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Les cellules Natural Killer (NK) sont jouent un rôle essentiel dans la surveillance des hémopathies malignes. Cependant, les cellules tumorales développent des mécanismes immunosuppresseurs pour échapper à l'immunité cellulaire NK. Ainsi, le maintien ou l'amélioration des performances des cellules NK sont considérés comme des défis majeurs. Les objectifs de cette partie étaient d'évaluer l'impact de la perfusion de cellules NK activées sur la récupération et la biologie des cellules NK circulantes après l'allo-SCT. Des doses croissantes de cellules NK activées par IL-2 ex-vivo ont été perfusées chez des patients atteints de tumeurs malignes hématologiques 3 mois après allo-SCT. Nos résultats ont montré une fréquence plus élevée des cellules NK dans la périphérie des patients traités. Bien que le phénotype immature soit remarquable peu après le traitement, les cellules NK circulantes, présentaient un état d'activation avec un profil de maturation amélioré après 6 mois de traitement. Nous avons également constaté que l'expression des récepteurs NK activateurs (NKG2D, NKp30 et NKp46) augmentait sur les cellules NK circulantes des patients. De plus, ces cellules ont montré une augmentation significative de la capacité de dégranulation ainsi que de la sécrétion de cytokines (IFN-Ƴ et TNF-α) tout au long de l'étude. Ces différences ont notamment été observées chez les patients ayant reçu des doses plus importantes de cellules NK activées. En conclusion, nous supposons que la perfusion de fortes doses de cellules NK activées ex-vivo pourrait être associée à l'amélioration du phénotype et des fonctions des cellules NK au cours de la reconstitution immunitaire après allo-SCT. / Natural killer (NK) cells are effector lymphocytes of the innate immune system that have the ability to kill transformed cells. They play a critical role in hematological malignancies surveillance, however, tumor cells develop immunosuppressive mechanisms to escape NK cell-mediated killing. So, maintaining or improving NK cell performance is considered a major challenge. Our goals are to evaluate the impact of activated NK cells infusion on the recovery and biology of circulating NK cells post allo-SCT.Three different doses (dose 1: 106 NK cell/Kg, n=3; dose 2: 5x106 NK cell/Kg, n=7; dose 3: >5x106 NK cell/Kg, n=6) of ex-vivo IL-2 activated NK cells were infused into patients with hematological malignancies after all-SCT. Our results showed higher frequency of NK cells in the periphery of patients treated with larger doses of activated NK cells. Although the notable immature phenotype shortly after treatment, the circulating NK cells in patients receiving larger doses of activated NK cells displayed more activation status with improved maturation profile after 6 months of treatment. We also found that the expression of activating NK receptors (NKG2D, NKp30, and NKp46) augmented on circulating CD56dim NK cells of patients receiving larger doses of activated NK cells. Moreover, these cells showed a significant increase in degranulation capacity as well as cytokine secretion (IFN-Ƴ and TNF-α) throughout study period. In conclusion, we hypothesize that infusion of high-dose of ex-vivo activated NK cells could be associated with improvements of NK cell phenotype and function during immune reconstitution after allo-SCT.

L’immunothérapie représente une avancée majeure dans la prise en charge des patients atteints de cancer. L’utilisation thérapeutique récente des anticorps anti-"checkpoints", qui renforcent la réponse immunitaire cellulaire naturelle anti-tumorale, a relancé l’intérêt d’approches d’immunothérapie cellulaire spécifique dans les cancers. Malgré tout, l’identification d'antigènes capables de stimuler efficacement des lymphocytes T (LT) anti-tumoraux représente un obstacle majeur au développement de telles approches. Pour identifier de tels antigènes, des cellules présentatrices d’antigène (CPA) artificielles (CPAA), capables d’exprimer, après transduction gamma-rétrovirale, des peptides directement codés ou des antigènes entiers, dégradés par ces cellules, comme le feraient des CPA humaines, en peptides présentés au sein de la molécule du CMH de classe I la plus fréquente chez l'homme, HLA-A2.1, ont été développées au laboratoire. Ces CPAA sont capables de stimuler efficacement des LT cytotoxiques (LTC) spécifiques contre des antigènes tumoraux. Deux grandes approches d’identification des antigènes tumoraux d’intérêt thérapeutique, ont été utilisées. La première est une approche directe d’identification des peptides basée sur l’élution des peptides HLA-A2.1-restreints présentés par nos CPAA et leur analyse par spectrométrie de masse. La seconde est une approche d’immunologie inverse basée sur des prédictions in silico d’épitopes HLA-A2.1-restreints reposant sur des données biochimiques des poches du CMH. Dans les deux approches, des tests fonctionnels d’activation de LTC spécifiques ont été effectués avec nos CPAA. Dans la première étude, nous avons utilisé la spectrométrie de masse en tandem couplée à la chromatographie en phase liquide, qui a été jusqu'à présent la technologie permettant l'identification rapide de centaines de ligands du CMH dans différentes approches expérimentales. En partant de CPAA codant les peptides immunogènes connus M1m, M1 ou FSP02, des LTC spécifiques de ces peptides ont été obtenus, et nous avons réussi à les caractériser par spectrométrie de masse. En partant de CPAA codant les protéines entières desquelles ces peptides sont dérivés, des LTC spécifiques des peptides ont également été obtenus mais nous n’avons pas réussi à les caractériser par spectrométrie de masse. Des peptides très immunogènes, capables de stimuler de fortes réponses immunitaires cellulaires anti-tumorales, peuvent donc échapper à une détection par spectrométrie de masse, rendant ainsi discutable l'utilisation de cette technique pour sélectionner des peptides d’intérêt clinique. Dans la deuxième étude, nous sommes partis de peptides prédits. Nous avons pu monter des réponses immunitaires spécifiques contre les néoépitopes FSP25 et FSP26 prédits in silico, dérivés de la protéine mutée CASP5 (-1) retrouvée chez 60% de patients atteints de cancer colorectal (CCR) à instabilité microsatellitaire (IMS). La CASP5 est impliquée dans l’apoptose et nous avons montré que les patients atteints d’un CCR à IMS présentant cette mutation avaient un moins bon pronostic. Nous avons également montré que chez des patients HLA-A2+ atteints d’un CCR à IMS présentant la mutation, des LTC pouvaient être obtenus contre les épitopes FSP25 et FSP26, capables de lyser spécifiquement la lignée cellulaire HLA-A2.1+ HCT116 dérivée d’un CCR à IMS présentant également la mutation, faisant de la protéine mutée CASP5 (-1) une cible thérapeutique de choix chez ces patients. Dans ces deux études, nos CPAA constituaient un outil de choix pour le développement d’approches d’immunothérapie spécifique personnalisée, soit cellulaire adoptive, pour déterminer quels antigènes devraient être ciblés ou pour directement activer et amplifier in vitro des LT injectés in vivo, soit vaccinale, pour déterminer les antigènes les plus immunogènes à inclure dans un vaccin efficace. / Immunotherapy represents a major advance in cancer patient management. Recent use of anti-checkpoint antibodies, that reinforce the natural cellular anti-tumor immune response, has revived interest for specific cellular immunotherapy approaches in cancers. Nevertheless, the difficulty of identifying highly immunogenic tumor antigens capable of specifically stimulating efficient anti-tumor T lymphocytes (TLs) is a considerable barrier to the development of such approaches. In order to identify such antigens, artificial antigen presenting cells (AAPCs) expressing the most common HLA class I molecule, HLA-A2.1, were developed in the laboratory. After gammaretroviral transduction, these AAPCs also express a directly-encoded peptide of interest or a full-length antigen, degraded by these cells into peptides as human antigen presenting cells (APCs) do. These AAPCs are capable of efficiently stimulating specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) against tumor antigens. Two major approaches for the identification of tumor antigens of therapeutic interest have been used. The first one is a direct approach of identification of HLA-A2.1-restricted peptides based on the elution of HLA-A2.1-peptide complexes expressed by our AAPCs and their analysis by mass spectrometry. The second one is a reverse immunology approach based on in silico predictions of HLA-A2.1-restricted epitopes using available MHC