Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells, which display an extraordinary capacity to induce T-cell responses. Recent findings revealed that DCs also play a crucial role in the activation of natural killer (NK) cells representing important effectors in the innate immune defense against viruses and tumors. Here, we summarize various studies investigating the bidirectional crosstalk between human DCs and NK cells. In this context, it has been reported that DCs efficiently enhance CD69 expression, proliferation, interferon (IFN)-γ secretion and cytotoxic activity of NK cells. Cell membrane-associated molecules as well as soluble factors such as interleukin-12, tumor necrosis factor-α and type I IFNs contributed to DC-mediated NK cell activation. Reciprocally, the ability of human NK cells to enhance the immunostimulatory capacity of DCs was shown. Thus, NK cells promoted the maturation of DCs and markedly augmented their capacity to produce proinflammatory cytokines and to stimulate T-cell responses. The NK cell-mediated effects on DCs were dependent on cell membrane-associated molecules such as NKp30 and soluble factors such as tumor necrosis factor-α and IFN-γ. In conclusion, the reciprocal activating interaction between human DCs and NK cells may play a pivotal role in the immune defense against viruses and tumors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Macrophages are innate immune cells responsible for engulfing microbes and cell debris through phagocytosis and orchestrating immune responses to maintain homeostasis. While conducting immune surveillance over all types of organs and tissues, macrophages face inherently heterogeneous microenvironments with unique biophysical features. For instance, microglia residing in the brain, Kupffer cells living in the skin and bone osteoclasts are exposed to very distinct tissue stiffnesses. Despite the research done in the last decade clearly indicates that macrophages are sensitive to physical factors, how mechanical cues modulate their inflammatory response remains poorly understood. The present study aims at investigating how microenvironment stiffness influences the pro-inflammatory behaviour of macrophages. Besides characterising the regulatory effect on pro-inflammatory gene expression and cytokine production, this work examines the impact of stiffness on the inflammasome, one of the main macrophage signalling platforms. For this, an in vitro system based in 2D polyacrylamide hydrogels whose stiffness can be independently tuned was established. Using substrates with an elastic moduli between 0.2 and 33.1 kPa, bone marrow-derived macrophages adopted a less spread and rounder morphology on compliant compared to stiff polyacrylamide. Upon priming with lipopolysaccharide, the expression levels of the gene encoding for TNF-α were higher on more compliant hydrogels, yet there were no significant differences in the expression of other major pro-inflammatory genes. Additionally stimulating macrophages with the ionophore nigericin revealed higher secreted protein levels of IL-1β and IL-6 on compliant substrates. Interestingly, macrophages challenged on compliant polyacrylamide also displayed an enhanced formation of the NLRP3 inflammasome as well as increased levels of pyroptotic cell death. The upregulation of inflammasome assembly on compliant hydrogels was not primarily attributed to the reduced cell spreading, since spatially confining cells on micropatterns led to a decrease of inflammasome-positive cells compared to well-spread cells. Finally, interfering with actomyosin contractility diminished the differences in inflammasome formation between compliant and stiff substrates. In summary, these results show that substrate stiffness affects the pro-inflammatory response of macrophages and for the first time describe that the NLRP3 inflammasome is one of the signalling components affected by stiffness mechanosensing. The work presented here expands our understanding of how microenvironment stiffness affects macrophage behaviour and which elements of their machinery might contribute to integrate mechanical cues into the regulation of their inflammatory functions. The onset of pathological processes or the implant of foreign bodies represent immune challenges in which macrophages can face a mechanically changing environment. Therefore, a better insight on how macrophages detect and process biophysical signals could potentially provide a basis for new strategies to modulate inflammatory responses.:INTRODUCTION 1.1 Macrophage cell biology 1.1.1 The origin of macrophages 1.1.2 The macrophage: a swiss army knife 1.1.3 The macrophage pro-inflammatory response 1.2 Immunobiophysics: the force of the immune system 1.2.1 Exertion of immune cell forces 1.2.2 Immune cell mechanosensing 1.3 Cellular mechanosensing and mechanotransduction 1.3.1 Cell adhesions to the extracellular matrix 1.3.2 Nuclear mechanotransduction 1.3.3 Membrane mechanosensing elements 1.4 Macrophage mechanosensing AIMS AND SCOPE OF THE THESIS RESULTS 3.1 Morphol. characterisation of macrophages cultured on substrates of varying stiffness 3.1.1 BMDMs adhere and can be cultured on polyacrylamide hydrogels 3.1.2 Macrophage morphology is influenced by substrate stiffness 3.1.3 PEG-Hep hydrogels induce similar morphological differences as PAA substrates but do not constitute a suitable macrophage culture platform 3.1.4 Substrate stiffness affects membrane architecture 3.2 Impact of substrate stiffness on the pro-inflammatory response of macrophages 3.2.1 The morphol. differences induced by different stiffness persist after macrophage priming 3.2.2 Tuning substrate stiffness does not cause major changes in the expression of pro-inflammatory genes 3.2.3 Lower substrate stiffness upregulates the secretion of the cytokines IL-6 and IL-1β 3.2.4 Stiffer substrates diminish macrophage pyroptotic cell death 3.2.5 Compliant substrates enhance NLRP3 inflammasome formation 3.3 Investigation of macrophage mechanotransducing elements 3.3.1 Limiting cell spreading alone does not recapitulate the effects induced by stiffness on inflammasome formation 3.3.2 Actomyosin contractility may play a role in transducing the mechanical cues given by substrate stiffness DISCUSSION AND CONCLUSIONS 4.1 Compliant substrates enhance the macrophage pro-inflammatory response 4.2 Substrate stiffness influences the formation of the NLRP3 inflammasome 4.3 Exclusively altering cell spreading does not explain the differences induced by substrate stiffness 4.4 Actomyosin contractility as a potential macrophage mechanotransducer element 4.5 Potential impact of the study in the context of cancer 4.6 Potential impact of the study in the context of implant design 4.7 Conclusions of the study MATERIALS AND METHODS 5.1 Production of polyacrylamide (PAA) hydrogels 5.2 Production of polyethylenglycol-heparin (PEG-Hep) hydrogels 5.3 Mechanical characterisation of hydrogels and macrophages 5.4 Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 5.5 Fluorescence confocal microscopy 5.6 Scanning electron microscopy (SEM) 5.7 Gene expression analysis using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 5.8 Cytokine quantification assays 5.9 Cell viability assay 5.10 Culture of BMDMs on micropatterns 5.11 Optical diffraction tomography (ODT) 5.12 Statistical analysis and data visualisation APPENDIX LIST OF ACRONYMS AND ABBREVIATIONS LIST OF FIGURES BIBLIOGRAPHY ACKNOWLEDGEMENTS / Als Teil des angeborenen Immunsystems sind Makrophagen dafür verantwortlich Pathogene und Zellrückstände durch Phagozytose zu beseitigen. Sie orchestrieren Immunantworten um homöostatische Bedingungen von Organen und Geweben aufrechtzuerhalten. Dabei sind sie extrem heterogenen Mikroumgebungen ausgesetzt, welche sich jeweils durch eine einzigartige Kombination von (bio)chemischen und mechanischen Eigenschaften, vor allem Gewebesteifigkeiten, auszeichnen. Dies veranschaulichen beispielsweise im Gehirn residierende Mikroglia, Kupffer-Zellen in der Haut und Osteoklasten in Knochen. Obwohl diverse Studien aus dem letzten Jahrzehnt eindeutig zeigen, dass Makrophagen auf mechanische Signale reagieren, ist der zugrunde liegende Mechanismus, wie diese Signale eine Entzündungsreaktion modulieren, noch immer unzureichend verstanden. Die vorliegende Studie beinhaltet die systematische Untersuchung, wie die Steifigkeit der Mikroumgebung das proinflammatorische Verhalten von Makrophagen beeinflusst. Neben der Charakterisierung der regulatorischen Wirkung auf die proinflammatorische Genexpression und Zytokinproduktion untersucht diese Arbeit auch den Einfluss der Steifigkeit auf das Inflammasom; eine der wichtigsten Signalplattformen für Makrophagen. