La fluorescence d'une molécule est sensible à son environnement électromagnétique. La présence d'une structure métallique modifie l'excitation et l'émission des fluorophores, par le jeu d'interférences et de couplages avec les plasmons de surface. Nous avons élaboré et caractérisé des films métalliques de différentes morphologies (films de nanoparticules, percolés, continus, plans, rugueux. . .). Leur influence sur la réponse optique<br />des fluorophores a été étudiée par la modélisation puis l'expérience, en fonction de la distance fluorophore-métal et de l'orientation moléculaire. Une amplification d'un à deux ordres de grandeur du signal détecté est observée, ainsi qu'une photostabilisation des fluorophores et une modification des transferts d'énergie intermoléculaires. Nous<br />démontrons l'intérêt de cette technologie pour améliorer la sensibilité dans les puces à ADN et pour l'imagerie des cellules et des tissus.

Les microscopies optiques super-résolues aident à mieux comprendre certains mécanismes biomoléculaires, notamment au sein des neurones. Nous avons construit un tel microscope de type STED (STimulated Emission Depletion) pour observer des défauts azote-lacune (NV) fluorescents dans le diamant, et avons atteint une résolution de 50 nm. À plus long terme, cet instrument permettra d'étudier l'organisation macromoléculaire de protéines impliquées dans la plasticité synaptique, et marquées avec des nanodiamants (ND) fluorescents. Dans cette perspective, nous avons étudié la limite de résolution du STED pour des ND de tailles sub-longueur d'onde. Nos expériences, menées avec l'équipe de Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) ont montré que la taille du spot STED d'un NV dans un ND pouvait atteindre 10 nm, performance similaire à celle obtenue dans un diamant macroscopique. Nous pouvons aussi résoudre plusieurs centres NV dans un ND séparés de seulement ~15 nm. Ces résultats sont en accord avec les simulations numériques faites par l'équipe de Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). En parallèle, nous avons démontré l'internalisation spontanée de ND fluorescents dans des neurones corticaux d'embryons de souris en culture primaire, et étudié leur colocalisation avec des vésicules du réseau trans-Golgi. Enfin, nous avons débuté l'étude du trafic des vésicules contenant les ND et montré qu'il dépend du réseau de microtubules. Les paramètres du mouvement sont compatibles avec ceux des moteurs moléculaires, mais nous nous attendons à ce qu'ils soient différents dans le cas de la surexpression de protéines impliquées dans le trafic (travail en cours).

L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est un enjeu majeur de santé publique. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est de plus en plus utilisée pour la prise en charge en urgence des patients, afin de sélectionner les patients candidats aux thérapies de reperfusion, seul traitement approuvé à ce jour. La découverte de nouvelles thérapeutiques constitue donc un véritable enjeu pour protéger le cerveau à la suite d’un AVCi. La piste des thérapeutiques anti-inflammatoires est particulièrement intéressante. En effet, il a été démontré que dans l’AVCi, l’inflammation cérébrale serait à l’origine d’une aggravation de la lésion ischémique. Il est maintenant admis que les cellules du système monocluée phagocytaire ont un rôle prédominant dans la cette réaction inflammatoire, contribuant dans certains cas aux dommages tissulaires. Plus récemment, il a également été démontré que les plexus choroïdes joueraient un rôle important dans le recrutement de cellules immunitaires au niveau de la lésion ischémique. Pour améliorer la compréhension de l’implication des cellules phagocytaires dans l’AVCi et dans les pathologies neuroinflammatoires en général, l’imagerie in vivo est un outil translationnel précieux. Au sein de notre équipe, la méthode non invasive d’IRM couplée à l’injection intraveineuse de nanoparticules d’oxyde de fer, les USPIOs, a été mise au point. Cette technique permet d’imager les cellules phagocytaires présentes au niveau de la lésion ischémique, suite à leur internalisation des USPIOs. Dans ce contexte, ma thèse s’est articulée autour des deux axes suivants : 1) Evaluer le potentiel d’une nouvelle nanoparticule multimodale, la « NanoGd », pour imager les cellules phagocytaires présentes au niveau de la lésion ischémique. Un protocole expérimental précis a été mis en place dans un modèle d’occlusion permanente de l’artère cérébrale moyenne chez la souris transgénique CX3CR1-GFP. L’originalité de notre étude repose sur le fait que ces souris ont été imagées in vivo avec des sessions d’IRM combinées à des sessions de microscopie biphotonique intravitale, nous permettant d’obtenir de précieuses informations sur les origines biologiques des signaux visualisés avec l’IRM. Nos résultats indiquent que l’imagerie multimodale de la NanoGd permettent d’imager in vivo les cellules phagocytaires à la