Das Prion-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Entwicklung einer Therapie für Prionenerkrankungen eine Induktion von Autoantikörpern gegen das Prion-Protein voraussetzt. In dieser Arbeit wurden aktive Immunisierungsstrategien gegen das zelluläre Prion-Protein beschrieben und die zellulären und humoralen Immunantworten sowie deren Einfluss auf die Entstehung einer Prionenerkrankung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Immunisierung mit rek. mPrP und Adjuvants eine Aktivierung und Proliferation von PrP-spezifischen T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen induziert wurde. Desweiteren konnten in PrP-defizienten Mäusen spezifische Antikörper gegen das Prion-Protein nachgewiesen werden, die in der Lage waren, die pathogene Form des PrPs (PrPSc) zu detektieren und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die Immunisierung mit rek. mPrP und CpG-1826 konnten in CD4+-T-Zellen erhöhte Zytokinspiegel von TNF und IFN induziert werden. Im Gegensatz dazu konnte keine T-Zell-Antwort und nur geringe Antikörperkonzentrationen nach Proteinimmunisierung in Wildtypmäusen nachgewiesen werden. Die induzierten Antikörper in Wildtypmäusen waren nicht in der Lage den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. In einem zweiten Ansatz wurde die Immunisierung mit zwei unterschiedlichen PrP-exprimierenden DNA-Vektoren durchgeführt. Hierfür wurden der pCG-PrP-Vektor, der das Maus-PrP exprimiert, und der pCG-PrP-P30-Vektor, der zusätzlich zum PrP für das P30-Th-Epitop des Tetanustoxins kodiert, verwendet. Dieses P30-Epitop wurde schon in früheren Arbeiten genutzt, um die Toleranz gegen körpereigene Proteine zu brechen. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die DNA-Immunisierung eine PrP-spezifische Antikörperantwort in Prnp0/0-Mäusen induziert werden konnte. In Wildtypmäusen wurden allerdings nur geringe Antikörpertiter nachgewiesen. Die Antikörper aus den Prnp0/0-Mäusen waren in der Lage PrPSc zu erkennen, und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die DNA-Immunisierung wurde eine PrP-spezifische Aktivierung und Proliferation von T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen erreicht, die nach Immunisierung mit pCG-PrP-P30 stärker war als nach Immunisierung mit pCG-PrP. Nach DNA-Vakzinierung konnte in Wildtypmäusen eine unspezifische Erhöhung der Zytokinantwort mit erhöhten TNF- und IFN-Spiegeln nachgewiesen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Kombination aus DNA- und Proteinimmunisierung durchgeführt, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die nach DNA-Immunisierung allein erreicht wurden. Die Inokulation der immunisierten Wildtypmäuse mit einem Maus-adaptierten Scrapiestamm (RML) zeigte keinen Schutz dieser Tiere vor einer Prionenerkrankung. Alle Mäuse aus der immunisierten und nicht immunisierten Gruppe erkrankten im gleichen Zeitraum an Scrapie, zeigten PrPSc Akkumulation im Gehirn und in der Milz und für Prionenerkrankungen typische histopathologische Veränderungen. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Immunisierungsstrategien entwickelt werden, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen und einen Schutz vor Prionenerkrankungen zu induzieren. / The prion protein (PrPC) plays a pivotal role in transmissible spongiform encephalopathies (TSE). Recent studies have shown that strategies aimed to elicit antibodies against PrP should be considered as a promising therapeutic approach for prion diseases. In this study active immunisation strategies against PrPC were described, humoral and cellular immune responses as well as the influence of the onset of the prion disease were analyzed. Here we demonstrate that immunisation with recombinant murine prion-protein (mPrP) results in activation and proliferation of PrP-specific T cells and induction of PrP-specific antibodies in PrP-deficient mice (Prnp0/0). These antibodies are able to detect and reduce PrPSc levels in cell culture. Immunisation with rek. mPrP and CpG-1826 results in increased levels of TNF and IFNin Prnp0/0 mice. In contrast no T cell response and only low antibody titers against PrP were found in individual wild-type mice. The low level of antibodies in wildtype mice were not able to reduce the PrPSc level in cell culture. In a second approach, we investigated a new immunisation strategy against PrPC with two vaccine DNA vectors (pCG-PrP and pCG-PrP-P30). The pCG-PrP vector system contains murine PrP sequence, whereas the pCG-PrP-P30 vector also contains an immune stimulatory peptide of the tetanus toxin, which has been shown to break tolerance against self proteins. Results indicate that this improved vaccine evokes a sustained antibody response in Prnp0/0 mice, but only low antibody titers were found in wild-type mice. The antibodies from Prnp0/0 mice were able to detect PrPSc and to reduce PrPSc levels in cell culture. DNA immunisation induced activation and proliferation of PrP-specific T cells in Prnp0/0-mice which was even stronger after immunisation with pCG-PrP-P30 than after pCG-PrP treatment. DNA vaccination induced an unspecific T cell response with increased levels of IFN and TNF in wild-type mice. Furthermore we combined DNA and protein immunisation to break tolerance against PrP. The results obtained were similar then those after DNA vaccination alone. Inoculation of the immunised wildtype mice with mouse adapted scrapie prions showed that these animals were not protected against the development of the prion disease. All mice in the vaccinated and control groups succumbed to scrapie with similar incubation times, deposition of PrPSc in brain and spleen and typical histopathological changes in the brain. Nevertheless based on these findings additional strategies of immunisiation should be envisaged to develop immunotherapeutic approaches to break tolerance against PrP and to protect against the prion disease.