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein Zellkultursystem mit 2D-Polyacrylamid-Hydrogelen als Zellsubstrat entwickelt, bei dem das Elastizitätsmodul der Gelsubstrate gezielt eingestellt werden kann. Unter Verwendung von Substraten mit einem Elastizitätsmodul zwischen 0,2 kPa und 33,1 kPa zeigt die mikroskopische Analyse, dass aus Knochenmark stammende Makrophagen im Vergleich zu steifem Polyacrylamid eine weniger ausgebreitete und rundere Morphologie annehmen. Nach dem Primen mit Lipopolysaccharid waren die Expressionsniveaus des Gens, das für TNF-α kodiert, auf deformierbareren Hydrogelen höher, jedoch gab es keine signifikanten Unterschiede in der Expression anderer wichtiger pro-inflammatorischer Gene. Eine zusätzliche Stimulierung von Makrophagen mit dem Ionophor Nigericin bewirkte höhere sekretierte Proteinspiegel von IL-1β und IL-6 auf deformierbaren Substraten. Makrophagen, die deformierbarem Polyacrylamid ausgesetzt waren, zeigten auch eine verstärkte Bildung des NLRP3-Inflammasoms sowie ein erhöhtes Ausmaß an pyroptotischem Zelltod. Die Hochregulierung der Inflammasom-Assemblierung auf deformierbaren Hydrogelen wurde nicht primär auf die reduzierte Zellausbreitung zurückgeführt, da räumlich begrenzte Zellen auf Mikromustern zu einer Abnahme von Inflammasom-positiven Zellen im Vergleich zu stark ausgebreiteten Zellen führten. Schließlich verringerte eine Störung der Aktomyosin-Kontraktilität die Unterschiede in der Inflammasombildung zwischen deformierbaren und steifen Substraten. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Substratsteifigkeit die proinflammatorische Reaktion von Makrophagen beeinflusst und beschreiben erstmalig, dass das NLRP3-Inflammasom eine der Signalkomponenten ist, die von der zellulären Steifheitswahrnehmung beeinflusst werden. Die hier vorgestellte Arbeit erweitert unser Verständnis davon, wie die Steifigkeit der Mikroumgebung das Verhalten von Makrophagen beeinflusst und welche Elemente ihrer Maschinerie dazu beitragen könnten mechanische Signale in die Regulierung ihrer Entzündungsfunktionen zu integrieren. Das Einsetzen pathologischer Prozesse oder die Implantation von Fremdkörpern stellen Immunherausforderungen dar, bei denen Makrophagen einer sich mechanisch verändernden Umgebung ausgesetzt sein können. Daher könnte ein besserer Einblick in die Art und Weise, wie Makrophagen biophysikalische Signale erkennen und verarbeiten, möglicherweise eine Grundlage für neue Strategien zur Modulation von Entzündungsreaktionen bieten.:INTRODUCTION 1.1 Macrophage cell biology 1.1.1 The origin of macrophages 1.1.2 The macrophage: a swiss army knife 1.1.3 The macrophage pro-inflammatory response 1.2 Immunobiophysics: the force of the immune system 1.2.1 Exertion of immune cell forces 1.2.2 Immune cell mechanosensing 1.3 Cellular mechanosensing and mechanotransduction 1.3.1 Cell adhesions to the extracellular matrix 1.3.2 Nuclear mechanotransduction 1.3.3 Membrane mechanosensing elements 1.4 Macrophage mechanosensing AIMS AND SCOPE OF THE THESIS RESULTS 3.1 Morphol. characterisation of macrophages cultured on substrates of varying stiffness 3.1.1 BMDMs adhere and can be cultured on polyacrylamide hydrogels 3.1.2 Macrophage morphology is influenced by substrate stiffness 3.1.3 PEG-Hep hydrogels induce similar morphological differences as PAA substrates but do not constitute a suitable macrophage culture platform 3.1.4 Substrate stiffness affects membrane architecture 3.2 Impact of substrate stiffness on the pro-inflammatory response of macrophages 3.2.1 The morphol. differences induced by different stiffness persist after macrophage priming 3.2.2 Tuning substrate stiffness does not cause major changes in the expression of pro-inflammatory genes 3.2.3 Lower substrate stiffness upregulates the secretion of the cytokines IL-6 and IL-1β 3.2.4 Stiffer substrates diminish macrophage pyroptotic cell death 3.2.5 Compliant substrates enhance NLRP3 inflammasome formation 3.3 Investigation of macrophage mechanotransducing elements 3.3.1 Limiting cell spreading alone does not recapitulate the effects induced by stiffness on inflammasome formation 3.3.2 Actomyosin contractility may play a role in transducing the mechanical cues given by substrate stiffness DISCUSSION AND CONCLUSIONS 4.1 Compliant substrates enhance the macrophage pro-inflammatory response 4.2 Substrate stiffness influences the formation of the NLRP3 inflammasome 4.3 Exclusively altering cell spreading does not explain the differences induced by substrate stiffness 4.4 Actomyosin contractility as a potential macrophage mechanotransducer element 4.5 Potential impact of the study in the context of cancer 4.6 Potential impact of the study in the context of implant design 4.7 Conclusions of the study MATERIALS AND METHODS 5.1 Production of polyacrylamide (PAA) hydrogels 5.2 Production of polyethylenglycol-heparin (PEG-Hep) hydrogels 5.3 Mechanical characterisation of hydrogels and macrophages 5.4 Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 5.5 Fluorescence confocal microscopy 5.6 Scanning electron microscopy (SEM) 5.7 Gene expression analysis using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 5.8 Cytokine quantification assays 5.9 Cell viability assay 5.10 Culture of BMDMs on micropatterns 5.11 Optical diffraction tomography (ODT) 5.12 Statistical analysis and data visualisation APPENDIX LIST OF ACRONYMS AND ABBREVIATIONS LIST OF FIGURES BIBLIOGRAPHY ACKNOWLEDGEMENTS

Hintergrund: Schlaf ist ein streng regulierter Zustand körperlicher Ruhe und reduzierten Bewusstseins, der evolutionär im ganzen Tierreich konserviert ist. Schlafmangel ist in der modernen Gesellschaft weit verbreitet und betrifft 10 – 30 % der Erwachsenen. Dies stellt ein ernstes gesundheitliches Problem dar, da Schlafmangel mit vielen Krankheiten assoziiert ist, darunter Depressionen, Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Umgekehrt beeinflussen auch Krankheiten und das Immunsystem das Schlafverhalten. Trotz der fundamentalen Rolle dieser Wechselbeziehung sind grundlegende molekulare Mechanismen, die Funktionen des Immunsystems und Schlafkontrolle verbinden, bisher kaum verstanden. Da die Schlafregulation in Säugetieren sehr komplex ist, ist es sinnvoll konservierte Mechanismen zuerst in einfacheren Modellorganismen zu untersuchen. Der Rundwurm C. elegans ist ein solcher etablierter, simpler und vielseitiger Modellorganismus für die Schlafforschung. Er schläft sowohl im Rhythmus seiner Larvenentwicklung immer jeweils während des Lethargus kurz vor der Häutung, als auch nach besonderem Stress, wie zum Beispiel Hunger oder Hitze. C. elegans besitzt ein invariantes Nervensystem, in dem eine rapide Depolarisation des einzelnen RIS-Interneurons genügt, um Schlaf zu induzieren. Eine Mutation des AP2 Transkriptionsfaktors APTF-1 verhindert die Expression von FLP-11, dem schlafinduzierenden Neuropeptid von RIS. Dies führt praktisch zu völliger Schlaflosigkeit, die in C. elegans in der Regel nicht tödlich ist, und deshalb ein nützliches Modell für genetisch-chronischen Schlafmangel darstellt. Unser Labor fand heraus, dass eine Gain-of-function-Mutation in der Kollagenase NAS-38 über Signalwege der angeborenen Immunität und RIS-Aktivierung zu vermehrtem Schlaf während des Lethargus führt. Gleichzeitig wird dabei die Expression einer ganzen Familie antimikrobieller Peptide (AMP) hochreguliert. Derselbe Signalweg, einschließlich der AMP, sowie das Schlafverhalten werden auch durch Verletzungen induziert. Interessanterweise sterben nicht-schlafende Würmer nach einer Verletzung häufiger. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass AMP als Signalmoleküle fungieren könnten, die Schlaf als Teil einer globalen Schutzreaktion vom peripheren Gewebe zum Nervensystem signalisieren. Für diese Hypothese fehlten bisher jedoch die Beweise. Fragestellungen und Hypothesen: Mein Ziel war es, den molekularen Mechanismus zu entschlüsseln, durch den verschiedene Reize der angeborenen Immunität, das heißt NAS-38 sowie epidermale Verletzungen, Schlaf induzieren. Zwei Fragen habe ich hierbei im Speziellen adressiert: Welche Domänen des NAS 38-Proteins sind an der Schlafregulation beteiligt? Da die Astacin-Domäne als aktive Proteasedomäne von NAS-38 angesehen wird, erwartete ich eine Schlüsselrolle dieser Domäne auch in der Schlafinduktion. Zweitens, welche Rolle spielen AMP bei der Signalisierung von immunitätsinduziertem Schlaf? Da gezeigt wurde, dass AMP während des NAS-38 Schlafes und auch nach Verwundung hochreguliert sind, erwartete ich, dass AMP an der Signalisierung von Schlaf von der Epidermis zum Nervensystem beteiligt sind. In einem zweiten Schritt untersuchte ich die molekularen Mechanismen, die den Vorteilen von Schlaf für das Überleben von Verletzungen zugrunde liegen. Auch hier habe ich speziell zwei Fragestellungen untersucht: Verändert genetischer Schlafentzug die transkriptionelle Reaktion auf epidermale Verletzungen? Da Schlaf für viele fundamentale Prozesse wichtig ist und Schlaflosigkeit die Sterblichkeit nach Verletzungen erhöht, vermutete ich, dass genetischer Schlafentzug die transkriptionelle Reaktion auf Verletzungen beeinträchtigt. Zweitens, ist Schlaf wichtig für die Entwicklung von Robustheit, um im Falle einer Verletzung weniger Schaden zu nehmen? Während der Larvenentwicklung fällt die Cuticula-Synthese mit Schlaf zeitlich zusammen. Daher stellte ich