suite d’un AVCi. 2) Evaluer le potentiel de notre technique d’IRM couplée à l’injection intraveineuse d’USPIOs comme outil pour imager in vivo l’implication des plexus choroïdes dans des phénomènes inflammatoires précoces. Pour cela, nous avons travaillé avec un modèle murin de neuroinflammation induite par injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide. La présence des USPIOs au niveau des plexus choroïdes a été quantifiée sur les images IRM à l’aide d’un système de scoring multi-opérateurs, et comparée entre le groupe de souris LPS et le groupe contrôle. Nous avons montré que l’IRM couplée à l’injection iv d’USPIOs permettait de mettre en évidence in vivo les phénomènes inflammatoires à l’intérieur des plexus choroïdes. Cette étude sur l’imagerie in vivo de l’inflammation dans les plexus choroïdes fait suite à la rédaction d’une revue sur l’imagerie clinique des plexus choroïdes en conditions physiologiques et pathologiques. Nous avons montré que les plexus choroïdes sont impliqués de nombreuses manières dans le maintien de l’homéostasie cérébrale, et que bien qu’il s’agisse d’un domaine en pleine expansion, l’imagerie clinique de ces structures est encore largement insuffisante. Ce travail de thèse a donc permis de mettre au point et de valider deux approches d’imagerie in vivo pour l’étude de l’inflammation cérébrale, dans l’AVCi et les pathologies avec une composante neuroinflammatoire, et l’utilisation de ces méthodes dans des modèles souris de neuroinflammation a d’ores et déjà permis d’améliorer la compréhension des mécanismes inflammatoires dans ces pathologies / Stroke is a major public health issue. Magnetic resonance imaging (MRI) is increasingly used for the emergency management of these patients, during the interruption of blood flow to better select patients who are candidates for reperfusion therapies, the only treatment approved to date. The discovery of new therapeutics is therefore a real challenge to protect the brain following a stroke. Among the different lines of research, anti-inflammatory therapeutics are particularly interesting. Indeed, cerebral ischemia causes an inflammatory reaction and it has been shown that the runaway of this reaction would cause an aggravation of the cerebral lesions. Although the establishment of this inflammatory reaction is still to be characterized more precisely, significant progress has been made in this area. It is now recognized that cells of the phagocytic monoclonal system play a predominant role in the establishment and maintenance of this inflammatory response, contributing in some cases to tissue damage. More recently, it has also been shown that choroid plexuses play an important role in the recruitment of immune cells to the level of ischemic injury, including circulating monocytes/macrophages. To improve our understanding of phagocytic cells involvement in ischemic stroke and neuroinflammatory pathologies in general, in vivo imaging is a promising translational tool. In our team, the non-invasive MRI method coupled with the intravenous injection of iron oxide nanoparticles, the USPIOs, has been developed and validated through pre-clinical and clinical studies. This technique enables to image the phagocytic cells present at the level of the ischemic lesion, following their internalization of the USPIOs.In this context, my thesis was articulated around the following two axes:1) Evaluate the potential of a new multimodal nanoparticle composed with gadolinium fluoride, the "NanoGd", to image phagocytic cells present in the ischemic lesion. A precise experimental protocol was implemented in a model of permanent occlusion of the middle cerebral artery in CX3CR1-GFP transgenic mouse. The originality of our study rests on the fact that these mice were imaged in vivo with MRI sessions back-to-back with intravital two-photon microscopy sessions, allowing us to obtain valuable information on the biological origins of the signals visualized with the MRI. Our results indicate that multimodal imaging of NanoGd can be used to image phagocytic cells in vivo following ischemic stroke. 2) Evaluate the potential of USPIO-enhanced MRI as a tool to image in vivo the involvement of choroid plexuses in early inflammatory phenomena. For this, we worked with a mouse model of neuroinflammation induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide. The presence of USPIOs at the level of the choroid plexuses was quantified on the MRI images using a multi-operator scoring system and compared between the LPS mouse group and the control group. We have shown with our study that the MRI coupled with the iv injection of USPIOs allowed to highlight in vivo the inflammatory phenomena inside the choroid plexuses. This study on in vivo imaging of inflammation in choroid plexuses followed the writing of a review about the clinical imaging of choroid plexuses in physiological and pathological conditions. In this study, we have shown that choroid plexuses are involved in many ways in maintaining cerebral homeostasis, and that although this is a rapidly expanding field, the clinical imaging of these structures is still largely insufficient. This work has allowed to develop and validate two in vivo imaging approaches for the study of brain inflammation, in stroke and pathologies with a neuroinflammatory component, and the use of these methods in mouse models of neuroinflammation has already made it possible to improve the understanding of inflammatory mechanisms in these pathologies

