Les anticorps monoclonaux représentent aujourd’hui un outil de choix en thérapeutique et en diagnostic. Les anticorps thérapeutiques sont des biomédicaments en plein essor depuis les années 1970 et représentent 10% du marché des produits pharmaceutiques. Les anticorps monoclonaux sont utilisés dans divers domaines : en cancérologie, pour lutter contre les maladies auto-immunes ou en infectiologie. Le nombre des anticorps monoclonaux en développement ne cesse d’augmenter. Les premiers anticorps monoclonaux utilisés en thérapie étaient d’origine murine et leur administration à l’Homme est susceptible de déclencher des effets secondaires. De nouveaux anticorps visant à limiter voir faire disparaitre ces effets indésirables tels que d’abord les anticorps chimériques, puis les anticorps humanisés et enfin les anticorps totalement humains ont été développés. 9 anticorps totalement humains sont actuellement sur le marché et d’autres sont en cours de développement. Le phage display, les souris transgéniques et l’utilisation de lymphocytes B humains sont les trois stratégies mises en œuvre pour produire des anticorps totalement humains. L’utilisation des lymphocytes B humains, peu étudiée à cause d’un faible rendement et de problèmes de stabilité, a connu ces dernières années un regain d’intérêt grâce à l’immortalisation virale par le virus Epstein-Barr et à la découverte de myélomes humains. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse a été la production d’anticorps monoclonaux humains à partir de lymphocytes B humains. Pour ce faire, deux approches basées sur l’immortalisation virale par le virus Epstein-Barr couplée ou non à une immortalisation cellulaire par des myélomes ont été mises en œuvre. La première approche utilise des lymphocytes B mémoires isolés de sang périphérique de donneurs infectés ou vaccinés. L’entérotoxine B de Staphylococcus aureus (SEB) a été utilisée comme modèle.La deuxième approche implique une immunisation in vitro de lymphocytes B naïfs extraits de sang périphérique. Cette stratégie pourrait permettre la production d’anticorps humains contre des antigènes pour lesquels il n’existe pas de donneurs infectés ou vaccinés. Deux modèles, le peptide N-terminal de la neurotoxine A de Clostridium Botulinium A (BoNT/A) et la protéine de fusion ZZTat101, comportant le domaine ZZ de Staphylococcus aureus lié covalemment à la protéine transactivatrice Tat du virus de l’immunodéficience humaine VIH-1, ont été employés. Nous avons réussi à obtenir des IgMs dirigés contre la neurotoxine Clostridium Botulinium A, ainsi que des IgMs (et peut-être des IgGs) dirigés contre la protéine Tat. L’immortalisation par Epstein-Barr, nous a permis d’isoler 7 lignées de lymphocytes immortalisés sécrétant des anticorps IgMs anti-TBA-Nter humains. L’immunisation in vitro produisant essentiellement des IgMs, la possible production d’IgGs après stimulation par la protéine ZZTat101 se révèle un résultat très intéressant. Nous avons montré que la production d’anticorps par ZZTat101 impliquait les 7 cystéines, la région 22-57 et la liaison aux héparanes sulfates de Tat. / The number of monoclonal antibodies used as drug or under clinical investigation increases rapidly. The first murine monoclonal antibodies (mAbs) used in therapy induces human anti-mouse antibodies (HAMAs) when administered to patients. Such HAMAs hamper the therapeutic efficacy of mAbs and induce side effects. To limit these effects, new antibodies were developed during the, last 30 years. Chimeric, humanized and fully human antibodies were engineered. The use of human monoclonal antibodies (hAbs) appears ideal to solve the problem of HAMAs. Nowadays 9 fully human antibodies are available and others are evaluated in clinical trials or currently investigated in research labs. Three methods exist to produce fully human antibodies: the phage display, the transgenic mice and the use of human B lymphocytes. The majority of fully human antibodies resulted from the phage display and the transgenic mice methods. The use of human B lymphocytes is less investigated due to a poor yield and stability problems. These last years, the immortalization process, thanks to the involvement of the Epstein-Barr virus and human myeloma, induced a rise of interest for human B lymphocytes. In this context we decided to develop fully human