, checking the forensic efficiency in this two populations and comparing the data with STRs routinely used in São Paulo population; and 46 AIM-INDELs, assessing the proportions of ancestry in this two populations, and comparing the data with uniparental markers in Espírito Santo population. Both methods were effective for their respective purposes, the 38 HID- INDELs system showed high discrimination power to Espírito Santo (PD = 0.9999999999999990) and to São Paulo (PD = 0.999999999999994); and the 46 AIM- INDELs system confirmed the mixing of the populations studied, and in this case , with greater genetic ancestry of europeans, compared to africans and native americans. In addition, we insert the amelogenin marker in the 38 HID-INDELs multiplex system as a complementary tool to identificate the sex of degraded samples.