die Hypothese auf, dass Schlafentzug die korrekte Bildung einer Cuticula beeinträchtigt. Methoden: Zur Analyse der Signalmechanismen, durch die sowohl NAS-38 als auch Verletzungen Schlaf induzieren, filmte ich das Schlafverhalten von C. elegans mittels Langzeit-Bildgebung in Agarose-Mikrokammern. So führte ich eine Struktur-Funktions-Analyse mit verschiedenen nas-38 Mutanten durch, in denen jeweils eine andere NAS-38 Domäne deletiert war. Darüber hinaus testete ich verschiedene Suppressoren für immunvermittelten Schlaf, der durch NAS 38 oder Verletzungen induziert war. Die Redundanz des Suppressionseffektes der verschiedenen Mitglieder der AMP-Familie auf immunvermittelten Schlaf testete ich, indem ich den Suppressionsphänotyp einer CRISPR/Cas9-editierten Multi-Knockout-Mutante analysierte, in der insgesamt 19 AMP deletiert waren. Um Effektoren zu identifizieren, die den AMP nachgeschaltet sind, induzierte ich Schlaf durch Überexpression des AMP NLP 29 unter der Kontrolle eines Hitzeschock-Promotors und analysierte die Sschlafsuppression durch verschiedene Knockout-Mutanten. Im zweiten Projekt beschäftigte ich mich mit der Frage, wie genau Schlaf das Überleben nach Verletzungen unterstützt. Ich verglich die Expression von literaturbekannten Reportern für verschiedene Aspekte der Verwundungsreaktion mittels Langzeit-Fluoreszenzmikroskopie im Wildtyp sowie dem Modell für chronisch-genetischen Schlafmangel. Darüber hinaus habe ich die Transkriptome zwischen jeweils adulten verwundeten und unverwundeten Wildtypen und schlaflosen Mutanten verglichen. Um die Struktur der Cuticula des Wildtyps und der schlaflosen Mutante zu vergleichen, analysierte ich außerdem rasterelektronen-mikroskopische Aufnahmen. Ergebnisse: Im ersten Projekt konnte ich zeigen, dass NAS-38 Schlaf durch seine Astacin-Domäne verlängert. Dieser Prozess wird moderiert durch die TSP-1-Domäne. Weiterhin konnte ich zeigen, dass viele AMP redundant wirken um immunvermittelten Schlaf, verursacht durch NAS-38 oder Verletzungen, zu signalisieren. Ich konnte zeigen, dass das AMP NLP-29 über den Neuropeptidrezeptor NPR-12 wirkt. Dieser kann NLP-29-induzierten Schlaf vermitteln, wenn er in einem neuronalen Netzwerk exprimiert wird, welches nachweislich RIS aktiviert. Interessanterweise fand ich außerdem heraus, dass für NLP-29-vermittelten Schlaf der EGFR Signalweg notwendig ist. Im zweiten Projekt entdeckte ich, dass Schlaflosigkeit die transkriptionelle Reaktion auf Verletzungen nicht dramatisch verändert. Allerdings ist das Transkriptionsprofil bereits in der unverletzten schlaflosen Mutante verändert. Dies betraf unter anderem eine Gruppe oszillierender Gene, die Cuticula-assoziierte Proteine codieren, und deren Expression normalerweise ihren Höhepunkt gegen Ende des Lethargus erreicht. Da angenommen wird, dass der Zeitpunkt der Kollagenexpression entscheidend für eine fehlerfreie Cuticula-Bildung ist, analysierte ich die Cuticula der schlaflosen Mutante. Ich konnte zeigen, dass die Cuticula des adulten Tieres tatsächlich einen strukturellen Defekt aufweist. Dieser betrifft speziell Furchen in der Region nahe den Alae und könnte möglicherweise die Strapazierfähigkeit der Cuticula gegenüber bestimmten Belastungen verringern. Daher könnte Schlaf erforderlich sein, Robustheit in Form einer strukturierten Cuticula zu fördern. Schlussfolgerungen: In diesem Dissertationsprojekt vollendete ich die Charakterisierung eines neuentdeckten Mechanismus in C. elegans, durch den Verwundungen Schlaf als Teil der Immunantwort aus der Peripherie zum Nervensystem signalisieren. Ich konnte zeigen, dass AMP gewebeübergreifend Signale von der Epidermis an ein neuronales Netz vermitteln, welches wiederum RIS aktiviert und dadurch Schlaf induziert. Da Komponenten dieses Signalweges konserviert sind, könnten AMP auch in anderen Tieren, einschließlich des Menschen, Schlaf zur Genesung fördern. Darüber hinaus habe ich die Grundlagen für die Analyse molekularer Mechanismen geschaffen, die den essentiellen Funktionen des Schlafes für Heilung und Überleben zugrunde liegen. Obwohl Schlaflosigkeit die transkriptionelle Reaktion auf Verletzungen nicht drastisch zu verändern scheint, deuten meine Ergebnisse auf eine Rolle des Schlafes bei der richtigen Cuticula-Bildung und möglicherweise sogar auf eine vielfältigere Rolle bei der zeitlichen Regulierung der Genexpression hin.:Summary I Zusammenfassung IV Contents VII List of Figures XII List of Tables XIV Abbreviations XV 1. Introduction 1 1.1. Sleep is fascinating 1 1.1.1. The origin and basic features of sleep 1 1.1.2. Regulation of sleep in higher animals 3 1.1.2.1. Neuronal control of sleep 3 1.1.2.2. Molecular control of sleep 5 1.1.3. The functions of sleep 6 1.2. The immune system and its relationship to sleep 7 1.3. Wound healing and its relationship to sleep 10 1.4. Caenorhabditis elegans is a well-studied model organism 12 1.4.1. Sleep in C. elegans 15 1.4.2. The C. elegans cuticle 18 1.4.3. Immunity in C. elegans 19 1.4.4. Wound healing response in C. elegans 22 2. Previous results 25 2.1. A strong gain-of-function mutation in the astacin metallo-proteinase NAS 38 increases lethargus duration and movement quiescence in C. elegans 25 2.2. NAS-38 increases sleep mostly through the RIS neuron 25 2.3. NAS-38 is expressed in the epidermis and oscillates with the developmental rhythm 25 2.4. nas-38(ok3407) acts via innate immunity pathways to increase lethargus duration and AMP expression 27 2.5. Overexpression of AMPs induces RIS dependent quiescence 30 2.6. Epidermal wounding induces RIS-dependent sleep, which is beneficial for survival 31 3. Thesis Aims 34 3.1. Aim 1 – Characterizing the molecular mechanism through which NAS-38, innate immunity, and wounding induce sleep 34 3.2. Aim 2 – Analyzing how sleep promotes survival after wounding 35 4. Materials and Methods 36 4.1. C. elegans maintenance 36 4.2. C. elegans crossing and genotyping 41 4.3. Creation of transgenic animals 45 4.3.1. Creating the npr-12 rescue in nmr-1 expressing neurons 45 4.3.2. Microparticle bombardment 45 4.3.3. CRISPR/Cas9 system 46 4.4. Synchronizing worm cultures by hypochlorite treatment 48 4.5. Imaging 49 4.5.1. Imaging setups 49 4.5.2. DIC Imaging of worm development, lethargus, and sleep behavior 50 4.5.2.1. Imaging of heterozygous mutants 50 4.5.3. DIC imaging in the temperature control device 51 4.5.4. Fluorescent imaging experiments 51 4.5.4.1. nas-38p::d1GFP and nlp-29p::GFP during L1 development 51 4.5.4.2. nlp-29p::GFP in L4 larvae 52 4.5.4.3. nlp-29p::GFP after heat shock-induced lin-3 overexpression 52 4.5.4.4. Imaging fluorescent markers in (wounded) young adults 52 4.5.4.5. Functional Ca2+ imaging in young adults 52 4.5.4.6. Fluorescence imaging across the whole developmental time 54 4.5.4.7. Nuclear decompaction assays 55 4.5.4.8. Transcription factor localization with spinning disc confocal microscopy 55 4.5.4.9. Imaging DPY-13::mKate2 in young adults 56 4.6. Image analysis 56 4.6.1. Assessment of developmental time and lethargus detection 56 4.6.2. Sleep detection in DIC mode 56 4.6.3. Analyzing functional Ca2+ images 57 4.6.4. Fluorescent reporter analysis during long-term imaging 57 4.7. RNAi-by-feeding 58 4.8. Transcriptome analysis 59 4.8.1. Analysis of the nas-38(ok3407) transcriptome 59 4.8.2. Analysis of the wounding transcriptome 59 4.9. Epidermal wounding 62 4.9.1. Laser wounding 62 4.9.2. Needle wounding 62 4.9.3. Survival assay 63 4.10. Scanning Electron Microscopy (SEM) 63 4.11. Histamine-inducible hyperpolarization of RIS 64 4.12. Cuticle integrity test with Sodium hypochlorite 64 4.13. NPR-12 receptor modeling 64 4.14. Quantification and statistical analysis 65 5. Results 66 5.1. Aim 1 – Characterizing the pathway through which NAS 38, wounding and innate immunity induce sleep 66 5.1.1. The loss of function mutation nas-38(tm2655) shows the opposite phenotype to the gain of function mutation nas-38(ok3407) 66 5.1.2. nas-38 gain-of-function mutants act through their astacin protease domain and are semi-dominant 66 5.1.3. Transcriptome analysis of nas-38(ok3407) reveals upregulation of genes associated with secretion, innate immunity and cuticle formation 69 5.1.4. nas-38(knu568) increased movement quiescence can be suppressed by mutations of innate immunity pathways 72 5.1.5. Multiple NLPs and CNCs act in parallel to mediate nas-38(ok3407) induced sleep 75 5.1.6. Wounding-induced sleep requires RIS, ALA, EGFR and immune signaling 77 5.1.7. NLP-29 signals via the NPR-12 receptor in neurons upstream of RIS 80 5.1.8. NLP-29 requires neuronal EGFR signaling to induce sleep 81 5.1.9. Simple in silico models suggest that many different NLPs can bind to NPR-12 83 5.1.10. AMPs contribute to the survival after wounding 85 5.2. Aim 2 – Identifying the advantages sleep provides that help to survive harmful conditions 87 5.2.1. Wounding decreases the lifespan in the wild type and the aptf 1(gk794) mutant 87 5.2.2. Histamine-inducible RIS hyperpolarization suppresses wounding sleep 87 5.2.3. Genetic sleep deprivation decreases translocation of