monoclonal antibodies using human B lymphocytes through immortalization using the Epstein-Barr virus followed or not by an immortalization with a human/mouse heteromyeloma HM. The first approach is based on hAbs production from peripheral blood memory B lymphocytes isolated from infected or vaccinated donors. The Staphylococcus aureus enterotoxine B (SEB) was used as a model. Memory B lymphocytes were purified and cultured in the presence of Epstein-Barr virus (EBV). The transformation of memory B lymphocytes by EBV allowed the generation of immortalized B lymphocytes lines producing IgGs antibodies directed against SEB. We succeeded in isolating 6 EBV-immortalized memory B lymphocytes lines secreting anti-SEB IgGs antibodies. After many attempts to immortalize EBV immortalized memory B lymphocytes lines secreting anti-SEB antibodies with myeloma, the fusion of a EBV immortalized memory B lymphocytes with the human/mouse heteromyeloma HM led to an hybridoma. Unfortunately this hybridoma has rapidly lost its capacity to secrete d’IgGs anti-SEB. In the second approach the hAbs production implies the in vitro immunization of peripheral blood naïve lymphocytes. This strategy could allow the hAbs production against antigens for which no infected or vaccinated donors may be available. The Clostridium Botulinum neurotoxin A (BoNT/A), the most powerful toxin, and its N-terminal peptide (TBA-Nter) or the fusion protein ZZTat101 were used as models. ZZTat101 is a fusion between the ZZ domain of Staphylococcus aureus and the Tat protein of the human immunodeficiency virus HIV-1. Monocytes, B lymphocytes and T lymphocytes were isolated from human PBMC depleted of Natural killer. These cells were tools to develop efficient in vitro immunization protocols. IgMs directed against TBA-Nter and also IgMs (and possibly IgGs) directed against Tat were obtained. The use of the Epstein-Barr virus induced 7 EBV immortalized lines secreting anti-TBA-Nter IgMs antibodies. Unfortunately, after fusion with the heteromyeloma HM no hybridoma was isolated against TBA-Nter and Tat. The ZZTat101 mechanism involved on humoral response was studied, showing that the 7 cysteines, the region 22-57 and the ability of Tat to bind heparane sulfate are necessary to trigger the humoral response.

Les anticorps monoclonaux représentent aujourd'hui un outil de choix en thérapeutique et en diagnostic. Les anticorps thérapeutiques sont des biomédicaments en plein essor depuis les années 1970 et représentent 10% du marché des produits pharmaceutiques. Les anticorps monoclonaux sont utilisés dans divers domaines : en cancérologie, pour lutter contre les maladies auto-immunes ou en infectiologie. Le nombre des anticorps monoclonaux en développement ne cesse d'augmenter. Les premiers anticorps monoclonaux utilisés en thérapie étaient d'origine murine et leur administration à l'Homme est susceptible de déclencher des effets secondaires. De nouveaux anticorps visant à limiter voir faire disparaitre ces effets indésirables tels que d'abord les anticorps chimériques, puis les anticorps humanisés et enfin les anticorps totalement humains ont été développés. 9 anticorps totalement humains sont actuellement sur le marché et d'autres sont en cours de développement. Le phage display, les souris transgéniques et l'utilisation de lymphocytes B humains sont les trois stratégies mises en œuvre pour produire des anticorps totalement humains. L'utilisation des lymphocytes B humains, peu étudiée à cause d'un faible rendement et de problèmes de stabilité, a connu ces dernières années un regain d'intérêt grâce à l'immortalisation virale par le virus Epstein-Barr et à la découverte de myélomes humains. Dans ce contexte, l'objectif de mon projet de thèse a été la production d'anticorps monoclonaux humains à partir de lymphocytes B humains. Pour ce faire, deux approches basées sur l'immortalisation virale par le virus Epstein-Barr couplée ou non à une immortalisation cellulaire par des myélomes ont été mises en œuvre. La première approche utilise des lymphocytes B mémoires isolés de sang périphérique de donneurs infectés ou vaccinés. L'entérotoxine B de Staphylococcus aureus (SEB) a été utilisée comme modèle.La deuxième approche implique une immunisation in vitro de lymphocytes B naïfs extraits de sang périphérique. Cette stratégie pourrait