Les protéines alpha-synucléine (αsyn) et « Leucine-Rich Repeat Kinase 2 » (LRRK2), jouent toutes deux un rôle majeur dans la physiopathologie des formes sporadiques et génétiques de la maladie de Parkinson (MP). En particulier, la mutation G2019S de LRRK2, située dans son domaine kinase, est la cause la plus fréquente de formes génétiques de la MP. Il a été suggéré que l’αsyn et LRRK2 agiraient de concert pour induire la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) dans cette maladie. Dans notre laboratoire, il a été montré qu’en effet LRRK2 G2019S pouvait potentialiser la mort des neurones dopaminergiques induite par l’αsyn dans la SNpc de rats, confirmant l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les deux protéines. De plus, il est connu depuis plusieurs années que les dysfonctionnements mitochondriaux joueraient un rôle central dans la MP. De nombreuses études ont montré que les deux protéines individuellement pouvaient entraîner des dysfonctionnements de cet organite. Notre hypothèse est donc que l’interaction fonctionnelle entre l’αsyn et LRRK2 pourrait passer par une action commune sur la mitochondrie. Nous avons ainsi pu montrer in vitro, dans des cultures primaires de neurones de rat surexprimant l’αsyn et LRRK2, que LRRK2 G2019S, mais pas sa forme sauvage (WT) ni sa forme sans activité kinase (DK, Dead Kinase) augmentait significativement le nombre de neurones présentant un marquage pathologique de l’αsyn (phospho-S129), sans induire de mort cellulaire. Au niveau cellulaire et moléculaire, une diminution significative du taux de production d’ATP mitochondrial a été mise en évidence dans les cellules co-exprimant LRRK2 (WT, G2019S, et encore plus DK) avec l’αsyn par rapport à celles exprimant l’αsyn seule, ceci sans différence dans la quantité totale d’ATP. Les mitochondries des neurones co-exprimant LRRK2 et l’αsyn parcouraient également de plus longues distances le long des neurites que celles des neurones exprimant uniquement l’αsyn. Pour résumer, dans ce modèle in vitro, LRRK2 augmente donc l’accumulation somatique d’une forme pathologique de l’αsyn, d’une manière dépendante de son activité kinase. Dans ces conditions, les mitochondries sont capables de maintenir leur homéostasie, notamment en adaptant leur production d’ATP. Cela semble indiquer l’existence d’un stress mitochondrial modéré, induit par la co-expression de l’αsyn et de LRRK2. / The proteins alpha-synuclein (αsyn) and Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) both play major roles in the physiopathology of sporadic and genetic forms of Parkinson’s Disease (PD). In particular, the G2019S mutation of LRRK2, located in its kinase domain, is the most prevalent cause of genetic forms of PD. It has been suggested that αsyn and LRRK2 could act together to induce the selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the pathogenesis of this disease. In our laboratory, it has been shown that G2019S LRRK2 could increase the dopaminergic cell loss induced by αsyn in the SNpc of rats, confirming the existence of a functional interaction between the two proteins. Moreover, it has been known for years that mitochondrial dysfunction played a major role in PD. Many studies showed that both LRRK2 and αsyn induced mitochondrial dysfunction. Therefore, we hypothesized that the functional interaction between αsyn and LRRK2 could take place through a common effect on mitochondria. We showed in vitro, in primary rat neurons, that G2019S LRRK2, but not the wild type (WT) form nor the dead kinase mutant (DK), significantly increased the number of neurons expressing a pathological form of αsyn (phospho-S129). This was not associated with any cell loss. At the cellular and molecular levels, there was a significant decrease in the mitochondrial ATP production rate in cells co-expressing LRRK2 (WT, G2019S and even more pronounced with DK) with αsyn, without any change in total ATP levels. The mean distance travelled by mitochondria along neurites was higher in neurons co-expressing αsyn and LRRK2 than in neurons only expressing αsyn. To summarize, in this in vitro model LRRK2 increases the somatic accumulation of a pathologic form of αsyn, in a kinase-dependent manner. In these conditions, mitochondria are able to maintain their homeostasis, in particular by adapting their ATP production rate. This seems to indicate a moderate mitochondrial stress induced by the co-expression of αsyn and LRRK2.