Soziale Insekten wie die Honigbiene (Apis mellifera) besitzen ein breites Spektrum an Abwehrmechanismen gegen Pathogenbefall, sowohl auf der Ebene der Kolonie (soziale Immunität) als auch auf der Stufe des Individuums (angeborenes Immunsystem). Die Hauptaufgabe der relativ kurzlebigen Drohnen besteht in der Begattung von Jungköniginnen. Daher stellte sich die Frage, ob auch die Drohnen ähnlich den Arbeiterinnen mit energieaufwendigen Immunreaktionen auf Infektionen reagieren. Wie im Folgenden beschrieben, konnte ich nachweisen, dass Drohnen eine ausgeprägte Immunkompetenz besitzen. Das angeborene Immunsystem setzt sich aus humoralen und zellulären Abwehrreaktionen zusammen. Bei der humoralen Immunantwort werden bestimmte evolutionär konservierte Signalkaskaden aktiviert, an deren Ende die Expression einer Vielzahl von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und immunspezifischen Proteinen (IRPs) steht. Zur Analyse der humoralen Immunantwort wurden von mir zum einen Hemmhoftests durchgeführt, um die gesamte antimikrobielle Aktivität der Haemolymphe nach artifizieller Infektion zu ermitteln und zum anderen spezifische AMPs bzw. IRPs identifiziert. Hierzu wurden die Haemolymphproteine in ein- oder zwei-dimensionalen Polyacrylamidgelen aufgetrennt und ausgewählte Proteinbanden bzw. -spots mittels nano HPLC/Massenspektrometrie analysiert. Die Hauptkomponenten des zellulären Immunsystems sind Wundheilung, Phagozytose, Einkapselung und Nodulation. In meiner Arbeit habe ich zum ersten Mal Noduli bei infizierten Drohnen nachweisen können. Frisch geschlüpfte adulte Drohnen (1d) weisen ein breites Spektrum an Immunreaktionen auf, das sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten umfasst. Nach Infektion mit dem Gram-negativen Bakterium E.coli und verschiedenen bakteriellen Zellwandbestandteilen wie Lipopolysaccharid (LPS), Peptidoglycan (PGN) und 1,3ß-Glucan (Bestandteil von Pilzzellwänden), werden die AMPs Hymenoptaecin, Defensin 1 und Abaecin induziert. Desweiteren exprimieren junge adulte Drohnen eine Reihe hochmolekularer immunspezifischer Proteine (IRPs) wie z.B. Carboxylesterase (CE 1), eine Serinprotease, die möglicherweise an der Prozessierung der Prophenoloxidase beteiligt ist, ein Peptidoglycan-interagierendes Protein (PGRP-S2) und zwei Proteine unbekannter Funktion, IRp42 und IRp30. Parallel zu bekannten bienenspezifischen AMPs wurde ein animales Peptidtoxin (APT) in Drohnenlarven, adulten Drohnen und adulten Hummeln nach E.coli Infektion in der Haemolymphe nachgewiesen. Von dem als OCLP 1 (ω-conotoxin-like protein 1) benannten Peptid war bereits bekannt, dass es in Fischen paralytische und damit toxische Effekte auslöst. Meine Beobachtungen lassen vermuten, dass es sich bei OCLP 1 um ein Peptidtoxin mit antimikrobiellen Eigenschaften und damit um eine neue Klasse von AMPs handelt. Die allgemeine humorale Immunkompetenz scheint während der gesamten Lebensspanne adulter Drohnen (~ 7 Wochen) konstant zu bleiben, wie durch die gleichbleibende antimikrobielle Aktivität im Hemmhoftest gezeigt wurde. Junge Drohnen reagieren auf eine E.coli Infektion mit der Bildung zahlreicher Noduli (~1000 Noduli/Drohn), die vor allem entlang des Herzschlauches zu finden sind. Diese zelluläre Immunantwort nimmt mit dem Alter der Drohnen ab, so dass bei 18 d alten Drohnen nur noch rund 10 Noduli/Drohn gefunden werden. Auf der anderen Seite nimmt die phagozytotische Aktivität bei älteren Drohnen scheinbar zu. In einer Reihe von parallel laufenden Versuchsreihen konnte ich eindrucksvoll zeigen, dass zelluläre Immunreaktionen wie Phagozytose und Nodulation unmittelbar nach bakterieller Infektion einsetzen. Hierbei erreicht die Nodulibildung 8-10 h p.i. eine Plateauphase, wohingegen die humorale Immunantwort erst 6 h p.i. schwach einsetzt, danach stetig zunimmt und noch 72 h p.i. nachweisbar ist. Es ist mir gelungen, eine Methode zur künstlichen Aufzucht von Drohnenlarven zu etablieren. Diese ermöglichte konstante und sterile Versuchsbedingungen zur Untersuchung der Immunreaktionen von Larven. Nach Infektion mit E.coli reagieren Drohnenlarven mit einer starken Aktivierung ihrer humoralen Immunantwort durch die Expression von AMPs, jedoch werden keine hochmolekularen IRPs wie in adulten Drohnen hochreguliert. Zudem ist die Nodulibildung in Larven nur schwach ausgeprägt. Völlig unerwartete Beobachtungen wurden beim Studium der Immunkompetenz von Drohnenpuppen gemacht. Nach Injektion lebender E.coli Zellen in Drohnenpuppen stellte ich eine dramatische Veränderung im Aussehen der Puppen fest. Die Puppen verfärbten sich gräulich schwarz. Genauere Untersuchungen haben dann gezeigt, dass die Drohnenpuppen, wie auch die der Arbeiterinnen, offensichtlich keine zelluläre Abwehrreaktion aktivieren können und die humorale Immunantwort nur sehr schwach ausfällt und viel zu spät einsetzt. / Social insects like honey bees (Apis mellifera) possess a wide range of defence mechanisms against pathogens on the colony level (social immunity) as well as on the individual level (innate immunity). In early summer, honey bee colonies consist of about 50.000 workers, a few hundred drones and one queen. The main task of the short-lived drones is to mate with a virgin queen. This raises a question: do drones, similar to workers mount an energy-intense immune reaction to fend off infections? In my thesis I could show that drones exhibit an effective immune competence. The innate immune response is composed of a humoral and a cellular component. In the humoral immune response, evolutionally conserved signalling pathways are activated and lead to the induced synthesis of antimicrobial peptides (AMPs) and immune responsive proteins (IRPs). In order to analyse the humoral immune response, I conducted inhibition zone assays as well as one- and two-dimensional gelelectrophoresis. Afterwards, HPLC/MS was performed in order to identify specific protein spots. Wound healing, phagocytosis, encapsulation and nodulation are the principal components of the cellular immune system. In my work, I could show nodulation reactions in infected drones for the first time. Newly emerged drones (1d) respond to infections with a wide range of immune reactions, including humoral and cellular defence mechanisms. The AMPs hymenoptaecin, defensin 1 and abaecin are induced after infection with gram-negative E.coli, bacterial cell wall components like lipopolysaccharides (LPS), peptidoglycan (PGN) and 1,3ß-glucan (cell wall component of fungi). In addition, young drones express some high molecular immune responsive proteins (IRPs) like carboxylesterase (CE 1), a serine protease, that is potentially part of the prophenoloxidase activating system, further a peptidoglycan recognition protein (PGRP-S2) and with IRp30 and IRp42 two proteins of unknown function. IRp42 possibly belongs to the glycin-rich proteins (GRP) because of its glycin–rich regions. Glycin-rich proteins are known to participate in host defence in plants. IRp30 is a leucine-rich repeat containing protein with a C-terminal leucine zipper, which is common among Hymenopterans. Therefore it is possible for IRp30 to interact with other proteins, like cell wall structures of pathogens. I detected the bee-specific lysozyme 2 in the haemolymph of adult drones after septic infection. It belongs to the chicken (c)-type lysozymes like lysozyme 1, which are potentially active against gram-positive and gram-negative bacteria and fungi in insects. After E.coli infection, an animal peptide toxin (APT) was detected simultaneously to the known AMPs in the haemolymph of larvae, adult drones and adult bumble bees. It is known that this peptide, called OCLP 1 (ω-conotoxin-like protein 1), triggers paralytic and thus toxic effects in fish. My observations suggest that OCLP 1 is probably a peptide toxin with antimicrobial characteristics, and thus could belong to a new class of AMPs. Throughout their whole life (~ 7 weeks), adult drones maintain their immune competence. This was shown by the continuous antimicrobial activity of drone haemolymph in inhibition zone assays. After E.coli infection, young drones react with nodule formation (~1000 noduli/drone), which are mostly attached to the dorsal vessel. With increasing age, this type of cellular immune response weakens, so that 18d old drones only produce 10 noduli/drone. On the other hand, the phagocytic activity seems to increase in older drones In an array of parallel tests, I showed the immediate onset of the cellular immune reactions phagocytosis and nodulation upon septic infections. Nodule formation reaches a plateau 8-10 h p.i., whereas humoral immune response just begins to start 6 h p.i., continuously rises and is still measurable 72 h p.i.. I succeeded in establishing a method for rearing honey bee drone larvae artificially. This enabled constant and sterile conditions for the testing of immune reactions in larvae. A strong activation of humoral immunity with the expression of AMPs resulted from E.coli infection, yet no immune responsive proteins were induced like in adult drones. Moreover, nodule formation in larvae is weak. While studying immune competence of drone pupae, I made a surprising observation. There is a dramatic change in the physical appearance of drone pupae after injecting living E.coli bacteria. They change colour to a greyish black. Precise examinations revealed that there is no cellular immune response in drone pupae as well as in worker pupae, only a weak humoral immune reaction which is initiated too late.