DAF-16 into the nucleus immediately after wounding 89 5.2.4. Genetic sleep deprivation hardly changes the transcriptional wounding response 95 5.2.5. Genetic sleep deprivation and wounding increase nuclear PHA 4 101 5.2.6. Oscillating genes and genes associated with the cuticle and the unfolded protein response are upregulated in young adult aptf 1(gk794) mutants 106 5.2.7. Genetic sleep deprivation leads to a malformation of cuticular furrows 109 5.2.8. Genetic sleep deprivation leads to an increased transcription of lethargus specific oscillating genes in young adults 114 5.2.9. Genetic sleep deprivation does not significantly affect development time or body size 120 5.2.10. Expression of fluorescent reporters of oscillating genes is not phase-shifted in the aptf-1(gk794) mutant 122 6. Discussion and Outlook 128 6.1. NAS-38 acts through its astacin domain to increase sleep via innate immunity pathways 128 6.2. NAS-38 during larval lethargus and epidermal wounding in the adult signal sleep via many AMPs as part of a peripheral immune response 130 6.3. Epidermal AMPs activate a neuronal circuit to induce sleep 131 6.4. Genetically sleep deprived worms can mount a proper wounding response in many ways, except for DAF-16/FOXO regulation 132 6.5. Genetic sleep deprivation alters cuticle formation 135 6.6. The role of PHA-4/FOXA in genetically sleep-deprived animals 137 6.7. Conclusion 139 7. References 140 8. Acknowledgements 163 9. Appendix 166 9.1. Standard reagents 166 9.2. Sequence summary of PHX3754 167 9.3. MATLAB script to analyze the intensity of fluorescent reporters over time 171 9.4. Permissions to reprint figures 174 9.5. Experimental author contributions 175 9.6. Predicted interactions between the NPR-12 receptor and peptides of the nlp and cnc families 176 9.7. Overlap of the adult wounding transcriptome with other data sets 179 9.8. Curriculum Vitae – Marina Patricia Sinner 181 / Background: Sleep is a tightly regulated state of behavioral quiescence and reduced consciousness, which is conserved throughout the animal kingdom. In modern societies 10 – 30 % of the adult population suffer from insufficient sleep, which poses a serious health problem as sleep deprivation is associated with a variety of diseases including depression, cancer, and cardiovascular diseases. Conversely, sickness and the immune system also influence sleep patterns. Despite the important role of this interrelationship between sleep and immunity, basic molecular mechanisms that link both vital functions are only poorly understood yet. As sleep regulation is complex in mammals and is thus difficult to address experimentally, it is reasonable to investigate its basic conserved mechanisms in simpler models first. The nematode C. elegans is such a well-established, simple, and powerful model organism for sleep research. It displays stress-induced sleep, for example upon starvation or heat shock, but also developmentally-timed sleep during lethargus prior to each larval molt. C. elegans possesses an invariant nervous system in which rapid depolarization of the single RIS interneuron is sufficient to induce sleep. Mutation of the AP2 transcription factor APTF 1 deprives RIS of its sleep-inducing neuropeptide FLP-11 and thus virtually abolishes sleep. This is not per se lethal in C. elegans, thereby presenting a powerful model for genetic sleep deprivation. Our lab found that a gain-of-function mutation in the collagenase NAS-38 strongly increases RIS-dependent sleep during lethargus with a concomitant upregulation of a large family of antimicrobial peptides (AMPs) via immunity pathways. Epidermal wounding also triggers AMP expression via immune signaling and induces sleep in the adult worm. Moreover, genetic sleep deprivation increases mortality upon epidermal injury. Together, this suggests AMPs to act as somnogens from peripheral tissues to the nervous system as part of a protective response. This hypothesis, however, was hitherto lacking final evidence and pathway components. Research questions and hypotheses: I aimed to characterize the molecular mechanism by which separate triggers of innate immunity, i. e. NAS-38 and wounding, induce sleep. I specifically addressed two questions: Firstly, which domains of the NAS-38 protein are involved in sleep regulation? As the astacin domain is predicted to be the active protease domain of NAS-38, I expected a role for it also in sleep induction by NAS-38. Secondly, what is the role of AMPs in signaling immunity-induced sleep? As they have been shown to be upregulated during times of increased sleep in the nas-38 mutant and after wounding, I expected AMPs to be involved in signaling sleep from the epidermis to the nervous system. In a second step, I investigated the molecular mechanisms underlying the benefits of sleep for surviving injury. Again, I addressed two questions: Firstly, does genetic sleep deprivation alter the transcriptional wounding response? As sleep has a role in many fundamental processes and sleeplessness increases mortality upon wounding, I hypothesized that genetic sleep deprivation impairs wounding-induced changes of transcriptional activity. Secondly, does sleep help building robustness before encountering injury? During larval development the synthesis of a new cuticle coincides with sleep. Thus, I hypothesized that genetic sleep deprivation impairs proper cuticle formation. Methods: To dissect the signaling mechanisms by which NAS-38 and wounding induced sleep, I followed sleep behavior of C. elegans by long-term imaging in agarose microchambers. I performed a structure-function analysis with different nas-38 mutants, each carrying a deletion of a different domain. Moreover, I screened for suppressors of sleep induced by NAS 38 or wounding. To test for redundancy of the AMP family, I investigated the suppression-phenotype of a CRISPR/Cas9 edited multi-knockout mutant lacking 19 AMPs. To identify downstream effectors of the AMP NLP 29, I induced sleep by overexpressing NLP 29 from a heat-shock promoter and analyzed the suppression-phenotype of different knockout mutants. For the second project, I addressed the question how sleep aids recovery from injury. I followed fluorescent reporters of previously described wounding response pathways by fluorescent long-term imaging in wild-type and genetically sleep-deprived animals. Moreover, I compared the transcriptomes of adult wild-type and genetically sleep-deprived worms both wounded and unwounded. To investigate the structure of the cuticle, I analyzed scanning electron microscopy images. Results: In the first project, I could show that NAS-38 indeed increases sleep via its astacin domain in a process that is modulated by the TSP-1 domain. Moreover, I could show that many AMPs act redundantly in mediating immunity-induced sleep downstream of NAS-38 and after wounding. I demonstrated that the AMP NLP-29 signals sleep via the neuropeptide receptor NPR 12. This receptor can mediate sleep when it is specifically expressed in command interneurons of a circuit that has been shown to activate RIS. Interestingly, I also found that EGFR signaling is required to mediate NLP-29-induced sleep. In the second project, I found that sleeplessness does not dramatically alter the transcriptional wounding response. However, I could show that transcription is altered already in the unwounded non-sleeping mutant. This affects, among others, a specific subset of oscillating collagen-coding genes, whose expression usually peaks around the end of lethargus. As the timing of expression of collagens is thought to be highly important for proper cuticle formation, I characterized the cuticle of the aptf-1(gk794) mutant. I could show that young adult aptf 1(gk794) worms indeed have a structural defect affecting cuticular furrows in the region adjacent to the alae, which could potentially decrease specific aspects of resilience of the cuticle. Thus, sleep might be required to build robustness in the form of a properly structured cuticle. Conclusion: In this PhD project, I completed the characterization of a novel mechanism by which wounding signals sleep from the periphery to the nervous system as part of the immune response in C. elegans. I could show that AMPs act as cross-tissue signals from the epidermis to a neuronal RIS-controlling circuit that ultimately leads to sleep induction. As components of this molecular pathway are highly conserved, AMPs might also induce sleep to promote recovery from injury in other organisms, including humans. Moreover, I laid the foundations for dissecting the molecular mechanisms behind the functions of sleep for healing and survival. Even though the disability to sleep did not seem to drastically change the transcriptional response to wounding, my results indicate a role for sleep in proper cuticle formation in C. elegans and potentially even a broader role in the regulation of precise gene expression timing.:Summary I Zusammenfassung IV Contents VII List of Figures XII List of Tables XIV Abbreviations XV 1. Introduction 