La microscopie par diffusion Raman Coh´erente Anti-Stokes (CARS) est une<br />m´ethode r´ecente d'imagerie dont le contraste provient de l'excitation r´eso-<br />nante s´elective de vibrations mol´eculaires intrins`eques d'une liaison ou d'un<br />ensemble de liaisons chimiques. Cette technique pr´esente l'avantage de s'af-<br />franchir de tout marqueur fluorescent qui peut ˆetre toxique pour un orga-<br />nisme biologique vivant. Elle permet aussi d'avoir une tr`es grande sensibilit´e<br />et une forte r´esolution spatiale, comparable `a celle de la microscopie confo-<br />cale. Le travail de cette th`ese concerne la r´ealisation d'un microscope CARS,<br />et sa mise en application `a diff´erents domaine de l'imagerie bio-m´edicale. Des<br />´etudes ont ´et´e men´ees d´emontrant les potentialit´es de cet outil, ainsi que sa<br />caract´erisation dans le domaine spatiale et spectral.

Dans cette thèse, nous avons construit et optimisé des méthodes de microscopie de fluorescence super-résolue stochastique, polarisée et quantitative qui nous permettent d'imager l'orientation moléculaire dans des environnements dynamiques et statiques a l’échelle de la molécule unique et avec une résolution nanoscopique. En utilisant un montage de microscopie super-résolue à lecture stochastique en combinaison avec une détection polarisée, nous avons pu reconstruire des images d'anisotropie de fluorescence avec une résolution spatiale de 40 nm. En particulier, nous avons pu imager l'ordre orientationnel d'assemblages biomoléculaires et cellulaires. Pour l'imagerie cellulaire, nous avons pu étudier la capacité d'étiquettes de marquer fluorophoresde reporter quantifier l'orientation moléculaire dans l'actine et les microtubules dans des cellules fixées. Nous avons également mis à profit la meilleure résolution et la détection polarisée pour étudier l'ordre moléculaire d’agrégats d’amyloïdes a l’échelle nanoscopique. Enfin, nous avons étudié l'interaction de la protéine de réparation RAD51 avec l'ADN par microscopie de fluorescence polarisée super-résolue pour quantifier l'ordre orientationnel de l'ADN et de la protéine RAD51 afin de comprendre la recombinaison homologue du mécanisme de réparation de l'ADN. / .In this thesis we built and optimized quantitative polarized stochastic super-resolution fluorescence microscopy techniques that enabled us to image molecular orientation behaviors in static and dynamic environments at single molecule level and with nano-scale resolution. Using a scheme of stochastic read-out super resolution microscopy in combination with polarized detection, we can reconstruct fluorescence anisotropy images at a spatial resolution of 40 nm. In particular, we have been able to use the techniques to quantify the molecular orientationalorder in cellular and bio-molecular assemblies. For cellular imaging, we could quantify the ability of fluorophore labels to report molecular orientation of actin and microtubules in fixed cells. Furthermore, we used the improvements of resolution and polarization detection to study molecular order of amyloid aggregates at a nanoscopic scale. Also, we studied repair protein RAD51` s interaction with DNA by using dual color polarized fluorescence microscopy, to quantify the orientational order of DNA and RAD51 to understand the homologous recombination of DNA repair mechanism.