Humane Antikörper sind aufgrund ihrer spezifischen, zielgerichteten Eigenschaften die idealen therapeutischen Waffen unserer modernen Medizin. Schon im ausgehenden letzen Jahrhundert gelang es dem pathologischen Institut der Universität Würzburg einige rein humane monoklonale Antikörper aus Geweben sowohl gesunder, als auch an einem Tumorleiden erkrankter Patienten zu isolieren. Zwei dieser Antikörper galt es im Rahmen dieser Arbeit näher zu untersuchen: LM-1 und PAM-1 , beides rein humane monoklonale IgM-Antikörper. Mithilfe immunhistochemischer Färbungen auf Paraffinschnitten von Adenocarcinomen des Colons, Carcinomen des Pancreas und Adeno- und Plattenepithelcarcinomen der Lunge ließ sich eindeutig demonstrieren, daß bei beiden Antikörpern eine tumorspezifische Reaktivität ohne Kreuzreaktion mit den umgebenden gesunden Geweben auf fast allen der ausgewählten Fälle der begutachteten Tumorarten vorlag. Daraus lässt sich eine zuverlässige und selektive Expression der jeweiligen Antigene auf den maligne entarteten Zellen folgern, die sich auch bei Betrachtung der Stadien der Tumoren und des Gradings der Zellen konstant zeigte. Damit scheint soweit keinen Zusammenhang zwischen der Entdifferenzierung der tumorösen Zellen, als auch der Größe und des Fortschreiten des Tumors erkennbar. Die hier demonstrierten Ergebnisse lassen sowohl PAM-1 als auch LM-1 als verlässliche Marker für multiple epitheliale Tumoren und deren Vorstufen erscheinen und können somit als wertvolles diagnostisches und wahrscheinlich auch therapeutisches Mittel eingestuft werden, doch muss die Diskussion dieser Aspekte weiterführenden Untersuchungen überlassen werden. / Human antibodies are ideal therapeutic agents in modern medicine because of their specific and determined abilities. In the end of the last century, the institute of Pathology at the University of Wuerzburg had been successful in isolating several fully human monoclonal antibodies from different tissues of cancer patients as well as from healthy human beings. In this piece of work, two of these had been looked at more closely: PAM-1 and LM-1, both completely human monoclonal IgM antibodies. Immunohistochemical stainings on paraffin sections of tissues of adenocarcinoma of the colon, carcinomas of the pancreas and adeno- and squamous cell carcinomas of the lung clearly demonstrated the tumor specific reactivity of both antibodies without interaction with healthy tissues surrounding the malignant cells in nearly all of the selected cases. We have seen a constant and exclusive expression of the corresponding antigens on the neoplastic cells that appears to be a steady characteristic on all malign cells, no matter which stadium the tumor already reached or which state of grading had been shown by the cells. So far there seems to be any correlation between the de-differentiation of the tumor cells as well as the size and the progression of the tumor. The demonstrated results show PAM-1 and LM-1 as reliable markers on multiple epithelial tumors and their precursor lesions. With their exclusive tumor specific affinity to their corresponding antigens and their ability of initiating ADCC and CDC as well as inducing apoptosis, these antibodies have to be measured as precious diagnostic agents and perhaps as cancer immunotherapeutics. But these aspects of possible future cancer therapy have to be postponed on further discussions and investigations.

Vor fast 100 Jahren postulierte Paul Ehrlich ein körpereigenes System, das in der Lage ist, Tumorentstehung zu erkennen und zu eliminieren. Die Weiterentwicklung dieser Hypothese führte in den Folgejahren zum Modell der „immunosurveillance“, einer angeborenen Wachfunktion des Immunsystems, welche im Regelfall die Entstehung von manifesten Tumoren verhindern kann. Neben zellulären Bestandteilen wie Makrophagen und natürlichen Killerzellen kommt dabei eine entscheidende Bedeutung den B-Lymphozyten mit ihrer Fähigkeit zur Produktion eines variablen Antikörperrepertoires zu. Diese angeborene, IgM-vermittelte, humorale Abwehrfunktion richtet sich insbesondere auch gegen glykopeptidische Oberflächenantigene maligner körpereigener Zellen. Allerdings scheint sich in seltenen Einzelfällen ein Tumorprozess durch Fluchtmechanismen dem Zugriff der Immunabwehr entziehen zu können. Die intensiven Wechselwirkungen von Immunsystem und Tumorwachstum sind Ziel weitreichender Forschung geworden, angetrieben von der Hoffnung, in naher Zukunft neue immunologische Therapieverfahren gegen maligne Tumoren aufbieten zu können. Bisher wenig untersucht ist allerdings die lokale Situation der humoralen Immunität innerhalb von Tumorgewebe. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit eine Sequenzanalyse des exprimierten Immunglobulin-Repertoires in situ, also aus gewebeständigen tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten und solchen aus tumorfreiem Gewebe vorgenommen. Als Ausgangsmaterial diente Gewebe aus Magenkarzinomen und tumorfreier Magenschleimhaut des Magenantrums von acht Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung. Adenokarzinome des Magens stellen eine multifaktoriell bedingte, weltweit häufig auftretende Tumorentität mit besonders schlechter Prognose dar. In der Tat zeigen sich in den vorliegenden Ergebnissen signifikante Unterschiede zwischen Tumor und Antrum in den variablen Schwerkettengenen der gewebeständigen B-Lymphozyten. Diese betreffen sowohl die IgVH- Familienzugehörigkeit als auch die Mutationsraten und Mutationsmuster der einzelnen Sequenzen. Die entscheidenden Beobachtungen im Rahmen dieser Arbeit sind der in situ- Nachweis von naiven, nicht immunitätsgereiften Immunglobulinen der primären Immunantwort, insbesondere der mit Antitumoraktivität in Verbindung gebrachten IgVH3-Familie innerhalb des untersuchten Antrumgewebes sowie deren Fehlen innerhalb des Tumorprozesses. Der Nachweis affinitätsgereifter Immunglobuline innerhalb des Tumorprozesses legt eine zwar intensive, aber letztendlich ineffektive Auseinandersetzung des Immunsystems mit dem sich offenbar in diesem Stadium nicht mehr als ausreichend immunogenen erweisenden Tumorprozess nahe. Diese Ergebnisse heben die entscheidende Bedeutung der naiven Immunität für die Verhinderung von Tumoren (Immunüberwachung) hervor. Unklar sind allerdings nach wie vor die Escape-Mechanismen, die es einem Tumor erlauben, sich dieser primären Immunantwort zu entziehen. Weitere Forschungsarbeit im Bereich naiver Immunglobuline mit Antitumoraktivität, wie beispielsweise dem selektiv an Magenkarzinomzellen bindenden und Apoptose auslösenden Antikörper SC-1, könnte dazu beitragen, zukünftig völlig neue adjuvante immunologische Therapieverfahren in der Tumortherapie zu etablieren. / Nearly 100 years ago Paul Ehrlich has postulated an endogenous system that is capable to recognize and to avoid the process of tumour genesis. In the following years further studies have led to the model of innate immunosurveillance, which