1 1.1. Sleep is fascinating 1 1.1.1. The origin and basic features of sleep 1 1.1.2. Regulation of sleep in higher animals 3 1.1.2.1. Neuronal control of sleep 3 1.1.2.2. Molecular control of sleep 5 1.1.3. The functions of sleep 6 1.2. The immune system and its relationship to sleep 7 1.3. Wound healing and its relationship to sleep 10 1.4. Caenorhabditis elegans is a well-studied model organism 12 1.4.1. Sleep in C. elegans 15 1.4.2. The C. elegans cuticle 18 1.4.3. Immunity in C. elegans 19 1.4.4. Wound healing response in C. elegans 22 2. Previous results 25 2.1. A strong gain-of-function mutation in the astacin metallo-proteinase NAS 38 increases lethargus duration and movement quiescence in C. elegans 25 2.2. NAS-38 increases sleep mostly through the RIS neuron 25 2.3. NAS-38 is expressed in the epidermis and oscillates with the developmental rhythm 25 2.4. nas-38(ok3407) acts via innate immunity pathways to increase lethargus duration and AMP expression 27 2.5. Overexpression of AMPs induces RIS dependent quiescence 30 2.6. Epidermal wounding induces RIS-dependent sleep, which is beneficial for survival 31 3. Thesis Aims 34 3.1. Aim 1 – Characterizing the molecular mechanism through which NAS-38, innate immunity, and wounding induce sleep 34 3.2. Aim 2 – Analyzing how sleep promotes survival after wounding 35 4. Materials and Methods 36 4.1. C. elegans maintenance 36 4.2. C. elegans crossing and genotyping 41 4.3. Creation of transgenic animals 45 4.3.1. Creating the npr-12 rescue in nmr-1 expressing neurons 45 4.3.2. Microparticle bombardment 45 4.3.3. CRISPR/Cas9 system 46 4.4. Synchronizing worm cultures by hypochlorite treatment 48 4.5. Imaging 49 4.5.1. Imaging setups 49 4.5.2. DIC Imaging of worm development, lethargus, and sleep behavior 50 4.5.2.1. Imaging of heterozygous mutants 50 4.5.3. DIC imaging in the temperature control device 51 4.5.4. Fluorescent imaging experiments 51 4.5.4.1. nas-38p::d1GFP and nlp-29p::GFP during L1 development 51 4.5.4.2. nlp-29p::GFP in L4 larvae 52 4.5.4.3. nlp-29p::GFP after heat shock-induced lin-3 overexpression 52 4.5.4.4. Imaging fluorescent markers in (wounded) young adults 52 4.5.4.5. Functional Ca2+ imaging in young adults 52 4.5.4.6. Fluorescence imaging across the whole developmental time 54 4.5.4.7. Nuclear decompaction assays 55 4.5.4.8. Transcription factor localization with spinning disc confocal microscopy 55 4.5.4.9. Imaging DPY-13::mKate2 in young adults 56 4.6. Image analysis 56 4.6.1. Assessment of developmental time and lethargus detection 56 4.6.2. Sleep detection in DIC mode 56 4.6.3. Analyzing functional Ca2+ images 57 4.6.4. Fluorescent reporter analysis during long-term imaging 57 4.7. RNAi-by-feeding 58 4.8. Transcriptome analysis 59 4.8.1. Analysis of the nas-38(ok3407) transcriptome 59 4.8.2. Analysis of the wounding transcriptome 59 4.9. Epidermal wounding 62 4.9.1. Laser wounding 62 4.9.2. Needle wounding 62 4.9.3. Survival assay 63 4.10. Scanning Electron Microscopy (SEM) 63 4.11. Histamine-inducible hyperpolarization of RIS 64 4.12. Cuticle integrity test with Sodium hypochlorite 64 4.13. NPR-12 receptor modeling 64 4.14. Quantification and statistical analysis 65 5. Results 66 5.1. Aim 1 – Characterizing the pathway through which NAS 38, wounding and innate immunity induce sleep 66 5.1.1. The loss of function mutation nas-38(tm2655) shows the opposite phenotype to the gain of function mutation nas-38(ok3407) 66 5.1.2. nas-38 gain-of-function mutants act through their astacin protease domain and are semi-dominant 66 5.1.3. Transcriptome analysis of nas-38(ok3407) reveals upregulation of genes associated with secretion, innate immunity and cuticle formation 69 5.1.4. nas-38(knu568) increased movement quiescence can be suppressed by mutations of innate immunity pathways 72 5.1.5. Multiple NLPs and CNCs act in parallel to mediate nas-38(ok3407) induced sleep 75 5.1.6. Wounding-induced sleep requires RIS, ALA, EGFR and immune signaling 77 5.1.7. NLP-29 signals via the NPR-12 receptor in neurons upstream of RIS 80 5.1.8. NLP-29 requires neuronal EGFR signaling to induce sleep 81 5.1.9. Simple in silico models suggest that many different NLPs can bind to NPR-12 83 5.1.10. AMPs contribute to the survival after wounding 85 5.2. Aim 2 – Identifying the advantages sleep provides that help to survive harmful conditions 87 5.2.1. Wounding decreases the lifespan in the wild type and the aptf 1(gk794) mutant 87 5.2.2. Histamine-inducible RIS hyperpolarization suppresses wounding sleep 87 5.2.3. Genetic sleep deprivation decreases translocation of DAF-16 into the nucleus immediately after wounding 89 5.2.4. Genetic sleep deprivation hardly changes the transcriptional wounding response 95 5.2.5. Genetic sleep deprivation and wounding increase nuclear PHA 4 101 5.2.6. Oscillating genes and genes associated with the cuticle and the unfolded protein response are upregulated in young adult aptf 1(gk794) mutants 106 5.2.7. Genetic sleep deprivation leads to a malformation of cuticular furrows 109 5.2.8. Genetic sleep deprivation leads to an increased transcription of lethargus specific oscillating genes in young adults 114 5.2.9. Genetic sleep deprivation does not significantly affect development time or body size 120 5.2.10. Expression of fluorescent reporters of oscillating genes is not phase-shifted in the aptf-1(gk794) mutant 122 6. Discussion and Outlook 128 6.1. NAS-38 acts through its astacin domain to increase sleep via innate immunity pathways 128 6.2. NAS-38 during larval lethargus and epidermal wounding in the adult signal sleep via many AMPs as part of a peripheral immune response 130 6.3. Epidermal AMPs activate a neuronal circuit to induce sleep 131 6.4. Genetically sleep deprived worms can mount a proper wounding response in many ways, except for DAF-16/FOXO regulation 132 6.5. Genetic sleep deprivation alters cuticle formation 135 6.6. The role of PHA-4/FOXA in genetically sleep-deprived animals 137 6.7. Conclusion 139 7. References 140 8. Acknowledgements 163 9. Appendix 166 9.1. Standard reagents 166 9.2. Sequence summary of PHX3754 167 9.3. MATLAB script to analyze the intensity of fluorescent reporters over time 171 9.4. Permissions to reprint figures 174 9.5. Experimental author contributions 175 9.6. Predicted interactions between the NPR-12 receptor and peptides of the nlp and cnc families 176 9.7. Overlap of the adult wounding transcriptome with other data sets 179 9.8. Curriculum Vitae – Marina Patricia Sinner 181

Hematopoiesis in the adult organism is maintained by a complex, hierarchically organized cascade of differentiating cells that ultimately originate from adult hematopoietic stem cells (HSCs). HSCs have been extensively studied in perturbative settings (e.g transplantation assays), which are well suited for exploring cell potential but tell very little about cell behaviour in a physiological state. Novel \textit{in situ} techniques have made it possible to observe hematopoiesis in its natural environment, yet many questions about native HSC behaviour remain controversial. It is yet unclear whether and to what extent HSCs contribute to steady-state blood production, and whether they represent a reserve population that can be activated upon emergency. As, to date, common definitions of HSCs comprise cells of heterogeneous function, incoherent results are likely linked by another fundamental question: what is the identity of the HSC population residing on the apex of the hematopoietic hierarchy? To answer these questions is essential to gain a deeper understanding of fatal human diseases like leukemia or aplastic anemia. We describe an integrative approach combining non-invasive experimental methods with mathematical inference to uncover underlying pathways and differentiation patterns of steady state hematopoiesis. By this, we identify a population of Sca-1\textsuperscript{hi} CD201(EPCR)\textsuperscript{hi} HSCs as the hithertho elusive apex population, and show that they contribute marginally, but continuously, to native steady-state hematopoiesis. Further, we clarify the architecture of a shortcut route of thrombopoiesis, which emanates directly from HSCs and links them trough a previously undefined CD48\textsuperscript{-/low} megakaryocyte progenitor population directly to platelets. Finally, we provide an extensive analysis of the dynamic label propagation and proliferation behaviour of hematopoietic stem and progenitor cells in prototypical stress situations mimicking blood loss, infection and inflammation. We find that apex stem cells do not directly contribute to emergency hematopoiesis and are only activated upon severe myeloablation and chronic inflammation. Further, innate immune training did not influence HSC contribution in response to reoccurring stimulation. In sum, we demonstrate that primitive HSCs do neither represent a major contributor to steady-state blood production, nor a reservoir for emergency supply. We thus question current dogma of hematopoiesis, and argue that the primary function of HSCs in the adult