Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 23 février 2006). Bibliogr.

L'étude de protéines ciblées comme des biomarqueurs dans des matrices biologiques est un réel défi pour le diagnostic médical. De nos jours, la technique de choix est la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. Cependant, l'analyse d'une protéine induit une étape de traitement d'échantillon afin de purifier au mieux la matrice biologique. En vue d'une automatisation totale de l'analyse, une étape d'extraction sélective a été couplée à un réacteur enzymatique suivie de l'analyse par CPL-SM. Tout d'abord, différents réacteurs enzymatiques ont été préparés et évalués. Puis, une étape extraction a été développée via un immunoadsorbant (IS). L'IS a ensuite été couplé à l'analyse pour une application à un échantillon de plasma dopé. Enfin, un des défis analytiques actuels est la miniaturisation du système analytique afin d'augmenter la sensibilité. Ainsi, un réacteur enzymatique a été préparé dans en format capillaire. L'efficacité de digestion a été démontrée sur un substrat de faible poids moléculaire. La synthèse d'un IS miniaturisé sera envisagée dans le but d'un couplage avec le réacteur enzymatique et l'analyse par nano-CPL/SM.

La β-lactoglobuline (β-Lg) bovine contient plusieurs séquences peptidiques à activité biologique qui présentent un intérêt à titre d’ingrédients nutraceutiques. Toutefois, des études ont démontré que certains de ces peptides, actifs lors de tests in vitro, sont inefficaces suite à leur ingestion orale chez l’animal, suggérant leur dégradation lors du transit gastro-intestinal. L’objectif de ce travail était d’étudier les interactions β-Lg:peptide bioactif et d’évaluer l’impact de ces interactions sur la digestibilité in vitro des complexes. Premièrement, il a été démontré que l’hydrolyse pepsique et chymotrypsique de certains peptides bioactifs varie en fonction de la longueur de la chaîne peptidique, la nature du peptide et la présence d’autres peptides dans le milieu réactionnel. Par la suite, il a été démontré à l’aide d’une méthode d’ultrafiltration que les peptides β-Lg f102-105, f142-148 et f69-83 se lient en quantité significative à la β-Lg A, avec des taux de fixation de 1.5, 1.1 et 0.7 moles de peptides par mole de protéine respectivement. Ces résultats ont été validés par spectroscopie de fluorescence frontale. Les spectres d’émission de fluorescence ont démontré que la liaison de ces peptides à la β-Lg A modifie l’environnement des résidus tryptophane dans la structure de la protéine. De plus, une analyse par calorimétrie à titration isothermique a démontré que le peptide antihypertensif β-Lg f142-148 se lie à la β-Lg A selon un modèle de liaison séquentielle à trois sites. Pour ce peptide, les isothermes de liaison ont révélé des constantes d’association de 2 X 103, 1 X 103 et 0.4 X 103 M-1 pour le 1ier, 2ième et 3ième site de liaison, avec une enthalpie de liaison exothermique dans le cas des deux premiers sites, mais endothermique pour le troisième site. Enfin, l’hydrolyse in vitro de la protéine et des complexes à l’aide de pepsine, trypsine, chymotrypsine et pancréatine a démontré que le les complexes sont hydrolysés plus lentement que la protéine native par la chymotrypsine ou un mélange pepsine/chymotrypsine. L’ensemble de ces résultats supporte donc l’hypothèse que la liaison de peptides bioactifs à la β-Lg A pourrait permettre d’améliorer leur résistance à la protéolyse et ainsi, maintenir leur intégrité structurale et leur bioactivité lors du transit gastro-intestinal. / Bovine β-lactoglobulin (β-Lg) contains numerous peptide sequences with biological activities, which have a high potential as nutraceutical ingredients. However, studies have demonstrated that some of these peptides, which are active during in vitro tests, loose their activity in animal models following oral ingestion, suggesting their enzymatic degradation during gastrointestinal transit. The aim of this work was to study β-Lg:bioactive peptide interactions and to investigate the in vitro digestibility of the resulting complexes. Firstly, it was shown that pepsic and chymotryptic digestions of some bioactive peptides varied according to the peptide chain length, the nature of the peptide and the presence of other peptides in the reaction medium. Using an ultrafiltration method, it was demonstrated that peptides β-Lg f102-105, f142-148 and f69-83 bind to β-Lg A in significant amounts corresponding to 1.5, 1.1 and 0.7 moles of peptides per mole of protein respectively. These results were validated by front-face fluorescence spectroscopy, which also provided evidences that the binding of the three peptides to β-Lg A modified the polarity of tryptophan environment in the protein structure. In addition, binding isotherms obtained by isothermal titration calorimetry showed that the binding of the antihypertensive peptide β-Lg f142-148 to β-Lg A followed a sequential three-site binding model with constants of associations of 2 X 103, 1 X 103 and 0.4 X 103 M-1 for the 1st, 2nd, and 3rd binding sites respectively. The enthalpy of binding was exothermic for the 1st and 2nd binding sites and endothermic for the 3rd binding site. Lastly, the in vitro digestibility of the protein and the complexes with pepsin, trypsin, chymotrypsin, and pancreatin showed that the complexes were hydrolyzed more slowly than the native protein by chymotrypsin or pepsin/chymotrypsin. The overall results support the hypothesis that the binding of bioactive peptides to β-Lg A could improve their resistance to proteolysis, and thus could contribute to maintain their structural integrity and bioactivity during gastrointestinal transit.

