Considerando os efeitos da radiação gama sobre proteínas e a capacidade do sistema imune de reconhecer macromoléculas modificadas, decidimos avaliar alguns aspectos imunológicos de camundongos B10.PL frente a ovalbumina e bothropstoxina–1 (BTHX-1), nas formas nativa e irradiada. Para avaliar prováveis modificações estruturais nas moléculas das proteínas após o processo de irradiação (radiação gama de 60Co), foi realizada a eletroforese em gel de poliacrilamida 15% para a ovalbumina e para a BTHX-1, nas formas nativa e irradiada. A ovalbumina também foi submetida à cromatografia de exclusão molecular, enquanto a BTHX-1 foi submetida à espectrometria de massa. Os resultados destes ensaios mostraram que a radiação gama foi capaz de promover alterações nas moléculas de ovalbumina e BTHX-1. A fim de avaliar a toxicidade da BTHX-1 irradiada em relação à nativa realizou-se um ensaio de citotoxicidade celular em células CHO. O resultado mostrou que a toxina na sua forma irradiada apresentou, aproximadamente, cinco vezes menos toxicidade do que a toxina na sua forma nativa. Com relação aos aspectos imunológicos, foram realizados ensaios de produção e identificação de anticorpos, nos quais, os animais foram imunizados com ovalbumina e BTHX-1, nas formas nativa ou irradiada. Observou-se que as proteínas nativas induziram, preferencialmente, uma resposta do tipo Th2, enquanto que as proteínas irradiadas induziram uma resposta do tipo Th1. Realizou-se um ensaio de proliferação celular para avaliar o comportamento de esplenócitos, retirados do baço de camundongos B10.PL, imunizados com ovalbumina e BTHX-1, nativas ou irradiadas, cultivados em presença de ambas as formas das proteínas. Em relação à ovalbumina, os resultados mostraram que tanto as células dos animais imunizados com a ovalbumina nativa como aquelas dos animais imunizados com a proteína na sua forma irradiada apresentaram crescimento semelhante. No caso da BTHX-1, os resultados mostraram que as células dos animais imunizados com a toxina irradiada foram capazes de reconhecer a forma nativa da toxina, pois apresentaram crescimento semelhante ao das células dos animais imunizados com a BTHX-1 nativa. / Considering the effects of gamma radiation on proteins and the capacity of the immune system to recognize modified macromolecules, we decided to evaluate some immunological aspects of B10.PL mice exposed to native or irradiated ovalbumin and bothropstoxin-1 (BthTx-1). In order to evaluate possible structural modifications of the molecules after being irradiated (60Co gamma rays), bothropstoxin-1 was analysed by electrophoresis, while ovalbumin was submitted to analytical size exclusion chromatography. The toxin was also analised by ESI-mass spectrometry. Our results indicate that radiation promoted modifications on both the molecules. Aiming to compare the toxicity of the native and irradiated forms of the toxin, an in vitro citotoxicity assay, using CHO cells, was performed. According to our results, the modified toxin was 5 folds less toxic than its native counterpart. Sera of animals immunized with the native and irradiated proteins were analyzed in order to evaluate levels of IgG, as well as to quantify specific isotypes. While the native proteins induced a predominant Th2 response, the irradiated molecules apparently promoted a switch towards a Th1 pattern. We also performed a cell proliferation assay with splenocites from mice immunized with either the native or the irradiated proteins, cultured in the presence of the antigens. Our results indicate that both the forms of the proteins induced a similar proliferative response. These data indicate a potential use of detoxified proteins as antigens for immunization.

Considerando os efeitos da radiação gama sobre proteínas e a capacidade do sistema imune de reconhecer macromoléculas modificadas, decidimos avaliar alguns aspectos imunológicos de camundongos B10.PL frente a ovalbumina e bothropstoxina–1 (BTHX-1), nas formas nativa e irradiada. Para avaliar prováveis modificações estruturais nas moléculas das proteínas após o processo de irradiação (radiação gama de 60Co), foi realizada a eletroforese em gel de poliacrilamida 15% para a ovalbumina e para a BTHX-1, nas formas nativa e irradiada. A ovalbumina também foi submetida à cromatografia de exclusão molecular, enquanto a BTHX-1 foi submetida à espectrometria de massa. Os resultados destes ensaios mostraram que a radiação gama foi capaz de promover alterações nas moléculas de ovalbumina e BTHX-1. A fim de avaliar a toxicidade da BTHX-1 irradiada em relação à nativa realizou-se um ensaio de citotoxicidade celular em células CHO. O resultado mostrou que a toxina na sua forma irradiada apresentou, aproximadamente, cinco vezes menos toxicidade do que a toxina na sua forma nativa. Com relação aos aspectos imunológicos, foram realizados ensaios de produção e identificação de anticorpos, nos quais, os animais foram imunizados com ovalbumina e BTHX-1, nas formas nativa ou irradiada. Observou-se que as proteínas nativas induziram, preferencialmente, uma resposta do tipo Th2, enquanto que as proteínas irradiadas induziram uma resposta do tipo Th1. Realizou-se um ensaio de proliferação celular para avaliar o comportamento de esplenócitos, retirados do baço de camundongos B10.PL, imunizados com ovalbumina e BTHX-1, nativas ou irradiadas, cultivados em presença de ambas as formas das proteínas. Em relação à ovalbumina, os resultados mostraram que tanto as células dos animais imunizados com a ovalbumina nativa como aquelas dos animais imunizados