La première partie de ce travail est réalisé dans le but de préparer des produits pouvant jouer un rôle très important de l’imagerie cellulaire des lipopolysaccharides sur la surface des cellules bactériennes, tout en utilisant des méthodes fiables telle que la ‘’chimie click’’. Dans un premier temps, nous avons synthétisé une première génération d’outils fluorescents à base de rhodamine B et fluorescéine modifiée par une fonction oxyde de nitrile. Dans un deuxième temps nous avons cherché les meilleures conditions d’applications de la chimie click 3+2 sans cuivre, entre la fonction oxyde de nitrile et le motif saccharidique complémentaire portant une fonction vinylique. Finalement, nous avons appliquée, avec succès, la méthode click avec cuivre sur plusieurs types de bactéries portant sur leur membrane cellulaire des lipopolysaccharides ayant un motif ‘’Kdo’’ fonctionnalisé par un groupement azoture déjà synthétiser au sein de notre équipe, et une sonde fluorescente porteuse d’une fonction alcyne. Une nouvelle génération d’outils de marquage saccharidique est en cours de finalisation dans le but d’optimiser les conditions finales, tel que le dérivé de ‘’Kdo’’ fonctionnalisé cette fois-ci par des dérivées cycliques, bicycliques et aromatiques porteurs d’une fonction alcyne ou alcène, pour réaliser les derniers essais de marquage in vitro. Le stress oxydant est lié au vieillissement des cellules et à de nombreuses maladies: cardiovasculaire, cancer, diabète, Alzheimer… Il est dû à un déséquilibre entre le système oxydant / antioxydant au niveau des cellules, et se caractérise par la présence principalement de substance radicalaires réactives oxygénées. Dans le but d'identifier le taux de substances réactives oxygénées dans les cellules, le travail dans la deuxième partie de la thèse reposait sur la synthèse multi étape d'une molécule fluorescente dérivée de la coumarine. Le composé ciblé est le peroxyde d'oxygène, connu sous le nom d'eau oxygénée. Possédant un ester vinyl-boronique, notre molécule sera oxydée et réarrangée en aldéhyde conduisant à la condensation intramoléculaire avec le groupement aminé adjacent pour former un cycle indolique, libérant ainsi de la fluorescence. La recherche des conditions optimales de la dernière étape de la voie synthétique sont toujours en cours d’optimisation. Dans le futur, on cherchera les conditions optimales de la dernière étape de la synthèse de la sonde spécifique au peroxyde d’oxygène. Cette molécule est d'une importance remarquable comme sonde du stress oxydant. En réussissant cette étape, on pourra avoir en main une bibliothèque de ‘’KDO’’ fonctionnalisé afin d’avoir des résultats satisfaisants in vivo. / The first part of this work is done in order to prepare products that play a very important role in cellular imaging lipopolisaccharides on the surface of bacterial cells, while using reliable methods such as '' click chemistry ''. Initially, we synthesized the first generation of tools based fluorescent rhodamine B and fluorescein -modified nitrile oxide function. In a second step we sought the best possible applications of click chemistry 3+2 copper free, between the nitrile oxide function and the additional saccharide unit with a vinyl function. Finally, we applied successfully, the click method with copper on several types of bacteria on their cell membrane lipopolysaccharides having a pattern Kdo functionalized azide group already synthesized within our team, and a probe carrying a fluorescent alkyne. A new generation of tools saccharide marking is being finalized in order to optimize the final terms, such as derivative functionalized Kdo this time by cyclic, bicyclic and aromatic derivatives holders of an alkene or alkyne function to perform final testing of in vitro labeling. Oxidative stress is linked to cell aging and many diseases: cardiovascular disease, cancer, diabetes, Alzheimer's ... It is due to an imbalance between oxidant system/antioxidant in cells, and is characterized mainly by the presence of radical substance reactive oxygen. In order to identify the rate of reactive oxygen substances in cells, work in the second part of the thesis based on multi- step synthesis of a fluorescent molecule derived from coumarin. The target compound is oxygen peroxide, known as the name of hydrogen peroxide. Having a vinyl boronic ester, this molecule will be oxidized and rearranged aldehyde leading to intramolecular condensation with the adjacent amino group to form an indolique ring , thereby releasing fluorescence. The search for optimal conditions for the last step of the synthetic pathway is still being optimized. In the future, the optimal conditions for the last step of the synthesis of specific probe oxygen peroxide are sought. This molecule is remarkable importance as a probe of oxidative stress. By passing this step, we will have on hand a library of KDO functionalized to have satisfactory results in vivo.