Le complexe d'initiation de la traduction 3 des eucaryotes (eIF3) joue un role central dans le réseau d'interaction des divers facteurs d'initiation de la traduction qui s'assemblent sur les ribosomes 40S, et participent aux différentes réactions au cours de la voie d'initiation de la traduction. Chez Saccharomyces cerevisiaea, ce complexe est composé de cinq sous-unités, qui sont toutes homologues avec les sous-unités de cœur du complexe eIF3 des mammifères, composé de 13 sous-unités. Un objectif majeur actuellement est d'obtenir une structure tridimensionnelle de ce complexe. Dans une première étape vers la résolution de cette structure, les efforts portent sur la détermination des régions de liaisons entre sous-unités, dont assez peu sont actuellement connues. La région d'interaction entre la sous-unité 3i et le domaine C-terminal extrémal de 3b a récemment été résolu par RMN et structure cristallographique. D'un autre côté, la région d'interaction entre 3i et 3g, bien que localisée à l'extrémité N-terminale de 3g, doit encore être précisée. Les échanges hydrogène/deutérium (HDX) se sont développés depuis les années 1990 comme outil d'analyse structurale de protéines et de complexes multiprotéiques. La spectrométrie de masse est couramment utilisée pour réaliser la mesure de l'échange. L'approche HDX la plus usuelle repose sur une mesure de masse de peptide marqués issus d'une digestion enzymatique des protéines d'intérêt afin de déterminer le contenu en deutérium ainsi que leur vitesse d'incorporation. Pour ce travail, un spectromètre de masse à ultra-haute résolution, de type FT-ICR 7T, a été utilisé conjointement avec une séparation nano-LC pour générer des données HDX-MS de haute qualité. La précision de mesure de masse d'un spectromètre de masse FT-ICR n'est pas suffisante en elle-même pour identifier de façon certaine les peptides issus d'une digestion à la pepsine, du fait de l'absence de spécificité de la pepsine. Nous avons en conséquence développé une approche statistique pour l'identification des peptides, en se basant sur la définition d'une valeur de probabilité d'occurrence pour un peptide donné dans une digestion à la pepsine. En combinaison avec la précision élevée sur la mesure de masse, ce seul critère permet une identification efficace des peptides, sans devoir recourir à une validation par MS/MS systématique. Cette méthode a été mise en application pour l'étude des régions de liaison dans les complexes eIF3i :b et eIF3i :g. Dans les deux cas, 3i a été surexprimée sous sa forme complète. Au contraire, pour 3b et 3g, seul un segment partiel de la protéine native, contenant le domaine présumé d'interaction a été surexprimé. La liste de référence des peptides présents permet une excellente couverture de séquence et une forte superposition entre séquences adjacentes, ce qui assure une élucidation de la structure avec une bonne résolution spatiale. Pour la liaison entre 3i et 3b, les régions d'interactions qui sont apparues dans des conditions en solution proches des conditions physiologiques sont cohérentes avec la structure proposée par une autre équipe au cours de la thèse, apportant des informations complémentaires à celles issues de la structure cristallographique dérivée de la phase solide. Pour la liaison entre 3i et 3g, la région d'interaction a été étudiée en l'absence de toute donnée structurale à l'échelle atomique pour 3g. Les résultats apportent une vision nouvelle sur la formation du complexe entre 3g et 3i, et pour la première fois les régions de liaisons exacts ont été mis en évidence.