explains the typical prevention of the development of manifest carcinoma. In addition to cellular components, such as macrophages and natural killer-cells, B-lymphocytes play an important role in this process by building a variable antibody repertoire. This innate, IgM-mediated, humoral immune resistance is in particular targeted on glycol-peptide cell surface antigens on malignant cells. Nevertheless, in rare cases tumours seem to evade from this influence of the immune system via escape mechanisms. The intensive interaction between the immune system and tumour growth has become an extensive field of research to develop new immunologic therapies for the treatment of malignant tumours in the near future. Little is known, however, about the local situation of humoral immunity within malignant tissue. A sequence analysis of expressed antibody repertoire in situ was done in this treatise by comparing tumour infiltrating B-lymphocytes to those being extracted from normal tissue. The material was taken from gastric carcinoma and tumour-free gastric mucosal tissue of the antrum of eight patients with advanced tumour stages. Adenocarcinoma of the stomach are a multifactorally caused, worldwide spread disease with an extraordinarily poor prognosis. Present data show indeed significant differences between tumour and antrum tissue concerning the immunoglobuline heavy chain variable regions of the B-lymphocytes extracted from tissue. Differences appear in both the allocation to IgVH-subfamilies and the mutation rate as well as the mutational pattern. In this study the most important observation is the in situ detection of innate non-maturated immunoglobulines of the primary immune response. In particular of the VH3-family, which is known to trigger anti-tumour activity, within the tumour-free antrum tissue and which is absent in the tumour process. The detection of affinity-maturated antibodies within the tumour tissue shows an intensive but eventually ineffective competition between the immune response and the tumour process that seems to be insufficiently immunogen in this stadium. These results point out the relevance of innate immunity in avoiding carcinoma (immunosurveillance). The escape mechanisms of a tumour from the primary immune response, however, remain still uncertain. Further research on naïve immunoglobulines with anti-tumour activity, for example on SC-1, which binds selectively on gastric carcinoma cells and causes apoptosis, might contribute to establish new adjuvant immunologic procedures in tumour therapy.

Ants of the species Camponotus floridanus live in huge colonies composed of genetically identical or closely related animals, which should predispose them to an increased vulnerability towards infection by pathogens (Cremer et al. 2007). Therefore the question is how ants (or social insects in general) can nevertheless efficiently combat infections. In order to investigate the immune response of the ant C. floridanus, the present study initially focused on the identification of possible immune factors, encoded by the ant´s genome. By using the method “suppression subtractive hybridization” as well as by Illumnia sequencing technology, several immune-related genes could be identified. Among these were genes encoding proteins involved in pathogen recognition, signal transduction, antimicrobial activity, or general stress response. In accordance with the ant´s genome sequence (Bonasio et al. 2010), only three antimicrobial peptide (AMP) genes could be identified in C. floridanus. The gene and cDNA sequences of these AMPs were established and their expression was shown to be induced by microbial challenge. Two different defensin genes (type 1 and 2) were characterized. A detailed characterization of the mRNA and gene sequence of the other AMP, a hymenoptaecin, revealed a special repeat structure. The C. floridanus hymenoptaecin has a signal and a pro-sequence followed by a hymenoptaecin-like domain and six directly repeated hymenoptaecin domains (HDs). Since each HD is flanked by two known processing sites, proteolytic processing of the precursor protein may generate several mature AMPs. Bioinformatical analyses revealed the presence of hymenoptaecin genes with similar multipeptide precursor structure in genomes of other ant species suggesting an evolutionary conserved important role of this gene in ant immunity. C. floridanus ants harbor the obligate intracellular bacterium, Blochmannia floridanus, in specialized cells (so-called bacteriocytes), which are intercalated between midgut cells as well as in ovaries of females (Blochmann 1882; Sauer et al. 2002; Schröder et al. 1996). Ant hosts face the problem that on the one hand they have to maintain the beneficial symbiotic bacteria and on the other hand they need to raise an immune response against harmful pathogenic bacteria during an infection. It was investigated, if endosymbionts are actually detected by the host immune system. Injection of B. floridanus induced an immune response of its host C. floridanus, which was comparable to the one towards pathogens. This means that, despite the evolutionary established cooperation of the endosymbionts and their hosts, these bacteria are still recognized as „non-self“ by the host immune system. This finding led to the question, if the ant immune system might be involved in regulation of the endosymbiont number in the midgut tissue in order to avoid their uncontrolled replication. During the holometabolous life cycle of the ant hosts the distribution of bacteriocytes and of Blochmannia endosymbionts is remarkably dynamic and peaks in late pupal stages, in which the entire midgut is transformed into a symbiotic organ (Stoll et al. 2010). It was hypothesized that hosts could regulate the number of endosymbionts present in their tissues via the innate immune system. A quantitative gene expression analysis of assumed symbiosis-relevant candidate genes revealed distinct expression patterns of some genes according to developmental stage and tissue. Moreover, the immune gene expression in response to bacterial challenge was investigated in the pupal stage. By an artificial immune-challenge of pupae it was confirmed that in fact the immune response of the endosymbiont-bearing midgut tissue differs from that of other body parts. The data support a key role for amidase peptidoglycan recognition proteins (PGRPs), especially PGRP-LB, in endosymbiont tolerance and suggest an involvement of the lysosomal system in control of Blochmannia endosymbionts. In sum, this thesis provides a first description of the immune response of the ant C. floridanus. A comprehensive set of immune-relevant genes was determined. Especially, the identification and molecular characterization of the hymenoptaecin gene delivered new insights into the immune competence of ants in general. Moreover, first indications could be gathered for the involvement of the immune system