Introduction : L'angiogenèse tumorale conduit au développement de nouveaux vaisseaux destinés à permettre la croissance de la tumeur. Les vaisseaux tumoraux sont caractérisés notamment par des anomalies des cellules murales (cellules musculaires périvasculaires), responsables d'anomalies de la fonctionnalité et de la maturation. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié un modèle tumoral de thérapie cellulaire par injection de cellules murales en IRM et vidéomicroscopie de fluorescence. Matériels et méthodes : Notre étude a porté sur un modèle sous cutané de carcinome épidermoïde chez la souris nude. Les animaux étaient divisés en trois groupes : contrôle (n=17), contrôle négatif (n=16) et " traité " avec injection locale de cellules murales humaines (n=17). Les animaux bénéficiaient d'une IRM et d'une exploration par vidéomicroscopie avant (J7) et après traitement (J14). Les paramètres mesurés étaient la taille tumorale (pied-à-coulisse et IRM), la densité microvasculaire (DMV par IRM, vidéomicroscopie et histologie), l'ADC, f, Dr et D* (IRM de diffusion), les variations de R2* sous air, oxygène et carbogène (IRM par effet BOLD) et " l'index leakage " (reflétant la perméabilité capillaire, en vidéomicroscopie). Résultats : Lors de la croissance tumorale, le groupe contrôle a montré une diminution des vaisseaux circulants (ou fonctionnels) qui se reflétait par une diminution du D* et du R2* sous air, une perte de la capacité à répondre au carbogène qui se reflétait par une augmentation du delta R2* sous carbogène, et une augmentation de la perméabilité capillaire qui se traduisait par un " index leakage " plus élevé. Dans le groupe traité par injection de cellules murales, nous avons observé un ralentissement de la croissance tumorale et une stabilisation de ces paramètres de microcirculation et maturation vasculaire. Conclusion : Nous avons montré un effet biologique de notre thérapie cellulaire par injection locale de cellules murales qui se traduisait par un ralentissement de la croissance tumorale, une stabilisation de l'hémodynamique microcirculatoire et de la maturation, et une perméabilité capillaire diminuée, concordants avec l'effet présumé stabilisateur et normalisateur des cellules murales sur les microvaisseaux.

Au cours du 21ème siècle, les techniques de fluorescence ont montré une expansion considérable dans l’étude du mécanisme du vivant. Un progrès majeur dans le développement, la conception et les applications de divers types de chromophores organiques ont été achevés. Bien que largement utilisés, les sondes fluorescentes les plus utilisées souffrent encore de quelques limitations qui diminuent leur étendue d'action. Les plus problématiques sont : un nombre restreint de familles de chromophores, une faible résistance au photoblanchiment, une faible solubilité aqueuse, une durée de vie de fluorescence relativement courte, etc…. A ce titre, le développement de nouveaux motifs organiques inédits, compacts et possédants des propriétés de fluorescence alternatives et/ou complémentaires aux fluorophores usuels organiques reste plus que jamais d’actualité. Dans ce contexte, les noyaux 1,3a, 6a-triazapentalènes nous sont apparus particulièrement prometteuses et encore très peu exploitées. Dans ce manuscrit, il est décrit la synthèse de noyaux tricycliques et tétracycliques comportant ce motif, obtenus par substitution nucléophiles aromatiques, suivi d’une thermolyse. La modulation de ces noyaux a ensuite été effectuée par couplage métallo-catalysé. L’évaluation photophysique de ces composés révèle des propriétés spectroscopiques remarquables comme des rendements quantiques supérieurs à 50%, des déplacements de Stokes d’environ 100 nm et des longueurs d’ondes d’émission allant de 450 à 650 nm. Le dernier volet de cette thèse a porté sur l’imagerie cellulaire, qui nous a permis d’évaluer les meilleurs fluorophores sur cellules vivantes. / Over the last two decades, fluorescence technologies have shown a spectacular spreading in biological research. Major progress in the development, design, and purposeful application of various types of organic chromophores was achieved. Although widely used, the most commonly fluorescent probes still suffer from some limitations which decrease their use in the field of life sciences. The most problematic ones are: low scaffold diversity, high sensitivity to photobleaching, low water solubility and modest Stokes Shift… In this context, the main idea of our work focuses on the development of novel organic motifs responding to the conventional fluorophores issues. The 1,3a, 6a-triazapentalene moiety represents a real interest in this field with its promising optical properties. In this manuscript, the syntheses of tricyclic and tetracyclic derivatives containing this scaffold were obtained by aromatic nucleophilic substitution followed by the thermolysis cyclization. The modulation of these cores was then allowed by various organometallic cross of these compounds provides remarkable spectroscopic properties, as quantum yields above 50%, Stokes shift around 100 nm, and emission wavelengths between 450 and 650 nm. The last part of this thesis was focused on cellular imaging, that allowed us to evaluate the best fluorophores in living cells.