pocket biochemical data. In both approaches, functional tests were performed in vitro with our AAPCs to test the immunogenicity of the studied peptides. In the first study, we used tandem mass spectrometry coupled with liquid chromatography, which has been until today the technology of choice for the rapid identification of hundreds of MHC ligands in different experimental approaches. Starting from AAPCs encoding known immunogenic M1m, M1 and FSP02 peptides, specific CTLs could be obtained against these peptides, and we were able to characterize them by mass spectrometry. Starting from AAPCs encoding full length antigens from which these peptides are derived, peptide-specific CTLs were also obtained, but we were unable to characterize them by mass spectrometry. Therefore, highly immunogenic peptides, capable of stimulating strong anti-tumor cellular immune responses, may not be detected by mass spectrometry, rendering questionable the use of this technique for selecting clinically relevant peptides. In the second study, we started from predicted peptides. We were able to mount specific immune responses against FSP25 and FSP26 in silico predicted neoepitopes, derived from the CASP5 (-1) mutated protein found in 60% of microsatellite instability (MSI) colorectal cancer (CCR) patients. CASP5 is involved in programmed cell death and we have shown that MSI CRC patients whose tumors harbored this CASP5 (-1) mutation had less good prognosis. We have also shown that in HLA-A2+ MSI CASP5 (-1)-mutated CRC patients, specific CTLs could be obtained against FSP25 and FSP26 epitopes, capable of specifically lysing HLA-A2+ MSI CRC cell line HCT116 also harboring this mutation. Therefore, the mutated caspase-5 protein might be a therapeutic target of major interest for personalized specific immunotherapy strategies in the context of MSI CASP5 (-1)-mutated CRCs. In both studies, our AAPCs were a tool of choice for the development of personalized specific immunotherapy strategies, either for cellular adoptive approaches, to determine which antigens should be targeted or to directly activate and amplify in vitro antigen of interest-specific TLs which would be transferred in vivo, or for vaccine approaches, to identify the most immunogenic antigens which should be included in an efficacious vaccine

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement efficace des Hémopathies malignes. Cependant, les complications des allogreffes parmi lesquelles les infections virales sont associées parfois à une morbidité et une mortalité importantes. Ces infections surviennent en l’absence de reconstitution immunitaire. Un monitoring régulier de la charge virale des principaux agents infectieux impliqués est réalisé mais amène parfois à la mise en oeuvre abusive de traitements anti-viraux qui ne sont pas dénués de toxicité.Dans ce travail, nous proposons d’associer à ce monitoring un suivi régulier de la reconstitution immunitaire spécifique afin de cibler parmi les patients présentant une réactivation ceux qui nécessitent un traitement curatif de ceux qui pourront maîtriser l’infection par leur système immunitaire. Nous illustrons ce propos avec le virus d’Epstein Barr (EBV) et avons en cours une étude sur l’Adénovirus (ADV).Dans certains cas parfaitement ciblés, les traitements anti-viraux s’avèrent inefficaces. C’est pourquoi dans ce travail, nous présentons la mise au point d’une technique de grade clinique de production de lymphocytes T cytotoxiques anti-ADV (CTL anti-ADV) en condition GMP (Good Manufacturing Practice), grâce au système CliniMACS et au Cytokine Capture System de Miltenyi, afin de proposer une immunothérapie adoptive.Nous décrivons par la suite trois expériences cliniques de traitement compassionnel d’une infection ADV post-allogreffe de CSH. Enfin, nous présentons les résultats préliminaires de la production de CTL bispécifique anti-ADV et CMV / Hematopoietic stem cells Transplantation (HSCT) is a well recognized strategy for treatment of haematological malignancies. However, HSCT complications among which the viral infections a reassociated with high morbidity and mortality. These infections arise in the absence of immune reconstitution. Monitoring of viral reactivations after allogeneic HSCT is necessary, to identify patients at risk of viral infections, but not sufficient, as patients may be abusively treated. In this work we propose to combine viral DNA load assessment with specific immune monitoring to target patients who need to be treated. We report a retrospective study investigating EBV infection and EBV-specific immune recovery using the functional IFN Elispot assay in 40 allogeneic HSCT patients. We initiated a similar study with ADV which is pending. However, although patients are correctly targeted, anti-viral treatment is sometimes not effective. We present a study on the development of a complete clinical grade generation of Human anti-Adenovirus cytotoxic T cells in GMP (Good Manufacturing Practice) conditions, thanks to the system CliniMACS and the Cytokine Capture System, to propose an adoptive immunotherapy to the recipient.We describe afterwards three clinical experiments of treatment of an ADV infection after HSCT.Finally, we present the preliminary results of the anti-ADV and -CMV bi-specific CTL production.