in controlling the endosymbiont B. floridanus. / Ameisen der Art Camponotus floridanus leben in großen Kolonien, welche sich aus genetisch identischen oder nahe verwandten Individuen zusammensetzen. Demnach sollten diese Tiere eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Infektionen durch Pathogene haben (Cremer et al. 2007). Somit stellt sich die Frage, wie Ameisen (oder allgemein soziale Insekten) Infektionen dennoch effizient bekämpfen können. Um die Immunantwort der Ameise C. floridanus zu untersuchen, befasste sich die vorliegende Arbeit zunächst mit der Identifizierung von möglichen Immunfaktoren, welche im Genom der Ameise kodiert sind. Unter Verwendung der Methode “Suppression Subtractive Hybridization” sowie durch Illumnia Sequenzierungstechnologie konnten mehrere immun-relevante Gene ermittelt werden. Darunter befanden sich Gene, welche Proteine kodieren, die eine Rolle bei der Erkennung von Pathogenen, der Signalübertragung, der antimikrobiellen Aktivität oder der allgemeinen Stressantwort spielen. In Übereinstimmung mit der Genomsequenz der Ameise (Bonasio et al. 2010), konnten nur drei antimikrobielle Peptid (AMP) Gene in C. floridanus identifiziert werden. Die Gen- und cDNA-Sequenzen dieser AMPs wurden charakterisiert und es wurde gezeigt, dass ihre Expression durch mikrobielle Attacken induziert wird. Zwei verschiedene Defensin Gene (Typ 1 und 2) wurden charakterisiert. Eine detaillierte Charakterisierung der mRNA- und Gen-Sequenz des anderen AMPs, eines Hymenoptaecins, ergab eine besondere Wiederholungsstruktur. Das C. floridanus Hymenoptaecin hat eine Signal- und eine Pro-Sequenz gefolgt von einer Hymenoptaecin-ähnlichen Domäne und sechs direkt wiederholten Hymenoptaecin Domänen (HD). Da jede HD von bekannten Schnittstellen flankiert wird, könnte die proteolytische Bearbeitung des Vorläufer Proteins mehrere reife AMPs hervorbringen. Bioinformatische Analysen enthüllten die Anwesenheit von Hymenoptaecin Genen mit ähnlicher Multipeptid-Vorläufer-Struktur in den Genomen von anderen Ameisenarten, was eine evolutionär konservierte wichtige Aufgabe dieses Gens bei der Immunität von Ameisen andeutet. C. floridanus Ameisen beherbergen das obligat intrazelluläre Bakterium, Blochmannia floridanus, in speziellen Zellen (den sogenannten Bakteriozyten), welche sich zwischen Zellen des Mitteldarms befinden sowie in den Ovarien von Weibchen (Blochmann 1882; Sauer et al. 2002; Schröder et al. 1996). Die Wirtstiere stehen vor dem Problem, dass sie einerseits die für sie nützlichen symbiontischen Bakterien erhalten müssen und andererseits bei einer Infektion eine Immunantwort gegenüber schädlichen pathogenen Bakterien aufbringen müssen. Es wurde untersucht, ob die Endosymbionten vom Wirtsimmunsystem überhaupt erkannt werden. Injektion des eigenen Endosymbionten B. floridanus induzierte eine Immunantwort seines Wirtes C. floridanus, welche vergleichbar war mit der gegenüber Pathogenen. Dies bedeutet, dass trotz der Koevolution zwischen den Endosymbionten und ihren Wirte, diese Bakterien immer noch als „nicht-selbst“ vom Wirtsimmunsystem erkannt werden. Dieses Ergebnis warf die Frage auf, ob das Ameisen-Immunsystem an der Regulation der Anzahl von Endosymbionten im Mitteldarmgewebe beteiligt sein könnte, um deren unkontrollierte Replikation zu vermeiden. Während des holometabolen Lebenszyklus der Ameisen-Wirte ist die Verteilung der Bakteriozyten und der Blochmannia Endosymbionten bemerkenswert dynamisch und erreicht den Höhepunkt in den späten Puppenstadien, in welchen der gesamte Mitteldarm zu einem symbiotischen Organ umgewandelt wird (Stoll et al. 2010). Es wurde vermutet, dass die Wirte die vorhandene Anzahl von Endosymbionten in ihren Geweben durch das angeborene Immunsystem regulieren könnten. Eine quantitative Genexpressionsanalyse von vermeintlich Symbiose-relevanten Kandidatengenen ergab verschiedene Expressionsmuster von einigen Genen in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium und Gewebe. Außerdem wurde die Immungenexpression nach einer bakteriellen Attacke im Puppenstadium untersucht. Durch eine künstliche Immunanregung von Puppen wurde bestätigt, dass sich die Immunantwort des Endosymbiont-tragenden Mitteldarm Gewebes in der Tat von der anderer Körperteile unterscheidet. Die Daten befürworten eine Schlüsselrolle von Amidase Peptidoglykan Erkennungsproteinen (PGRPs), insbesondere von PGRP-LB, für die Duldung von Endosymbionten und deuten auf eine Beteiligung des lysosomalen Systems an der Kontrolle von Blochmannia Endosymbionten hin. Insgesamt stellt die vorliegende Arbeit eine erste Charakterisierung der Immunantwort der Ameise C. floridanus dar. Eine Vielzahl an immun-relevanten Genen wurde bestimmt. Insbesondere die Identifizierung und molekulare Charakterisierung des Hymenoptaecin Gens lieferte neue Einblicke in die Immun-Kompetenz von Ameisen im Allgemeinen. Außerdem konnten erste Hinweise für die Beteiligung des Immunsystems an der Kontrolle des Endosymbionten B. floridanus gesammelt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde der zelluläre Immunstatus von 17 Patienten mit Erstdiagnose eines soliden gastrointestinalen Tumors vor und nach intravenöser Applikation von drei Zyklen einer konventionellen Polychemotherapie untersucht. Verglichen wurde zu Beginn der Therapie mit einer Kontrollgruppe, bestehend aus 21 nicht onkologisch vorerkrankten Probanden. Zur Messung der individuellen T-Zellvermittelten Immunantwort auf Einzelzellebene wird auf die Methode des IFN-γ-ELISPOT-Assays zurückgegriffen. Die zentrale Frage war, ob die Applikation einer Polychemotherapie einen messbaren Effekt auf die Immunantwort des einzelnen Individuums hat. Zudem sollte untersucht werden, ob generelle Unterschiede zwischen Patienten mit einer unbehandelten Tumorerkrankung und gesunden Probanden bzw. allgemein internistisch erkrankten Patienten zu erkennen sind. In Zusammenschau der Ergebnisse sind trotz überwiegend unveränderter T-Zell-Antwort auf die meisten der eingesetzten Antigene einige statistisch signifikante Unterschiede festzuhalten. So zeigte die Gruppe der Tumorpatienten vor Applikation der Chemotherapie im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant erhöhte Spotintensität und einen höheren Stimulationsindex [A] in Bezug auf das Tuberkulose-Antigen CFP-10. Diese Veränderungen waren nach Applikation der Chemotherapie nicht mehr nachzuweisen. Des Weiteren ergaben sich bei den Tumorpatienten vor und nach Chemotherapie signifikante Veränderungen der T-Zell-Antwort bezüglich des Antigens Tetanus-Toxoid. Nach Applikation von 3 Zyklen Chemotherapie kam es zu einer Verminderung des Stimulationsindex [A]. Es wird daher die Vermutung nahe gelegt, dass sich gerade in Bezug auf bakterielle Infektionen die T-Zell-Antwort der Tumorpatienten signifikant ändert. Die klinische Relevanz müsste jedoch anhand gezielter Messung auf spezifische bakterielle Antigene in größer angelegten Studien überprüft werden.

