L'étude de protéines ciblées comme des biomarqueurs dans des matrices biologiques est un réel défi pour le diagnostic médical. De nos jours, la technique de choix est la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. Cependant, l'analyse d'une protéine induit une étape de traitement d'échantillon afin de purifier au mieux la matrice biologique. En vue d'une automatisation totale de l'analyse, une étape d'extraction sélective a été couplée à un réacteur enzymatique suivie de l'analyse par CPL-SM. Tout d'abord, différents réacteurs enzymatiques ont été préparés et évalués. Puis, une étape extraction a été développée via un immunoadsorbant (IS). L'IS a ensuite été couplé à l'analyse pour une application à un échantillon de plasma dopé. Enfin, un des défis analytiques actuels est la miniaturisation du système analytique afin d'augmenter la sensibilité. Ainsi, un réacteur enzymatique a été préparé dans en format capillaire. L'efficacité de digestion a été démontrée sur un substrat de faible poids moléculaire. La synthèse d'un IS miniaturisé sera envisagée dans le but d'un couplage avec le réacteur enzymatique et l'analyse par nano-CPL/SM.

Nous avons développé un système microfluidique où des particules magnétiques entraînées par un flux hydrodynamique restent confinées dynamiquement grâce à un champ magnétique au sein d'une micro-chambre. Ces particules sont employées comme support pour un immuno-dosage. Le projet européen Nadine dans lequel s'inscrit ce travail vise au développement d'un module destiné au diagnostic précoce de la maladie d'Alzheimer à partir du sang. Ce système dense et dynamique évoque un lit fluidisé, et son comportement a été interprété dans cette perspective. Bien que les lits fluidisés gravitationnels aient été largement étudiés à une échelle macroscopique, leurs intégrations en microfluidique demeurent impossible, la force de gravitation n'équilibrant plus les forces hydrodynamiques à cette échelle. Les forces magnétiques offrent l'opportunité d'étendre le principe du lit fluidisé aux systèmes miniaturisés, et à notre connaissance, notre système constitue la première réalisation d'un lit fluidisé stabilisé magnétiquement en microfluidique. Ce nouveau système autorise une forte densité en particules (nécessaire pour une capacité élevée), une agitation hydrodynamique (pour accroître la cinétique de capture et son efficacité) et un flux élevé (permettant la concentration d'analytes très diluées). Ce module a été validé à l'aide d'un immuno-dosage-modèle (IgG/anti-IgG), par l'emploi d'une stratégie de type stop-and-go, qui permet de bénéficier pleinement de la nature dynamique des colonnes magnétiques. Le système permet par ailleurs l'enrichissement continu en analytes du lit de particules, ce qui augmente significativement la sensibilité de détection (LOD ~ 6,5 pM).

Si la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse est un outil de bioanalyse largement utilisé pour la quantification des molécules de faible poids moléculaire dans les fluides biologiques, il n'en est pas de même pour les macromolécules. Au cours de ce travail, nous avons exploré les possibilités et les difficultés d'une méthode d'extraction par immunoaffinité couplée de la spectrométrie de masse pour la quantification des protéines recombinantes et des biomarqueurs. Cette stratégie a tout d'abord été appliquée à une petite protéine thérapeutique, Epi-hNE4, un inhibiteur de l'élastase humaine et pour lequel nous avons obtenu une sensibilité de 80 pM. Cette méthode a également été appliquée à un anticorps thérapeutique utilisé pour le traitement du cancer colorectal, Cetuximab, pour lequel une sensibilité de130 pM a été obtenue grâce à une extraction par l'EGFR, sa cible biologique. Ce dernier développement offre des perspectives pour évaluer l'immunogénecité des protéines thérapeutiques. La méthode de référence est la technique ELISA, que nous avons appliquée à la détection d'anticorps anti-Epi-hNE4, mais les difficultés rencontrées suggèrent que la spectrométrie de masse serait une alternative interessante. Enfin, une dernière application de la spectrométrie de masse pour la quantification multiplexée des biomarqueurs a été menée sur les apelines, une famille de peptides de 12 à 36 acides aminés jouant un rôle crucial dans le système cardiovasculaire. Une limite de détection de l'ordre de 25 pM a été atteinte, et de façon interessante, cette méthode nous a permis de conclure à l'absence des formes supposées circulantes.