organism remains yet to be discovered.:Contents Abstract iv Zusammenfassung vii List of Figures xii List of Tables xiii List of Abbreviations xv 1 Introduction 1 1.1 Hematopoiesis and the hematopoietic system 1 1.1.1 Developmental origins 1 1.1.2 The hematopoietic hierarchy 3 1.2 Hematopoietic stem cells 5 1.2.1 Characteristics of hematopoietic stem cells 7 1.2.2 Identification of hematopoietic stem and progenitor cells 7 1.2.3 HSC heterogeneity 11 1.3 Novel genetic tools to analyse native hematopoiesis 12 1.3.1 Conditional gene targeting 12 1.4 Hematopoietic stem cell behaviour in adult steady-state hematopoiesis 15 1.4.1 Models of native Hematopoiesis 16 1.4.2 Models of HSC quiescence 23 1.4.3 Aged hematopoiesis 25 1.5 Hematopoietic stem cell behaviour in stress response 26 1.5.1 Inflammation and Infection 27 1.5.2 Myeloablation 30 1.5.3 Innate immune training 32 2 Aim of Thesis 35 3 Material and Methods 37 3.1 Materials 37 3.1.1 Antibodies 37 3.1.2 Buffer and Solutions 38 3.1.3 Chemicals and Reagents 39 3.1.4 Cultivation Media 40 3.1.5 Kit Systems 41 3.1.6 Software 41 3.2 Mice 42 3.2.1 Animal housing and husbandry 42 3.2.2 Mouse strains 42 3.3 Genotyping of mice 43 3.4 Treatments of mice 46 3.4.1 Reporter induction 46 3.4.2 Hematopoietic stress induction 46 3.5 Hemograms 48 3.6 Transplantation and in vivo repopulation assays 49 3.6.1 Preconditioning and transplantation of recipients 49 3.6.2 Competitive repopulation assay 50 3.6.3 Limiting dilution assay 50 3.6.4 Transplantation into sublethally irradiated hosts 51 3.7 Cell preparation for transplantation and flow cytometry 51 3.7.1 Bone marrow 51 3.7.2 Splenocytes 51 3.7.3 Peripheral blood 51 3.7.4 Peritoneal cells 52 3.7.5 Cell depletion by magnetic activated cell sorting (MACS) 52 3.8 Flow Cytometry 53 3.8.1 Cell staining 54 3.8.2 Cell counting 55 3.8.3 Cell identification and gating 55 3.8.4 Chimerism analysis 57 3.8.5 Cell sorting 58 3.9 Cytokine detection assay 58 3.10 in vitro single cell expansion assay 59 3.11 Sequencing 61 3.11.1 Single cell RNA sequencing 61 3.11.2 Bulk RNA sequencing 62 3.11.3 Single cell and bulk transcriptome analysis 62 3.12 Mathematical modelling 62 3.13 Data Normalization 63 3.14 Statistical Analysis 64 4 Results 67 4.1 Identification of an apex HSC population 67 4.1.1 Fgd5 Cre-System preferentially labels primitive HSCs 68 4.1.2 ES HSCs reside at the top of the hierarchy 71 4.2 A combination of proliferation and differentiation modelling uncovers lineage trajectories 76 4.2.1 Iterative modelling reveals subtle, but continuous contribution of HSC to Steady state hematopoiesis 77 4.2.2 The myeloid lineage diverges within phenotypic HSCs 80 4.3 Fate mapping uncovers an alternative pathway of thrombopoiesis 82 4.3.1 CD201-/lo Sca-1lo HSCs feed thrombopoiesis via CD48-/lo MkPs 82 4.3.2 CD48-stratified MkP subsets display variable thrombopoietic potential 88 4.3.3 Thrombopoietin signalling enhances platelet production via the direct pathway 92 4.4 Ageing modulates the dynamics of fate mapping 95 4.5 HSCs in times of crisis: Contribution to stress recovery 99 4.5.1 Faithful reporters are necessary to study HSPC behaviour during stress hematopoiesis 100 4.5.2 Severe myeloablation provokes HSC activation 105 4.5.3 Inflammation-induced emergency hematopoiesis only mildly amplifies HSC activity 107 4.5.4 Innate immune training does not alter HSC proliferation and differentiation 113 4.5.5 Compensation of blood cell loss is achieved without HSC contribution 118 4.5.6 Emergency hematopoiesis proceeds without activation of primitive Hematopoietic stem cells (HSCs) 120 5 Discussion 123 5.1 Labels matter: What is a true HSC? 123 5.1.1 Fgd5ZsGreen:CreERT2R26LSL-tdRFP fate mapping preferentially labels primitive HSCs 124 5.1.2 ES HSCs reside at the top of the hierarchy 126 5.1.3 Subtle, but continuous contribution of HSCs to steady state hematopoiesis 127 5.1.4 The myeloid lineage diverges within phenotypic HSCs 130 5.2 Fate mapping uncovers an alternative pathway of thrombopoiesis 132 5.2.1 CD201-/lo Sca-1lo HSCs feed thrombopoiesis via CD48-/lo MkPs 132 5.2.2 Thrombopoietin signalling enhances platelet production via the direct pathway 135 5.3 Fundamental dynamics of label propagation are preserved in aged mice 136 5.4 HSCs in times of crisis: are HSC a reserve population for emergency response? 138 5.4.1 Faithful reporters: Caveats and merits of using in situ models to study HSC activation 139 5.4.2 Severe myeloablation provokes HSC activation 143 5.4.3 Inflammation-induced emergency hematopoiesis only mildly amplifies HSC activity 145 5.4.4 Compensation of blood cell loss is achieved without HSC contribution 149 5.4.5 Innate immune training does not alter HSC proliferation and differentiation 150 6 Conclusion 153 References 155 Acknowledgements 185 Appendices 187 Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 189 Anlage 2: Erklärung über die Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 190 / Die Blutbildung in erwachsenen Organismen wird durch eine komplexe, hierarchisch organisierte Kaskade von sich fortwährend differenzierenden Zellen aufrechterhalten, und hat ihren Ursprung in adulten h\'amatopoietischen Stammzellen (HSZs). HSZs wurden ausgiebig unter unphysiologischen Extrembedingungen (z.B. Transplantation) untersucht, in welchen sich viel über das maximale potential einer Zelle, aber wenig über ihr Verhalten in ungestörtem Zustand sagen lässt. Obwohl durch moderne \textit-Techniken mittlerweile h\'amatopoietische Differenzierung in ihrer ursprünglichen Umgebung beobachtet werden kann, bleiben etliche Fragen zum nativen Verhalten von HSZs offen. So ist es noch unklar, ob und in welchem Ausmaß HSZs überhaupt zur stationären Blutbildung beitragen, oder ob sie eine Reservepopulation darstellen, die im Notfall aktiviert werden kann. Da bis dato gebr\'auchliche Definitionen von HSZs verschiedene Sub-Populationen mit heterogener Funktionalität umfassen, sind die inkohärenten Ergebnisse wahrscheinlich mit einer anderen grundlegenden Frage verknüpft: Was ist die wahre Identit\'at der HSZ-Population, die an der Spitze der h\'amatopoetischen Hierarchie steht? Die Beantwortung dieser Fragen ist essenziell für ein besseres Verst\'andnis von fatalen humanen Krankheiten, wie beispielsweise Leuk\'amie oder aplastische An\'amie. Wir beschreiben einen integrativen Ansatz, der nicht-invasive experimentelle Methoden mit mathematischer Modellierung vereint, um die zugrundeliegenden Pfade und Differenzierungsmuster der station\'arer H\'amatopoese zu ergründen. Auf diese Weise können wir eine Population von Sca-1\textsuperscript{hi} und CD201(EPCR)\textsuperscript{hi} HSZs als die bisher unbekannte Apex-Population identifizieren, und zeigen, dass diese Zellen geringf\'ugig, aber kontinuierlich, zur nativen H\'amatopoese beitragen. Darüber hinaus klären wir die Architektur eines direkten thrombozytischen Differenzierungspfades, welcher unmittelbar von HSZs abzweigt und diese über eine neu definierte CD48\textsuperscript{-/lo} Megakaryozyten-Vorläuferpopulation direkt mit Thrombozyten ver- bindet. Schließlich liefern wir eine umfassende Analyse des dynamischen Differenzierungs- und Proliferationsverhaltens von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in prototypischen Stresssituationen, die Blutverlust, Infektion und Entzündung nachahmen. Wir zeigen, dass primitive Stammzellen nicht direkt zur Notfall-Hämatopoese beitragen und nur bei schwerer Myeloablation und chronischer Entzündung aktiviert werden. Ebenfalls hat das Training des angeborenen Immunsystems keinen Einfluss auf die Aktivität von HSZs bei wiederholter Stimulation. Unsere Ergebnisse belegen, dass primitive HSZs weder einen wesentlichen Beitrag zur stationären Blutbildung leisten, noch ein Reservoir für die Notfallversorgung darstellen. Wir stellen somit das derzeitige Dogma der Hämatopoese in Frage und argumentieren, dass die primäre Funktion der HSZ im erwachsenen Organismus noch zu entdecken ist.:Contents Abstract iv Zusammenfassung vii List of Figures xii List of Tables xiii List of Abbreviations xv 1 Introduction 1 1.1 Hematopoiesis and the hematopoietic system 1 1.1.1 Developmental origins 1 1.1.2 The hematopoietic hierarchy 3 1.2 Hematopoietic stem cells 5 1.2.1 Characteristics of hematopoietic stem cells 7 1.2.2 Identification of hematopoietic stem and progenitor cells 7 1.2.3 HSC heterogeneity 11 1.3 Novel genetic tools to analyse native hematopoiesis 12 1.3.1 Conditional gene targeting 12 1.4 Hematopoietic stem cell behaviour in adult steady-state hematopoiesis 15 1.4.1 Models of native Hematopoiesis 16 1.4.2 Models of HSC quiescence 23 1.4.3 Aged hematopoiesis 25 1.5 Hematopoietic stem cell behaviour in stress response 26 1.5.1 Inflammation and Infection 27 1.5.2 Myeloablation 30 1.5.3 Innate immune training 32 2 Aim of Thesis 35 3 Material and Methods 37 3.1 Materials 37 3.1.1 Antibodies 37 3.1.2 Buffer and Solutions 38 3.1.3 Chemicals and Reagents 39 3.1.4 Cultivation Media 40 3.1.5 Kit Systems 41 3.1.6 Software 41 3.2 Mice 42 3.2.1 Animal housing and husbandry 