Erste tumorassoziierte Veränderungen finden im Glykosilierungsmuster von Glykoproteinen und Glykolipiden statt. Die dabei entstehenden tumorassoziierten Carbohydrat-Antigene sind prominente Zielstrukturen der natürlichen Tumorimmunität (Immune Surveillance) und gewinnen in der Onkologie als immunogene Epitope zunehmend an Bedeutung. Der humane monoklonale IgM-Antikörper SAM-6 ist Teil der tumorspezifischen Immunität. Er wurde mit Hilfe der konventionellen Hybridomatechnologie direkt aus einem an Magenkarzinom erkrankten Menschen isoliert. Neben der Erforschung seines außergewöhnlichen Apoptose-mechanismus konnte innerhalb dieser Arbeit eine Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und charakterisiert werden. Der humane monoklonale IgM-Antikörper SAM-6 bindet an eine neue Isoform des Hitzeschockproteins GRP78 (GRP78SAM-6). Das Antigen wurde über mehrstufige chromatographische Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und nach tryptischen Verdau über die Methode des Peptidmassen-Fingerprinting eindeutig als humanes GRP78 identifiziert. Die auf der Zellmembran lokalisierte Variante des GRP78 besitzt ein Molekulargewicht von 82 kD und wird auf vielfältigen Tumorgeweben stabil exprimiert. GRP78SAM-6 liegt parallel zur 78 kD-Wildtyp-Variante co-exprimiert vor und konnte im Gegensatz zur Wildtyp-Variante nicht auf gesundem Gewebe nachgewiesen werden. Bei der SAM-6-spezifischen Variante des GRP78 handelt es sich um eine posttranslational modifizierte Form des GRP78, die spezifisch auf der Zellmembran lokalisiert ist, nicht jedoch intrazellulär zu finden ist. Sie unterscheidet sich durch zusätzliche Glykosilierungen vom GRP78-Wildtypen, wobei O-glykosidisch verknüpfte Glykane für die Bindung und die Reaktion mit dem SAM-6 Antikörper essentiell sind. Der SAM-6-Rezeptor stellt eine tumorspezifische Isoform des Hitzeschockproteins GRP78 dar, deren O-glykosilierte Carbohydrat-Regionen als Epitop fungieren. Durch die Bindung an GRP78SAM-6 hemmt der Antikörper SAM-6 in vitro als auch in vivo konzentrationsabhängig das Wachstum von Magen- und Pankreaskarzinomzellen und induziert eine neue Art des apoptotischen Zelltodes, die sog. Lipoptose. Es handelt sich um einen durch den Antikörper vermittelten direkten Effekt, der sich ausschließlich auf malignes Gewebe beschränkt. Schlüsselpunkt der apoptotischen Wirkung ist die Akkumulation zytotoxischer Mengen an Cholesterol und Triglyceridestern, die nach Bindung an den Antikörper in Form von Lipoprotein-Partikeln in die Tumorzelle gelangen. Der pentamere IgM-Antikörper bindet neben membranständigem GRP78SAM-6 der Tumorzelle, die ApoB 100-haltigen Lipoproteine VLDL und LDL. Insbesondere oxidativ modifizierte Formen des LDL (oxLDL) zeigten dabei die höchste Bindungsaffinität zum SAM-6 Antikörper. In deren Anwesenheit war ein maximaler lipotoxischer Effekt zu beobachten. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, weite Teile des Lipoptose-Mechanismus aufzuklären. Eigenen Immunfluoreszenzstudien zufolge wird der SAM-6 Antikörper über rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert. Die GRP78-vermittelte Internalisierung von oxLDL-beladenem Antikörper scheint daher plausibel und für die tödliche Anhäufung der Lipide verantwortlich zu sein. Die SAM-6-induzierte Apoptose verläuft anschließend über einen spezifischen Signalweg, der Gemeinsamkeiten mit dem intrinsischen Signalweg aufweist, jedoch wie beim extrinsischen Signalweg über externe pro-apoptotische Liganden angeregt wird. Infolge der unphysiologisch hohen intrazellulären Konzentration an oxLDL kommt es zur Induktion einer Caspasenkaskade, die nach der initialen Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien über die Initiatorcaspasen 8 und 9 verläuft und letztendlich durch die Aktivierung der terminalen Caspasen 3 und 6 den apoptotischen Zelltod einleitet. Die Entdeckung von extrazellulär exprimiertem GRP78 auf Tumorzellen bietet die Möglichkeit neuer Therapieansätze in der Onkologie. Die SAM-6-spezifische Variante des GRP78 bietet insbesondere die Möglichkeit eines gezielten Angriffs auf die Tumorzelle, ohne gesunde Zellen zu tangieren. Sie wird auf Tumorgeweben verschiedenster Ätiologie stabil exprimiert und infolge ihres tumorspezifischen Auftretens zur optimalen Zielstruktur der natürlichen körpereigenen Immunantwort gegen Tumore. Der natürliche IgM-Antikörper ist Teil der natürlichen Immunität. Diese verfügt über ein breites Repertoire an Rezeptoren und garantiert die permanente Überwachung und Reaktion gegen modifizierte körpereigene Zellen. Sie ist dafür verantwortlich, dass Tumore sich nur in Ausnahmefällen manifestieren. / Tumor-associated modifications occur first in the glycosylation pattern of glycoproteins and glycolipids. These tumor-associated carbohydrate antigens are prominent targets of the natural tumor immunity (immune surveillance) and as immunogen epitopes they become more important for oncology therapies. The human monoclonal IgM antibody SAM-6 is part of this tumor specific immunity. It was isolated from a gastric cancer patient by using the conventional human hybridoma technology. Beside the investigation of its unique apoptosis mechanism, further goal of this study was the identification and characterization of the SAM-6 target. The human monoclonal IgM antibody SAM-6 binds to a new isoform of the GRP78 heat-shock protein (GRP78SAM-6). The SAM-6 antigen was purified from membrane extracts of stomach carcinoma cells using size exclusion and ion exchange chromatography. After tryptic digestion and peptide mass mapping it was definitely identified as human GRP78. The membrane bound variant of GRP78 has a molecular weight of 82 kD and is specifically over expressed in a wide range of cancer types. GRP78SAM-6 is co-expressed with wild-type GRP78 and is in contrast to its wild-type variant absent from normal tissues. The SAM-6 specific variant of GRP78 is a post-transcriptionally modified variant of GRP78, which is specifically expressed on the cell surface, but not found intracellularly. In contrast to the wild-type, GRP78SAM-6 is additionally glycosylated, whereas O-linked carbohydrates are essential for binding and reaction with the SAM-6 antibody. The SAM-6 receptor is a tumor specific isoform of the heat-shock protein GRP78, its epitopes are O-linked carbohydrate-moieties. After binding to GRPSAM-6, the antibody SAM-6 inhibits the growth of stomach and pancreas carcinoma cells in vitro and in vivo and induces a new kind of apoptotic cell death, the so-called lipoptosis. This direct and antibody induced effect is limited exclusively to malignant tissues. The crucial factor of the apoptotic effect is the accumulation of cytotoxic amounts of cholesterol and triglyceride esters, which get into the tumor cells in form of lipoprotein particles. The pentameric IgM antibody binds to GRPSAM-6 located on the tumor cell surface and to apoB 100, which is constituent of the lipoproteins VLDL and LDL. In particular, oxidatively modified LDL particles (oxLDL) showed the highest binding affinity to the SAM-6 antibody. In their presence the highest lipotoxic effect was observed. Within this study, important parts of this tumor specific lipoptosis mechanism could be explored. Own immunofluorescence studies revealed that the SAM-6 antibody is internalized via receptor mediated endocytosis. GRP78 mediated internalization of oxLDL-loaded antibody might be feasible and responsible for the deadly accumulation of lipids. The SAM-6 antibody induces a specific apoptotic pathway, which has similarities to the intrinsic pathway, but is activated by external pro-apoptotic ligands as it is know from the extrinsic pathway. Shortly after internalization of the antibody-LDL complex the unphysiologically high concentration of intracellular lipids initiates the release of mitochondrial cytochrom c followed by the activation of a cascade of caspases, such as initiator caspases 8 and 9 and finally the terminal caspases 3 and 6 leading to cell death. The discovery of extracellularly located GRP78 on tumor cells offers the opportunity of new oncological therapies. Especially the SAM-6 specific variant of GRP78 promises a targeted therapy against tumor cells, without hitting healthy cells. It is stable expressed on a variety of tumor tissues and in consequence of its tumor specific expression an ideal target of human innate immune responses against tumors. The natural IgM antibody SAM-6 is part of this natural immunity. It uses a broad repertoire of receptors and guaranties a permanent control and reaction against modified self-structures. Innate immunity is the reason that tumors only occur in exceptional cases.