com a proteína na sua forma irradiada apresentaram crescimento semelhante. No caso da BTHX-1, os resultados mostraram que as células dos animais imunizados com a toxina irradiada foram capazes de reconhecer a forma nativa da toxina, pois apresentaram crescimento semelhante ao das células dos animais imunizados com a BTHX-1 nativa. / Considering the effects of gamma radiation on proteins and the capacity of the immune system to recognize modified macromolecules, we decided to evaluate some immunological aspects of B10.PL mice exposed to native or irradiated ovalbumin and bothropstoxin-1 (BthTx-1). In order to evaluate possible structural modifications of the molecules after being irradiated (60Co gamma rays), bothropstoxin-1 was analysed by electrophoresis, while ovalbumin was submitted to analytical size exclusion chromatography. The toxin was also analised by ESI-mass spectrometry. Our results indicate that radiation promoted modifications on both the molecules. Aiming to compare the toxicity of the native and irradiated forms of the toxin, an in vitro citotoxicity assay, using CHO cells, was performed. According to our results, the modified toxin was 5 folds less toxic than its native counterpart. Sera of animals immunized with the native and irradiated proteins were analyzed in order to evaluate levels of IgG, as well as to quantify specific isotypes. While the native proteins induced a predominant Th2 response, the irradiated molecules apparently promoted a switch towards a Th1 pattern. We also performed a cell proliferation assay with splenocites from mice immunized with either the native or the irradiated proteins, cultured in the presence of the antigens. Our results indicate that both the forms of the proteins induced a similar proliferative response. These data indicate a potential use of detoxified proteins as antigens for immunization.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Recombinant proteins from Toxoplasma gondii have been used in several experimental models, as well as for serodiagnosis of human toxoplasmosis, particularly to differentiate acute from chronic phases of the infection. In the present study, we evaluated the kinetics of IgM, IgA, and IgG isotypes, in addition to IgG1 and IgG3 subclasses, by testing sequential serum samples from patients with acute toxoplasmosis. It was carried out immunoassays by using SAG2A recombinant antigen and soluble antigen of Toxoplasma (STAg). The avidity of IgG1 antibody was assessed using slot blot assay. Additionally, a ratio between IgG1 and IgG3 subclasses (IgG3:IgG1) was determined and evaluated its degree of association with levels of IgM and IgA specific for STAg and the avidity index of IgG1 specific for SAG2A. The results showed a decreasing kinetic profile for SAG2A and STAg for IgM and IgA. The kinetic profile for the IgG antibody was increasing for both antigens. Compared to the avidity for IgG1, it was observed that sera from an early stage showed a low average avidity of IgG1 for SAG2A while the same samples showed intermediate mean avidity of IgG1 when STAg was used as antigen. In a later phase, the average avidity observed was high for STAg and intermediate for SAG2A in the same tested sera suggesting that SAG2A may be a promising tool for the detection of avidity. Associations between IgG3/IgG1 and specific IgM and IgA levels for STAg and the avidity index of specific IgG1 for SAG2A were found, and together these parameters could be used as valuable tools in the diagnosis of human toxoplasmosis, especially in situations when the determination of different phases is critical. / Proteínas recombinantes de Toxoplasma gondii têm sido utilizadas em diversos modelos experimentais, assim como para o diagnóstico sorológico da infecção humana por este parasito, principalmente com o intuito de diferenciar as fases aguda e crônica da toxoplasmose. Neste estudo, foi avaliada a cinética dos anticorpos IgM, IgA ,IgG e subclasses (IgG1 e IgG3) através de imunoensaios realizados em amostras seqüenciais de soros humanos, provenientes de pacientes com toxoplasmose aguda. Estas amostras foram testadas frennte ao antígeno recombinante SAG2A, utilizando-se como paradigma de comparação o antígeno solúvel total de Toxoplasma (STAg). A avidez do anticorpo IgG1 foi avaliada utilizando a metodologia slot-blot. Adicionalmente, a razão entre as subclasses IgG3 e IgG1 (IgG3:IgG1) foi determinada e avaliada quanto ao grau de associação com os níveis de IgM e IgA específicos para STAg e aos índices avidez de IgG1 específicos para SAG2A. Os resultados demonstraram a presença de níveis decrescentes de IgM e IgA para ambos os antígenos utilizados, enquanto que para o isotipo IgG o perfil cinético demonstrou níveis crescentes para ambas preparações antígênicas. Em relação aos índices de avidez para IgG1, foi observado que amostras de soros de uma fase inicial apresentaram baixa avidez média de anticorpos IgG1 dirigidos para SAG2A, enquanto que as mesmas amostras demonstraram avidez média intermediária de IgG1 quando STAg foi utilizado como antígeno. Já em uma fase mais tardia, a avidez média observada foi alta para STAg e intermediária com SAG2A. A razão entre IgG3:IgG1 obtida no primeiro bimestre foi significantemente maior para SAG2A em comparação com STAg. Tomados em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo indicam que a proteína recombinantes SAG2A pode se constituir em uma ferramenta efetiva na diferenciação das fases da infecção humana por T. gondii. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas