Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’immunothérapie représente une avancée majeure dans la prise en charge des patients atteints de cancer. L’utilisation thérapeutique récente des anticorps anti-"checkpoints", qui renforcent la réponse immunitaire cellulaire naturelle anti-tumorale, a relancé l’intérêt d’approches d’immunothérapie cellulaire spécifique dans les cancers. Malgré tout, l’identification d'antigènes capables de stimuler efficacement des lymphocytes T (LT) anti-tumoraux représente un obstacle majeur au développement de telles approches. Pour identifier de tels antigènes, des cellules présentatrices d’antigène (CPA) artificielles (CPAA), capables d’exprimer, après transduction gamma-rétrovirale, des peptides directement codés ou des antigènes entiers, dégradés par ces cellules, comme le feraient des CPA humaines, en peptides présentés au sein de la molécule du CMH de classe I la plus fréquente chez l'homme, HLA-A2.1, ont été développées au laboratoire. Ces CPAA sont capables de stimuler efficacement des LT cytotoxiques (LTC) spécifiques contre des antigènes tumoraux. Deux grandes approches d’identification des antigènes tumoraux d’intérêt thérapeutique, ont été utilisées. La première est une approche directe d’identification des peptides basée sur l’élution des peptides HLA-A2.1-restreints présentés par nos CPAA et leur analyse par spectrométrie de masse. La seconde est une approche d’immunologie inverse basée sur des prédictions in silico d’épitopes HLA-A2.1-restreints reposant sur des données biochimiques des poches du CMH. Dans les deux approches, des tests fonctionnels d’activation de LTC spécifiques ont été effectués avec nos CPAA. Dans la première étude, nous avons utilisé la spectrométrie de masse en tandem couplée à la chromatographie en phase liquide, qui a été jusqu'à présent la technologie permettant l'identification rapide de centaines de ligands du CMH dans différentes approches expérimentales. En partant de CPAA codant les peptides immunogènes connus M1m, M1 ou FSP02, des LTC spécifiques de ces peptides ont été obtenus, et nous avons réussi à les caractériser par spectrométrie de masse. En partant de CPAA codant les protéines entières desquelles ces peptides sont dérivés, des LTC spécifiques des peptides ont également été obtenus mais nous n’avons pas réussi à les caractériser par spectrométrie de masse. Des peptides très immunogènes, capables de stimuler de fortes réponses immunitaires cellulaires anti-tumorales, peuvent donc échapper à une détection par spectrométrie de masse, rendant ainsi discutable l'utilisation de cette technique pour sélectionner des peptides d’intérêt clinique. Dans la deuxième étude, nous sommes partis de peptides prédits. Nous avons pu monter des réponses immunitaires spécifiques contre les néoépitopes FSP25 et FSP26 prédits in silico, dérivés de la protéine mutée CASP5 (-1) retrouvée chez 60% de patients atteints de cancer colorectal (CCR) à instabilité microsatellitaire (IMS). La CASP5 est impliquée dans l’apoptose et nous avons montré que les patients atteints d’un CCR à IMS présentant cette mutation avaient un moins bon pronostic. Nous avons également montré que chez des patients HLA-A2+ atteints d’un CCR à IMS présentant la mutation, des LTC pouvaient être obtenus contre les épitopes FSP25 et FSP26, capables de lyser spécifiquement la lignée cellulaire HLA-A2.1+ HCT116 dérivée d’un CCR à IMS présentant également la mutation, faisant de la protéine mutée CASP5 (-1) une cible thérapeutique de choix chez ces patients. Dans ces deux études, nos CPAA constituaient un outil de choix pour le développement d’approches d’immunothérapie spécifique personnalisée, soit cellulaire adoptive, pour déterminer quels antigènes devraient être ciblés ou pour directement activer et amplifier in vitro des LT injectés in vivo, soit vaccinale, pour déterminer les antigènes les plus immunogènes à inclure dans un vaccin efficace. / Immunotherapy represents a major advance in cancer patient management. Recent use of anti-checkpoint antibodies, that reinforce the natural cellular anti-tumor immune response, has revived interest for specific cellular immunotherapy approaches in cancers. Nevertheless, the difficulty of identifying highly immunogenic tumor antigens capable of specifically stimulating efficient anti-tumor T lymphocytes (TLs) is a considerable barrier to the development of such approaches. In order to identify such antigens, artificial antigen presenting cells (AAPCs) expressing the most common HLA class I molecule, HLA-A2.1, were developed in the laboratory. After gammaretroviral transduction, these AAPCs also express a directly-encoded peptide of interest or a full-length antigen, degraded by these cells into peptides as human antigen presenting cells (APCs) do. These AAPCs are capable of efficiently stimulating specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) against tumor antigens. Two major approaches for the identification of tumor antigens of therapeutic interest have been used. The first one is a direct approach of identification of HLA-A2.1-restricted peptides based on the elution of HLA-A2.1-peptide complexes expressed by our AAPCs and their analysis by mass spectrometry. The second one is a reverse immunology approach based on in silico predictions of HLA-A2.1-restricted epitopes using available MHC pocket biochemical data. In both approaches, functional tests were performed in vitro with our AAPCs to test the immunogenicity of the studied peptides. In the first study, we used tandem mass spectrometry coupled with liquid chromatography, which has been until today the technology of choice for the rapid identification of hundreds of MHC ligands in different experimental approaches. Starting from AAPCs encoding known immunogenic M1m, M1 and FSP02 peptides, specific CTLs could be obtained against these peptides, and we were able to characterize them by mass spectrometry. Starting from AAPCs encoding full length antigens from which these peptides are derived, peptide-specific CTLs were also obtained, but we were unable to characterize them by mass spectrometry. Therefore, highly immunogenic peptides, capable of stimulating strong anti-tumor cellular immune responses, may not be detected by mass spectrometry, rendering questionable the use of this technique for selecting clinically relevant peptides. In the second study, we started from predicted peptides. We were able to mount specific immune responses against FSP25 and FSP26 in silico predicted neoepitopes, derived from the CASP5 (-1) mutated protein found in 60% of microsatellite instability (MSI) colorectal cancer (CCR) patients. CASP5 is involved in programmed cell death and we have shown that MSI CRC patients whose tumors harbored this CASP5 (-1) mutation had less good prognosis. We have also shown that in HLA-A2+ MSI CASP5 (-1)-mutated CRC patients, specific CTLs could be obtained against FSP25 and FSP26 epitopes, capable of specifically lysing HLA-A2+ MSI CRC cell line HCT116 also harboring this mutation. Therefore, the mutated caspase-5 protein might be a therapeutic target of major interest for personalized specific immunotherapy strategies in the context of MSI CASP5 (-1)-mutated CRCs. In both studies, our AAPCs were a tool of choice for the development of personalized specific immunotherapy strategies, either for cellular adoptive approaches, to determine which antigens should be targeted or to directly activate and amplify in vitro antigen of interest-specific TLs which would be transferred in vivo, or for vaccine approaches, to identify the most immunogenic antigens which should be included in an efficacious vaccine

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement standard pour hémopathies bénigne ou malignes et immunodéficience primaire. Cependant, sauf le GvHD et la rechute de la maladie, l’infection microbiologique notamment l’infection virale est la complication fréquente des allogreffes qui est souvent responsable de la morbidité et la mortalité. Ces infections surviennent souvent en l’absence de reconstitution immunitaire. Les traitements médicamenteux anti-viraux qui ne sont pas toujours efficace et avec une toxicité non inégligeable. Donc le traitement prometteux est l’immunothérapie cellulaire notamment celui-ci avec l’injection de lymphocytes T spécifiques anti-viraux (VSTs). A UTCT, la production de VSTs-ADV a été mis au point depuis 2010 et une protocole clinique avec VSTs-ADV est en cours. Donc mon travail est s’inscrit dans ce thème pour produire les VSTs-EBV afin de proposer une protocole clinique. Comme les lymphocytes T ont plusieurs sous-populations, chaque sous-population présente des caractères différentes et leur efficacité en immunothérapie est limité par leur caractère. Notamment avec la découverte de Lymphocytes T mémoire à cellules souches (TSCM) qui joue un rôle très important en immunothérapie anti-cancéreux ou anti-viraux, nous nous intéréssons à étudier la compostion de sous-populations de VSTs. A la fin, c’est toujours avantageux de produire le VSTs contre deux ou plusieurs virus simutanément avec une économie financielle et personnelle. Nous voulons produire le VSTs bispécifique. Dans ce travail, premièrement, nous montrons le résulat de la mise au point de la production de VSTs-EBV de grade clinique qui est confromé à la réglémentation européenne. 