Der humane, monoklonale IgG Antikörper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunität dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden können. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und näher charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei über ein affinitätschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS über die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antikörper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr häufig bei den natürlichen IgM Antikörpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antikörpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zelluläre Prozesse ausübt. Durch die Bindung hemmte der Antikörper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem für metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antikörperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladhäsion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellulären Prozesse sind wichtig für sich im Körper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgeführten Analysen handelte es sich um vom Antikörper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Bindungsverhalten des Antikörpers genauer charakterisieren zu können. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antikörper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antikörpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen ermöglicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunität als auch neue Optionen für die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellulären, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue Möglichkeit für Diagnostik- und Therapieansätze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen ermöglicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentitäten könnte diese Zielstruktur für die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilität und Tumorzelladhäsion, könnte der BARB-4 Antikörper besonders für die Prävention einer Metastasierung von Bedeutung sein. / BARB-4, a human monoclonal IgG antibody originally isolated from a stomach cancer patient using human hybridoma technology, is a germ-line encoded and innate immunity-related antibody, as are only few other tumor-specific IgG immunoglobulins. In this study, the antigen of the BARB-4 antibody was identified and characterized. The potential target was isolated from tumor cell membrane extracts using affinity chromatography and further analyzed by a peptide mass fingerprint method (MALDI-MS). By this approach, we identified a human TAF15 protein with a molecular weight of approximately 78 kDa. In contrast to the wild-type TAF15 protein, this TAF15 variant is exclusively present in tumor cells and could not be detected in normal tissue. Immunohistochemical stainings revealed a coexistence of wild-type TAF15 and tumor-specific TAF15BARB-4 in malignant tissue suggesting a tumor-specific modification of BARB-4 antigen. Importantly, a carbohydrate as potential epitope, typical for natural IgM antibodies, could be excluded. Functional analyses demonstrated that BARB-4 inhibits proliferation of tumor cells and induces apoptosis. In addition, incubation of tumor cells with BARB-4 diminished cell adhesion and motility, which are crucial steps during formation of metastases. We applied additional assays to obtain more detailed information about the binding properties of the antibody. Specifically, immunofluorescence approaches confirmed binding of BARB-4 to the tumor cell surface and its subsequent internalisation by endocytosis. All these findings appear to be directly antibody-mediated effects. The characterization of the BARB-4 antibody and its target TAF15BARB-4 may lead to deeper insights into the function of the innate immune system. Moreover, the identification of a tumor-specific antibody offers novel opportunities for the diagnosis of malignant tumors and may foster the development of novel, antibody-based therapeutic approaches. Based on the exclusive expression of TAF15BARB-4 on tumor cell surface, BARB-4 enables the discrimination of malignant and normal tissues, and the expression of TAF15BARB-4 in various cancer entities might be the basis for the development of tumor-specific therapies. By arresting tumor cell adhesion and tumor cell motility, BARB-4 could be especially useful for the prevention of metastases in malignant tumors.

The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is currently the most infectious disease worldwide. It is caused by the human immunodeficiency virus (HIV). At the moment there are ~33.3 million people infected with HIV. Sub-Saharan Africa, with ~22.5 million people infected accounts for 68% of the global burden. In most African countries antiretroviral therapy (ART) is administered in limited-resource settings with standardised first- and second-line ART regimens. During this study I analysed the therapy-naïve population of Cape Town, South Africa and Mwanza, Tanzania for any resistance associated mutations (RAMs) against protease inhibitors, nucleoside reverse transcriptase inhibitors and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. My results indicate that HIV-1 subtype C accounts for ~95% of all circulating strains in Cape Town, South Africa. I could show that ~3.6% of the patient derived viruses had RAMs, despite patients being therapy-naïve. In Mwanza, Tanzania the HIV drug resistance (HIVDR) prevalence in the therapy-naïve population was 14.8% and significantly higher in the older population, >25 years. Therefore, the current WHO transmitted HIVDR (tHIVDR) survey that is solely focused on the transmission of HIVDR and that excludes patients over 25 years of age may result in substantial underestimation of the prevalence of HIVDR in the therapy-naïve population. Based on the prevalence rates of tHIVDR in the study populations it is recommended that all HIV-1 positive individuals undergo a genotyping resistance test before starting ART. I also characterized vif sequences from HIV-1 infected patients from Cape Town, South Africa as the Vif protein has been shown to counteract the antiretroviral activity of the cellular APOBEC3G/F cytidine deaminases. There is no selective pressure on the HIV-1 Vif protein from current ART regimens and vif sequences was used as an evolutionary control. As the majority of phenotypic resistance assays are still based on HIV-1 subtype B, I wanted to design an infectious HIV-1 subtype C proviral molecular clone that can be used for in vitro assays based on circulating strains in South Africa. Therefore, I characterized an early primary HIV-1 subtype C isolate from Cape Town, South Africa and created a new infectious subtype C proviral molecular clone (pZAC). The new pZAC virus has a significantly higher transient viral titer after transfection and replication rate than the previously published HIV-1 subtype C virus from Botswana. The optimized proviral molecular clone, pZAC could be used in future cell culture and phenotypic HIV resistance assays regarding HIV-1 subtype C. / Das erworbene Immundefektsyndrom (“acquired immunodeficiency syndrome”, AIDS), verursacht durch das Humane Immundefizienzvirus (HIV), ist derzeit die häufigste Infektionskrankheit weltweit. Zirka 33,3 Millionen Menschen sind gegenwärtig mit HIV infiziert, wobei hiervon etwa 22,5 Millionen Infizierte (68%) in den