42 3.2.2 Mouse strains 42 3.3 Genotyping of mice 43 3.4 Treatments of mice 46 3.4.1 Reporter induction 46 3.4.2 Hematopoietic stress induction 46 3.5 Hemograms 48 3.6 Transplantation and in vivo repopulation assays 49 3.6.1 Preconditioning and transplantation of recipients 49 3.6.2 Competitive repopulation assay 50 3.6.3 Limiting dilution assay 50 3.6.4 Transplantation into sublethally irradiated hosts 51 3.7 Cell preparation for transplantation and flow cytometry 51 3.7.1 Bone marrow 51 3.7.2 Splenocytes 51 3.7.3 Peripheral blood 51 3.7.4 Peritoneal cells 52 3.7.5 Cell depletion by magnetic activated cell sorting (MACS) 52 3.8 Flow Cytometry 53 3.8.1 Cell staining 54 3.8.2 Cell counting 55 3.8.3 Cell identification and gating 55 3.8.4 Chimerism analysis 57 3.8.5 Cell sorting 58 3.9 Cytokine detection assay 58 3.10 in vitro single cell expansion assay 59 3.11 Sequencing 61 3.11.1 Single cell RNA sequencing 61 3.11.2 Bulk RNA sequencing 62 3.11.3 Single cell and bulk transcriptome analysis 62 3.12 Mathematical modelling 62 3.13 Data Normalization 63 3.14 Statistical Analysis 64 4 Results 67 4.1 Identification of an apex HSC population 67 4.1.1 Fgd5 Cre-System preferentially labels primitive HSCs 68 4.1.2 ES HSCs reside at the top of the hierarchy 71 4.2 A combination of proliferation and differentiation modelling uncovers lineage trajectories 76 4.2.1 Iterative modelling reveals subtle, but continuous contribution of HSC to Steady state hematopoiesis 77 4.2.2 The myeloid lineage diverges within phenotypic HSCs 80 4.3 Fate mapping uncovers an alternative pathway of thrombopoiesis 82 4.3.1 CD201-/lo Sca-1lo HSCs feed thrombopoiesis via CD48-/lo MkPs 82 4.3.2 CD48-stratified MkP subsets display variable thrombopoietic potential 88 4.3.3 Thrombopoietin signalling enhances platelet production via the direct pathway 92 4.4 Ageing modulates the dynamics of fate mapping 95 4.5 HSCs in times of crisis: Contribution to stress recovery 99 4.5.1 Faithful reporters are necessary to study HSPC behaviour during stress hematopoiesis 100 4.5.2 Severe myeloablation provokes HSC activation 105 4.5.3 Inflammation-induced emergency hematopoiesis only mildly amplifies HSC activity 107 4.5.4 Innate immune training does not alter HSC proliferation and differentiation 113 4.5.5 Compensation of blood cell loss is achieved without HSC contribution 118 4.5.6 Emergency hematopoiesis proceeds without activation of primitive Hematopoietic stem cells (HSCs) 120 5 Discussion 123 5.1 Labels matter: What is a true HSC? 123 5.1.1 Fgd5ZsGreen:CreERT2R26LSL-tdRFP fate mapping preferentially labels primitive HSCs 124 5.1.2 ES HSCs reside at the top of the hierarchy 126 5.1.3 Subtle, but continuous contribution of HSCs to steady state hematopoiesis 127 5.1.4 The myeloid lineage diverges within phenotypic HSCs 130 5.2 Fate mapping uncovers an alternative pathway of thrombopoiesis 132 5.2.1 CD201-/lo Sca-1lo HSCs feed thrombopoiesis via CD48-/lo MkPs 132 5.2.2 Thrombopoietin signalling enhances platelet production via the direct pathway 135 5.3 Fundamental dynamics of label propagation are preserved in aged mice 136 5.4 HSCs in times of crisis: are HSC a reserve population for emergency response? 138 5.4.1 Faithful reporters: Caveats and merits of using in situ models to study HSC activation 139 5.4.2 Severe myeloablation provokes HSC activation 143 5.4.3 Inflammation-induced emergency hematopoiesis only mildly amplifies HSC activity 145 5.4.4 Compensation of blood cell loss is achieved without HSC contribution 149 5.4.5 Innate immune training does not alter HSC proliferation and differentiation 150 6 Conclusion 153 References 155 Acknowledgements 185 Appendices 187 Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 189 Anlage 2: Erklärung über die Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 190

Das Gen für die Expression von Helicobacter pylori Urease wurde in das Genom von Salmonella typhi Ty21a (Typhoral() integriert. Der resultierende Stamm erhielt die Bezeichnung Salmonella typhi Ty21a(pDB1). Neun gesunden Probanden wurde Salmonella typhi Ty21a(pDB1) verabreicht. In der Kontrollgruppe erhielten drei gesunde Probanden Salmonella typhi Ty21a. Schwerwiegende Nebenwirkungen wurden bei keinem der Probanden beobachtet. Zehn von 12 Probanden zeigten eine humorale Immunantwort gegen Antigene von Salmonella typhi, nachgewiesen über die Detektion spezifischer Antikörper produzierender Zellen, aber bei nur zwei Probanden ließ sich eine Serokonversion nachweisen. Eine zelluläre Immunantwort gegen das H-Antigen von Salmonella typhi konnte bei insgesamt fünf Probanden nachgewiesen werden. Insgesamt sechs Probanden zeigten eine zelluläre Immunantwort gegen Urease von Helicobacter pylori in zumindest einem von drei der zur Anwendung gebrachten Testsysteme (Proliferation, T-cell-Elispot, IFN-gamma Elisa). Eine humorale Immunantwort gegen Urease von Helicobacter pylori konnte bei keinem der Probanden nachgewiesen werden. Ty21a(pDB1) ist somit ein geeigneter Prototyp zur Optimierung einer Salmonella basierte Impfung zur Induktion einer zellulären Immunantwort, die zu einer protektiven Immunität gegenüber Helicobacter pylori führen könnte. / Helicobacter pylori urease was expressed in the common live typhoid vaccine Salmonella typhi Ty21a (Typhoral() yielding Salmonella typhi Ty21a(pDB1). Nine volunteers received Salmonella typhi Ty21a(pDB1) and three control volunteers received Salmonella typhi Ty21a. No serious adverse effects were observed in any of the volunteers. Ten out of 12 volunteers developed humoral immune responses to the Salmonella carrier as detected by antigen-specific antibody-secreting cells but only two volunteers seroconverted. A total of five volunteers showed cellular responses to the carrier. Six out of nine volunteers that had received Salmonella typhi Ty21a(pDB1) showed a T-cell response to Helicobacter urease in at least one of the three assays for detection of cellular response (Proliferation, T-cell-Elispot, IFN-gamma Elisa). No volunteer had detectable humoral responses to urease. Salmonella typhi Ty21a(pDB1) is a suitable prototype to optimize Salmonella-based vaccination for efficient cellular responses that could mediate protective immunity against Helicobacter.

Streptococcus pneumoniae ist ein gram-positives Bakterium und ein Krankheitserreger des Menschen. Ein Charakteristikum des Bakteriums ist, dass es Cholin-Reste in seine dicke Zellwand einbaut. Das Ziel meiner Doktorarbeit war herauszufinden, inwiefern diese Cholin-Reste zur Virulenz des Bakteriums während experimenteller Sepsis und Meningitis beitragen. Dabei konnte ich feststellen, das cholinierte Wildtyp-Bakterien hoch virulent waren, ungestört im Wirt wachsen konnten und letztendlich zu einer massiven Überaktivierung des Wirts-Immunsystems (gemessen anhand der Zytokine IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) sowie zum Tode der Versuchtiere führten. Im Gegensatz dazu waren cholin-freie Bakterien nicht in der Lage eine permanente Infektion im Wirt zu etablieren. So wuchsen sie nur anfangs und wurden vom Wirts-Immunsystem kontrolliert und beseitigt, sodass alle Tiere überlebten. Die Injektion von cholin-freien und cholinierten, hoch aufgereinigten Zellwänden, führte zu der Schlussfolgerung, dass Cholin in der Zellwand ein Immunevasionsmechanismus der Bakterien sein muss. Ausserdem waren cholin-freie Bakterien in der Lage einen protektiven, serotyp-spezifischen Immunschutz im Wirt zu induzieren. / Streptococcus pneumonia is a major human pathogen. Since it is a gram positive bacterium it is characterized by the production of a thick cell wall. Being auxotrophic for choline, the pneumococcus attaches this aminoalcohol to its teichoic acids thus decorating its surface with choline-residues. The aim of this work was to investigate the role that these choline residues play in the virulence of the bacterium. By using an isogenic choline-containing and choline-free pair of S. pneumoniae I was able to demonstrate that surface bound choline is essential for the virulence of the bacterium in animal models of experimental sepsis and meningitis. In either model choline-containing bacteria were able to persistently grow within the host system, continuously stimulate the production of proinflammatory cytokines (IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) and eventually led to the death of all infected animals within 24h. In contrast, choline-free bacteria showed only transient growth within the host and induced only moderate and limited expression of cytokines. Consequently, the bacterium was virtually avirulent and all animals survived. Intracisternal application of highly purified cholinated and choline-free cell wall preparations, induced a comparable activation of the immune system. These findings led to the conclusion that choline residues contribute to an immunevasion strategy that allows the bacteria to grow despite an ongoing immune response. Although being avirulent choline-free bacteria were able to induce serotype specific immunity in the animals.