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un des seuls traitements curatifs des hémopathies bénignes ou malignes et des déficits immunitaires primitifs. Cependant, les infections notamment virales ainsi que la réaction du greffon contre l’hôte comptent parmi les complications les plus fréquentes des allogreffes associées à une morbidité et une mortalité élevées. Les infections virales surviennent souvent en l’absence de reconstitution immunitaire spécifique dans un contexte d’immunosuppression liée à la GVHD elle-même ou à la prophylaxie ou au traitement de la GVHD. Les traitements médicamenteux anti-viraux préconisés présentent une efficacité inconstante dans ce contexte d’immunodéficience et ne sont pas dénués de toxicité. L’alternative thérapeutique prometteuse est l’immunothérapie adoptive cellulaire notamment celle qui consiste en l’injection de lymphocytes T spécifiques anti-viraux isolés par technique immunomagnétique (VSTs). Cependant, ces lymphocytes T peuvent être la cible des traitements immunosuppresseurs administrés pour la GVHD mais également par eux-mêmes être potentiellement la cause de la survenue ou de la réactivation d’une GVHD. Nous avons montré dans ce travail que l’efficacité des VSTs, qui repose sur leur expansion in vivo lors de la rencontre avec le virus circulant, est principalement permise par les sous-populations lymphocytaires les plus immatures, même si elles ne sont présentes qu’en faible proportion. Nous défendons dans ce travail le fait que l’efficacité des VST ainsi que leur persistance repose prioritairement sur la présence des sous-populations lymphocytaires T les plus immatures et ce quel que soit le degré de compatibilité HLA entre les VSTs et le receveur. De plus, leur sensibilité modérée aux corticoïdes, que nous avons étudiée in vitro, ne justifie pas la modulation de l’immunosuppression lors de l’injection des ADV-VSTs, comme observé in vivo dans le protocole clinique multicentrique de phase I/II que nous avons mené entre 2012 et 2015. En effet, ce protocole clinique ne rapporte aucune GVHD de novo après injection d’ADV-VSTs ; en revanche, la modulation de l’immunosuppression peut potentiellement être incriminée dans la réactivation de GVHD dans les semaines suivant l’injection des ADV-VSTs. La réalisation d’un essai comparatif de phase II permettra de prouver très clairement le rôle des VSTs dans la réactivation de GVHD. / Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is one of the only curative treatments for benign or malignant hematological diseases and primary immune deficiencies. However, viral infections and graft-versus-host disease (GVHD) are among the most frequent complications after HSCT associated with high morbidity and mortality. Viral infections often occur in the absence of specific immune reconstitution in the context of immunosuppression related to GVHD itself or to the prophylaxis or treatment of GVHD. The recommended anti-viral drug treatments have an inconsistent efficacy in this context of immunodeficiency and are not devoid of toxicity. The promising therapeutic alternative is adoptive immunotherapy, in particular the infusion of specific anti-viral T lymphocytes isolated by immunomagnetic technique (VSTs). However, these T lymphocytes may be targeted by immunosuppressive treatments administered for GVHD, but also may be the cause of the onset or reactivation of GVHD. We have shown in this work that the efficacy of VSTs, which is based on their in vivo expansion when they encounter the circulating virus, is mainly allowed by the most immature lymphocyte subpopulations, even in a small proportion. We argue in this work that the efficacy of VSTs and their persistence is mainly based on the presence of the most immature T lymphocyte subpopulations and this regardless of the degree of HLA compatibility between the