Ländern südlich der Sahara leben. In den meisten dieser Länder ist die antiretrovirale Therapie (ART) in nur zwei standardisierten Medikamentenkombinationen verfügbar. In dieser Arbeit wurden nichttherapierte Patienten aus Kapstadt (Südafrika) und Mwanza (Tansania) auf resistenzassoziierte Mutationen (RAMs) gegen Protease Inhibitoren, nukleosidische- und nichtnukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren analysiert. Meine Ergebnisse zeigten, dass in 3,6 % der Patienten RAMs gefunden wurden, obwohl diese nicht vortherapiert waren. In der Patientengruppe aus Tansania wurden sogar in 14,8 % der Patientenviren RAMs gefunden. Dieses Patientenkollektiv war signifikant älter als 25 Jahre und damit außerhalb der von der WHO beobachteten Altersgruppe. Meine Studie legt nahe, dass die WHO-Kriterien zur Überwachung der Übertragung von resistenten HIVs die Weitergabe von resistenten Viren unterschätzt, da Patienten über 25 Jahre ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden vif Sequenzen von HIV-1 infizierten Patienten aus Kapstadt charakterisiert, da bereits gezeigt wurde, dass das HIV Vif Protein die antiretrovirale Aktivität der Cytidin Deaminase APOBEC3G/F antagonisieren kann. Da jedoch keine Medikamenten induzierte Selektion auf diesen Sequenzen liegt, wurden diese zur Analyse der viralen Evolution verwendet. Phenotypische Resistenzanalysen basieren gegenwärtig meist auf dem HIV Subtyp B, jedoch sind die meisten Infizierten in Südafrika und sogar weltweit mit Subtyp C infiziert. Deshalb war es ein Ziel dieser Arbeit einen proviralen HIV Subtyp C Plasmid zu entwickeln. Dazu wurde das Virus aus einem frühen HIV Subtyp C Isolat kloniert. Das hier neu klonierte Virus (HIV-ZAC) zeigt sowohl einen höheren viralen Titer nach der Transfektion und auch eine höhere Replikationsrate als das zuvor publizierte HIV-1 Suptyp C Virus aus Botswana. Deshalb könnte der von mir optimierte und neu charakterisierte provirale molekulare Klon, pZAC, zukünftig in der Zellkultur und bei phenotypischen HIV Resistenztests als wildtypisches HIV-1 Suptyp C Virus eingesetzt werden.

The human-bacterial pathogen interaction is a complex process that results from a prolonged evolutionary arms race in the struggle for survival. The pathogen employs virulence strategies to achieve host colonization, and the latter counteracts using defense programs. The encounter of both organisms results in drastic physiological changes leading to stress, which is an ancient response accompanying infection. Recent evidence suggests that the stress response in the host converges with the innate immune pathways and influences the outcome of infection. However, the contribution of stress and the exact mechanism(s) of its involvement in host defense remain to be elucidated. Using the model bacterial pathogen Shigella flexneri, and comparing it with the closely related pathogen Salmonella Typhimurium, this study investigated the role of host stress in the outcome of infection. Shigella infection is characterized by a pronounced pro-inflammatory response that causes intense stress in host tissues, particularly the intestinal epithelium, which constitutes the first barrier against Shigella colonization. In this study, inflammatory stress was simulated in epithelial cells by inducing oxidative stress, hypoxia, and cytokine stimulation. Shigella infection of epithelial cells exposed to such stresses was strongly inhibited at the adhesion/binding stage. This resulted from the depletion of sphingolipidrafts in the plasma membrane by the stress-activated sphingomyelinases. Interestingly, Salmonella adhesion was not affected, by virtue of its flagellar motility, which allowed the gathering of bacteria at remaining membrane rafts. Moreover, the intracellular replication of Shigella lead to a similar sphingolipid-raft depletion in the membrane across adjacent cells inhibiting extracellular bacterial invasion. Additionally, this study shows that Shigella infection interferes with the host stress granule-formation in response to stress. Interestingly, infected cells exhibited a nuclear depletion of the global RNA-binding stress-granule associated proteins TIAR and TIA-1 and their accumulation in the cytoplasm. Overall, this work investigated different aspects of the host stress-response in the defense against bacterial infection. The findings shed light on the importance of the host stress-pathways during infection, and improve the understanding of different strategies in host-pathogen interaction. / Die Interaktion von Mensch und bakteriellem Krankheitserreger ist ein komplexer Prozess, der aus dem anhaltenden evolutionären Wettrüsten im Kampf ums Überleben resultiert. Der Erreger setzt Virulenzstrategien zur Kolonisierung des Wirtes ein und dieser nutzt Verteidigungsprogramme um dem entgegenzuwirken. Die Begegnung der beiden Organismen resultiert in drastischen physiologischen Veränderungen, welche zu Stress führen, der eine klassische infektionsbegleitende Reaktion ist. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Stressantwort des Wirtes mit den Signalwegen der angeborenen Immunantwort konvergiert und im Ergebnis die Infektion beeinflusst. Jedoch bleiben die Bedeutung des Stresses und der exakte Mechanismus wie Stress an der Verteidigung des Wirtes beteiligt ist, noch zu klären. In dieser Studie dienten der bakterielle Krankheitserreger Shigella flexneri und vergleichend dazu der nah verwandte Erreger Salmonella Typhimurium als Modellorganismen, um die Rolle von Wirtszellstress für den Ausgang der Infektion zu untersuchen. Die Infektion mit Shigellen ist durch eine ausgeprägte pro-inflammatorische Reaktion gekennzeichnet. Diese versursacht in den Wirtsgeweben, insbesondere im Darmepithel, einen starken Stress, der die erste Barriere gegen die Besiedelung mit Shigellen darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde entzündlicher Stress in Epithelzellen durch die Induktion von oxidativem Stress, Hypoxie und Zytokinstimulation simuliert. Die Shigelleninfektion von Epithelzellen, die solchen Belastungen ausgesetzt waren, war stark im Adhäsions-/ Bindungsstadium gehemmt. Dies resultierte aus der Verarmung von Sphingolipidflößen in der Plasmamembran durch stressaktivierte Sphingomyelinasen. Interessanterweise wurde die Adhäsion von Salmonellen, aufgrund ihrer Flaggellenvermittelten Beweglichkeit, nicht beeinträchtigt und ermöglichte so die Ansammlung von Bakterien an den verbleibenden Membranflößen. Darüber hinaus führte die intrazelluläre Replikation von Shigellen zu einer ähnlichen Verminderung von Sphingolipidflößen in der Membran benachbarter Zellen, wodurch die extrazelluläre bakterielle Invasion gehemmt wurde. Zusätzlich zeigt diese Studie, dass eine Infektion mit Shigellen mit der Bildung von Stressgranula in der Wirtszelle interferiert. Interessanterweise zeigten infizierte Zellen eine nukleäre Depletion der globalen RNA-bindenden und Stressgranula assoziierten Proteine TIAR und TIA-1 sowie deren Akkumulation im Zytoplasma. Insgesamt untersuchte diese Arbeit verschiedene Aspekte der Stressreaktion der Wirtszelle bei der Verteidigung gegen bakterielle Infektionen. Die Ergebnisse beleuchten die Bedeutung der Stresssignalwege im Wirt während der Infektion und verbessern das Verständnis der verschiedenen Strategien in der Interaktion von Wirt und Krankheitserreger.