Toxoplasma gondii ist ein weltweit verbreiteter Parasit. In Europa ernährt sich der Endwirt (Katzen) hauptsächlich von kleinen Säugetieren wie Myodes glareolus und Microtus spp. (Wühlmäusen) und Apodemus spp., seltener von Mus spp. Erstere zeigen gegenüber Mus spp. erhöhte Prävalenzen von T. gondii und überleben diese eher als Mus spp. Daher wird vermutet, dass Wühlmäusen und Apodemus spp. eine größere Rolle als Zwischenwirte besitzen, als Mus spp. Der Schutz wird auf das IFN-γ-induzierte IRGb2-b1 zurückgeführt, die den zentralen parasitären Virulenzfaktor ROP5 inhibiert. Daher liegt der Fokus meiner Arbeit auf der protektiven Rolle von IRGb2-b1 bei der Infektion mit T. gondii in Wühlmäusen und Apodemus spp. Mit dieser Arbeit trage ich nützliche Werkzeuge zur Erforschung von Wühlmäusen bei, wie ein rekombinantes M. glareolus IFN-γ Zytokin und neuartige Zellsysteme. Alle untersuchten Wühlmaus-Systeme besaßen einen Phänotyp bei Infektion mit in vivo Resistenz beschrieben wurde: einem IFN-γ-vermittelten Reduktion der Parasitenbürde (mit Wirtszelltod für Typ I Parasiten, ohne für Typ II). Darüber hinaus bestätigen vorläufige Resultate aus Wühlmäusen und Apodemus spp. in Deutschland hohe genetische Vielfalt der IRGb2 Untereinheit zeigen, insbesondere an der vermuteten Grenzfläche zum ROP5, was auf eine Rolle dieses Proteins bei der Infektion hindeutet. Um die Funktion der IRGb2-b1 Proteine zu untersuchen, habe ich ein Zellkultur System, entwickelt, welches erlaubt wild-derived Gene stabil zu exprimieren. Dieses Setup gestattet es, die Auswirkungen von Polymorphismen in Irg Genen bei der Infektion mit T. gondii zu evaluieren. Insgesamt habe ich Werkzeuge erarbeitet, um den Ansatz der Öko-Immunologie in eine Labor-Umwelt zu bringen, wodurch die molekulare Untersuchung ökologisch relevanter Arten möglich wird. Durch Anwendung dieser Werkzeuge stütze ich die Hypothese, dass nicht-Mus Nagetiere, insbesondere M. glareolus, ein bedeutendes Reservoir für T. gondii darstellen. / Toxoplasma gondii is an ubiquitous parasite grouped in three main clonal lineages, type I-III. In Europe, felids, definitive hosts for the parasite, mostly prey on small mammals of Myodes glareolus and Microtus spp. (voles), and Apodemus spp., rather than Mus spp. Voles and Apodemus spp. also display higher T. gondii prevalence and survive infection to a larger extent than Mus spp., although tolerant Mus subspecies exist. This suggests that voles and Apodemus spp. are more relevant intermediate hosts than Mus spp.. Resistance to infection relies on the IFN-γ-induced IRGb2-b1, which inhibits the major parasite virulence factor ROP5. Thus, this work focuses on the protective role of IRGb2-b1 during T. gondii infection in voles and Apodemus spp. With this project I contribute with valuable tools for research on voles, such as the supply of the recombinant M. glareolus IFN-γ cytokine and novel cell systems. All vole systems show a phenotype to type I infection which is associated with in vivo resistance in Mus spp: IFN-γ-mediated host cell death and a decrease in parasite burden. The latter without cell death was observed for type II parasites, suggesting novel protective mechanisms. Further, preliminary results from voles and Apodemus spp. in Germany confirm the expected high diversity in the IRGb2-like subunit, especially at the putative interface with ROP5, which suggests a role of the protein during infection. To assess the role of IRGb2-b1-like in this phenotype, I developed a system which allows establishment of cell lines stably expressing wild-derived Irg-like genes. This setup allows evaluation of the effect of polymorphisms of Irg-like genes during infection. Taken together, I have provided tools to bring eco-immunology into a lab setting to perform molecular investigations of ecologically relevant species. Using these tools, I offer support for the hypothesis that non-Mus rodents, especially M. glareolus, constitutes a relevant T. gondii reservoir in Germany.

Angeborene lymphoide Zellen (ILCs) bilden eine Familie von Effektorzellen des angeborenen Immunsystems, denen somatisch rekombinierte Antigenrezeptoren fehlen und die in drei Hauptgruppen eingeteilt werden. In der Embryonalentwicklung spielen Typ 3 ILCs, sogenannte LTi (Lymphoid Tissue inducer) Zellen, eine zentrale Rolle in der Entwicklung von Lymphknoten. ILC3, einschließlich LTi Zellen sind abhängig von dem Master-Transkriptionsfaktor RORgt, was sich in RORgt-defizienten Mäuse durch die Abwesenheit aller ILC3, und auch durch fehlende Lymphknoten äußert. Während postnatale Ko-expression der Transkriptionsfaktoren T-bet und RORgt in ILC3-Subpopulationen fest etabliert ist, ist der Einfluss von T-bet in fötalen ILC3 und auf die Generation von Lymphknoten noch unbekannt. Um diese Mechanismen genau zu untersuchen, wurden fötale ILCs mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung charakterisiert, wodurch eine unerwartete Heterogenität innerhalb der ILC3 mit T-bet-exprimierenden Zellen aufgedeckt wurde. Außerdem wurden PLZF+ ILC-Vorläufer (ILCP) im sich entwickelnden Darm nachgewiesen. Weiterhin, bestätigen diverse Mausmodelle eine Schlüsselrolle für T bet in der Regulation der ILC-Differenzierung und der Entstehung von Lymphknoten. Die zusätzliche genetische Ablation von T-bet in RORgt-defizienten Mäusen beeinflusste Differenzierungsentscheidungen in fötalen ILCP und ermöglichte die Akkumulation von ILCP mit LTi-Aktivität, wodurch die Organogenese von Lymphknoten, unabhängig von RORgt wiederhergestellt wurde. PLZF+ ILCP von RORgt/T-bet-Doppeldefizienten Mäusen bestanden bis ins Erwachsenenalter, wo diese Zellen die Darmbarrierefunktionen durch Produktion von IL-22 wiederherstellten. Darüber hinaus erwies sich RORa als entscheidend für die Entwicklung von PLZF+ ILCP und die damit verbundene Bildung von Lymphknoten. / Innate lymphoid cells (ILCs) represent a family of innate effector cells lacking rearranged antigen receptors, which are classified into three main groups based on their lineage-specifying transcription factors (TF) and effector functions. During embryonic development, the formation of lymphoid organs critically relies on a specific member of group 3 innate lymphoid cells (ILC3), expressing the master transcription factor RORgt and exhibiting lymphoid tissue inducer (LTi) functions. Accordingly, RORgt-deficient mice lack ILC3 and do not generate lymph nodes (LN). While it is established that T-bet is co-expressed with RORgt in a subset of ILC3 emerging postnatally and influencing their differentiation, phenotype and functions, the effect of T-bet on fetal ILC3 biology and its impact on LN generation remains completely unknown. In order to study the role of T-bet in fetal ILC3 differentiation and functions as well as in LN formation, single-cell RNA sequencing and flow cytometry were applied to characterize fetal ILC subsets revealing an unanticipated heterogeneity within embryonic ILC3 and identifying T-bet+ ILC3 subsets within the fetal intestine and mesenteric LN anlage for the first time. Furthermore, PLZF+ ILC progenitors (ILCP) were exposed in the developing mouse intestine. Importantly, using multiple mouse models, a key role for T-bet in regulating ILC differentiation and LN formation was discovered. Specifically, additional deficiency of T-bet in RORgt-deficient mice skewed lineage fate decisions in differentiating fetal ILCP and allowed accumulation of ILCP with LTi activity, thereby rescuing LN organogenesis in a RORgt-independent fashion. PLZF+ ILCP of RORgt/T-bet double deficient mice persisted into adulthood where these cells restored intestinal barrier functions through reinstalled IL-22 production. Moreover, RORa was found to be critical for the development of PLZF+ ILCP and associated LN formation.

Die hier vorgestellte Studie untersucht systematisch die angeborene Immunabwehr gegen L. pneumophila auf Ebene des gesamten Wirtsorganismus, sowie auf molekularer Ebene in Alveolar- und Knochenmarksmakrophagen. Mittels in vivo Transkriptomanalysen werden Typ I und II Interferone (IFN) als Hauptregulatoren der frühen pulmonalen Genexpression in der L. pneumophila-Infektion identifiziert. Infektionsexperimente in Wildtyp- und IFN-Rezeptor-defizienten Tieren offenbaren, dass Typ I und II IFNe maßgeblich die antibakterielle Abwehr gegen L. pneumophila vermitteln. Für die Bekämpfung der Infektion in der Lunge werden CD11c+ Zellen als wichtigste Empfänger der IFN-Signale identifiziert. Des Weiteren wird durch Behandlung von CD11c+ Alveolarmakrophagen mit IFNen ex vivo das intrazelluläre bakterielle Wachstum inhibiert. Mittels subzellulärer quantitativer Massenspektrometrie wird gezeigt, dass die Proteinkomposition der Legionellen-enthaltenden Vakuole substanziell durch beide IFNe modifiziert wird. In einer vergleichenden Netzwerkanalyse werden diese Proteomdaten mit eigenen und öffentlich zugänglichen Transkriptomdaten verglichen. Hierdurch können klar abgegrenzte Untergruppen von einerseits transkriptionell durch IFN-regulierten Proteinen sowie andererseits ausschließlich räumlich IFN-regulierten Proteinen unterschieden werden. Unter den durch IFN an der Vakuole angereicherten Proteinen wird Immunoresponsive gene 1 (IRG1) als zentraler Effektor identifiziert, welcher das Wachstum von L. pneumophila durch die Produktion des antibakteriellen Metaboliten Itaconsäure inhibiert. Zusammenfassend stellt diese Studie eine umfassende Ressource von IFN-vermittelten Effekten auf die Genexpression sowie auf das Proteom der bakteriellen Vakuole dar und deckt einen zellautonomen Abwehrmechanismus gegen L. pneumophila auf, welcher durch die IRG1-abhängige Produktion von Itaconsäure vermittelt wird. / The study presented here systemically examines the innate immune response against L. pneumophila on whole organism level as well as on a molecular level within macrophages, L. pneumophilas’ host cell. In vivo transcriptome analyses identify type I and II interferons (IFNs) as master regulators of the early pulmonary gene expression during L. pneumophila infection. Infection experiments in wild-type mice and mice lacking type I and/or II IFN signaling reveal a severe defect of antibacterial defense when IFN signaling is absent. CD11c+ cells were found to be the main targets of IFNs to restrict infection in the lung, and IFNs inhibited bacterial growth in CD11c+ alveolar macrophages ex vivo. Subcellular quantitative mass spectrometry shows that both IFNs substantially modify the protein composition of Legionella-containing vacuoles. Comparative network analysis, combining these proteome data with transcriptome data as well as public database data reveals distinct subsets of transcriptionally regulated IFN-stimulated genes (ISGs) on the one hand, but interestingly also exclusively spatially IFN-regulated vacuolar proteins. Among IFN-regulated vacuolar proteins, Immunoresponsive gene 1 (IRG1) was identified as a central effector that restricts growth of L. pneumophila through production of the antibacterial metabolite itaconic acid in macrophages. Collectively, this study provides a comprehensive resource of IFN-mediated effects on gene expression and the bacterial vacuolar proteome, and uncovers a cell-autonomous defense pathway against L. pneumophila, which is mediated by IFNs, IRG1 and itaconic acid.

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