VSTs and the recipient. Moreover, their moderate sensitivity to corticosteroids, which we have studied in vitro, does not justify the modulation of immunosuppression at the time of infusion of ADV-VSTs, as observed in vivo in the multicenter phase I / II clinical trial we conducted between 2012 and 2015. Indeed, this clinical trial does not report any de novo GVHD after ADV-VSTs infusion. On the other hand, modulation of immunosuppression may potentially be incriminated in the reactivation of GVHD within weeks of ADV-VST infusion. A Phase II comparative trial will bring the evidence of efficacy and will clearly determine the role of VSTs in the reactivation of GVHD

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L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) représente un problème majeur de santé publique du fait de sa prévalence élevée et de la sévérité de ses complications, cirrhose et carcinome hépatocellulaire (CHC). Les objectifs du projet de thèse sont (i) de mettre en place et caractériser des modèles orthotopiques de CHC chez le petit animal (xénogreffe orthotopique de la lignée de CHC humaine Huh-7 exprimant le gène rapporteur de la luciférase chez la souris immunodéficiente) et chez le gros animal (transplantation autologue d’hépatocytes de cochon préalablement transformés ex vivo par transfert par voie lentivirale d’une combinaison de six oncogènes) et (ii) d’apporter la preuve de concept d’une approche innovante d’immunothérapie adoptive allogénique du CHC et de l’infection chronique par le VHC, par administration de lymphocytes génétiquement modifiés (LGM) allogéniques exprimant un gène de toxicité conditionnelle, ou gène suicide. Un tel gène suicide permet le contrôle des LGM, conduisant à leur élimination conditionnelle en cas d’effets secondaires indésirables. Ainsi, nous avons montré que, à dose élevée, ces LGM exercent in vitro une activité cytotoxique vis-à-vis de lignées de CHC humaines et in vivo une activité anti-tumorale vis-à-vis de tumeurs orthotopiques Huh-7. A faible dose, les LGM présentent une activité anti-virale vis-à-vis du VHC sans induire de toxicité. Ces résultats ouvrent la perspective à une approche originale d’immunothérapie du CHC, associée aux traitements actuels et de prévention de la réinfection du greffon hépatique par le VHC lors de la transplantation. / The hepatitis C virus (HCV) infection is a major problem of public health, due to its high prevalence and to the severity of its complications, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The aims of the thesis project are (i) to set up and characterize orthotopic HCC models in the small animal (orthotopic transplantation in immunodeficient mice of the human HCC cell line Huh-7, expressing the luciferase reporter gene) and in the large animal (autologous transplantation of porcine hepatocytes previously ex vivo-transformed by lentiviral-meidated transfer of a combination of six oncogenes) and (ii) to provide the proof-of-concept of an innovative adoptive allogeneic immunotherapy approach for the treatment of HCC and prevention of liver graft reinfection by HCV, through the administration of allogeneic suicide gene-modified lymphocytes (GML). Such a suicide gene allows for the control of GML, leading to their conditional elimination in case of undesirable side effects. Thus, we have demonstrated that, at high dose, these GML present an in vitro cytotoxic activity toward HCC cell lines and an in vivo antitumoral effect against orthotopic Huh-7 tumors. At low level, the GML have an antiviral activity against HCV, without toxicity against target cells. These results open the perspective for an original approach of immunotherapy for the treatment of HCC in association with current treatments and for the prevention of liver graft reinfection by HCV at time of liver transplantation.