permettre la production d'anticorps humains contre des antigènes pour lesquels il n'existe pas de donneurs infectés ou vaccinés. Deux modèles, le peptide N-terminal de la neurotoxine A de Clostridium Botulinium A (BoNT/A) et la protéine de fusion ZZTat101, comportant le domaine ZZ de Staphylococcus aureus lié covalemment à la protéine transactivatrice Tat du virus de l'immunodéficience humaine VIH-1, ont été employés. Nous avons réussi à obtenir des IgMs dirigés contre la neurotoxine Clostridium Botulinium A, ainsi que des IgMs (et peut-être des IgGs) dirigés contre la protéine Tat. L'immortalisation par Epstein-Barr, nous a permis d'isoler 7 lignées de lymphocytes immortalisés sécrétant des anticorps IgMs anti-TBA-Nter humains. L'immunisation in vitro produisant essentiellement des IgMs, la possible production d'IgGs après stimulation par la protéine ZZTat101 se révèle un résultat très intéressant. Nous avons montré que la production d'anticorps par ZZTat101 impliquait les 7 cystéines, la région 22-57 et la liaison aux héparanes sulfates de Tat.

Le but de ce projet était d'identifier de manière méthodique et standardisée les partenaires interagissant avec la protéine dystrophine dans les cellules musculaires squelettiques humaines différenciées et découvrir de nouveaux rôles de la dystrophine. Des cellules immortalisées ont été obtenue en sur-exprimant de manière stable hTERT / CDK4. Nous avons réalisé une analyse transcriptomique comparant des lignées immortalisées avec leurs populations primaires correspondantes, à l’état de prolifération et de différentiation. Nous avons constaté que l'immortalisation n'a pas d'effet mesurable sur le programme myogénique ou sur tout autre processus cellulaires, et qu'elle avait un effet protecteur contre le processus de sénescence. Les lignées de cellules musculaires humaines constituent donc de bon model in vitro pour l’étude de l’interactome de la dystrophine. Nous avons déterminé l’interactome de la dystrophine en utilisant l’approche proteomique ‘QUICK’. Nous avons identifié 18 nouveaux partenaires directs de la dystrophine, partenaires étant impliqués dans le transport vésiculaire ou étant des protéines d'adhésion. Ces résultats renforcent les données précédemment publiées suggérant un lien entre la dystrophine et le trafic vésiculaire, ainsi que dystrophine et adhesion cellulaire. Ces nouveaux partenaires ont été ajoutés à l’interactome de la dystrophine, interactome accessible sur le Web: sys-myo.rhcloud.com/dystrophin-interactome. Ce site web est dédié à être un outil facile d’utilisation permettant d’explorer et de visualiser l’interactome de la dystrophine du muscle squelettique. / The aim of this project was to systematically identify new interaction partners of the dystrophin protein within differentiated human skeletal muscle cells in order to uncover new roles in which dystrophin is involved, and to better understand how the global interactome is affected by the absence of dystrophin. hTERT/cdk4 immortalized myogenic human cell lines represent an important tool for skeletal muscle research however, disruption of the cell cycle has the potential to affect many other cellular processes to which it also linked. A transcriptome-wide analysis of healthy and diseased lines comparing immortalized lines with their parent primary populations in both differentiated and undifferentiated states testing their myogenic character by comparison with non-myogenic cells found that immortalization has no measurable effect on the myogenic cascade or on any other cellular processes, and that it was protective against the senescence. In this context the human muscle cell lines are a good in vitro model to study the dystrophin interactome. We investigated dystrophin’s interactors using the high-sensitivity proteomics ‘QUICK’ approach. We identified 18 new physical interactors of dystrophin which displayed a high proportion of vesicle transport related proteins and adhesion proteins, strengthening the link between dystrophin and these roles. The proteins determined through previously published data together with the newly identified interactors were incorporated into a web-based data exploration tool: sys-myo.rhcloud.com/dystrophin-interactome, intended to provide an easily accessible and informative view of dystrophins interactions in skeletal muscle.