Les cellules murales du cerveau sont un groupe de cellules neurovasculaires qui présentent une hétérogénéité moléculaire, morphologique et fonctionnelle exceptionnelle. Celles en contact avec les plus petis vaisseaux du cerveau, les péricytes du lit capillaire moyen sont connues pour être essentielles à l'homéostasie cérébrale, bien que leur capacité contractile ait longtemps été débattue. Cependant, nombre de leurs propriétés physiologiques, telles que leurs mécanismes de signalisation calcique, n'ont pas encore été élucidées. Cette thèse vise donc à identifier les mécanismes cellulaires de la signalisation calcique des péricytes des capillaires cérébraux. Dans le chapitre 2, nous utilisons la pharmacologie et l'imagerie des péricytes cérébraux exprimant l'indicateur de calcium GCaMP6f (provenant de souris transgéniques PDGFRβ-Cre::GCaMP6f) pour découvrir ces mécanismes. Contrairement aux péricytes engainants dont la signalisation du calcique dépend des canaux calcique voltage-dépendants, nous constatons que les signaux calcique des péricytes capillaire moyen sont indépendants des canaux calcique voltage-dépendants. Au contraire, nous constatons que les signaux calciques transitoires des pericytes du lit capillaire moyen sont inhibés par l'élimination du Ca2+ extracellulaire, l'inhibition des canaux Orai opérés par les réserves, le blocage du remplissage des réserves du réticulum endoplasmique, ainsi que l'inhibition des récepteurs de la ryanodine (RyRs) et des récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3Rs). Nous constatons également que l'entrée de Ca2+ opérée par les réserves peut être induite par la déplétion des réserves du réticulum endoplasmique et inhibée par les bloqueurs d'Orai dans les pericytes du lit capillaire moyen, et que l'influx basal de Ca2+ est largement dépendant de la déplétion des réserves. Enfin, nous montrons que l'entrée de Ca2+ opérée par les réserves d'Orai amplifie les élévations de Ca2+ cytosolique en réponse au vasoconstricteur endothéline-1. Nous concluons que la signalisation calcique dans les pericytes du lit capillaire moyen, qu'elle soit spontanée ou induite de façon agoniste, est régulée par le couplage entre la libération des réserves du réticulum endoplasmique et les voies d'influx opérées par les réserves. / Brain mural cells are a grouping of neurovascular cells that display exceptional molecular, morphological, and functional heterogeneity. Mid-capillary pericytes, the mural cells which contact the smallest vessels of the brain, are known to be critical to brain homeostasis, and their contractile ability has long been debated. However, many of their physiological properties, such as their Ca2+ signaling mechanisms, have not been elucidated. This thesis aims to uncover the cellular mechanisms of brain mid-capillary pericyte Ca2+ signaling. In chapter 2, we harness pharmacology and imaging of brain pericytes expressing the calcium indicator GCaMP6f (from transgenic PDGFRβ-Cre::GCaMP6f mice) to uncover these mechanisms. In contrast to ensheathing pericytes whose Ca2+ signaling is dependent on voltage-gated Ca2+ channels (VGCCs), we find that mid-capillary pericyte Ca2+ signals are independent of VGCCs. Instead, we find that mid-capillary pericyte Ca2+ transients are inhibited by removal of extracellular Ca2+, inhibition of store-operated Orai channels, blockade of endoplasmic reticulum store filling, as well as inhibition of ryanodine receptors (RyRs) and inositol triphosphate receptors (IP3Rs). We further find that store-operated Ca2+ entry can be induced by endoplasmic reticulum store depletion and inhibited by Orai blockers in mid-capillary pericytes, and that basal Ca2+ influx is largely dependent on store depletion. Finally, we show that Orai store-operated Ca2+ entry amplifies cytosolic Ca2+ elevations in response to the vasoconstrictor endothelin-1. We conclude that both spontaneous and Gq-coupled protein receptor agonist-induced Ca2+ signaling in mid-capillary pericytes is regulated by coupling between endoplasmic reticulum store release and store-operated influx pathways.