6 productions ont été réalisées avec un antigène synthétique préablement défini qui est compatible avec utilisation clinique. In vitro, ces VSTs-EBV montre une spécificité, efficacité et non toxicité. Deuxième, nous illustrons nos résulats sur l’étude déscriptive de sous-populations de VSTs-ADV et CMV. D’abord nous montrons la distribution de sous-populations de VSTs chez les donneurs saints (avant la séléction), puis nous analysons la distribution après séléction immunomagnétique et aussi après expansion in vitro avec cytokine IL-2. A la fin, nous montrons nos résultats préliminaires sur les 3 productions de VSTs bispécifique anti-ADV et anti-EBV. Et nous les comprarer avec les VSTs monospécifique au niveau de qualité de production et spécificité, efficacité et toxicité in vitro / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is the standard treatment for malignant or non-malignant hematological disorders or primary immunodeficiencies. However, microbiological infections especially viral infections are the major cause for morbidity and mortality for the patients after HSCT except the GvHD and disease relapse. It comes often in the period of absence of cellular immunity when the antiviral treatment is not always efficiency with an important toxicity. So the alternative treatment is adoptive cellular immunotherapy by infusion of virus specific T cells (VSTs) which has been shown efficacy in virus infections control after HSCT. In UTCT, they have produced the VSTs-ADV with a good procedure conforming to the European laws for clinical use and a clinic trial is in processing. So my work was to produce the VSTs-EBV with the same model aiming to promote a clinic trial in future. Furthermore, there are several subsets of T lymphocytes. Each subset has their own unique feature which decides their efficacy in viral infection control. Especially the discovery of stem cell like memory T cells (TSCM) with an important self-renewed ability which is critical in successful immunotherapy in viral infection or tumor control inspire us to study the distribution of subsets for VSTs. Finally, it’s advantageous to produce the VSTs targeted two or more virus in the same time with one production which is more economical. So we are interested in producing the VSTs bi-specific to ADV and EBV. Here, we present firstly our results of six production of VSTs-EBV with a synthesized antigen which is compatible with clinic use and is defined in advance. Also the specificity, efficiency in eliminating the virus and the non toxicity with a weak alloreactivity are confirmed in vitro after a short-term cell culture with IL-2. Then we showed the results obtained with the T cell subset study in producing the VSTs-ADV for clinical trial and VSTs-CMV for validation of clinical grade medium TEXMACS for cell culture in producing the VSTs. We describe the distribution of T cell subsets in healthy donors (Before selection), also after selection and after expansion in vitro with IL-2. Finally, we present the preliminary results of producing the VSTs bi-specific with three donors, in total 3 VSTs-ADV, 3 VSTs-EBV and 3VSTs-ADV/EBV are generated. The comparison between the bi-specific VSTs and mono-specific VSTs in aspect of specificity, efficiency to eliminate the viral infection and toxicity of presenting the alloreactivity in vitro showed advantage to produce the bi-specific VSTs with one selection in keeping the same specific, efficiency and weak toxicity as mono-specific VSTs

Le traitement des leucémies myéloïdes et lymphoblastiques aiguës a connu des avancées importantes dans la dernière décennie. Malgré ces progrès, le taux de rechutes reste élevé et le besoin médical est réel. Ces leucémies sont caractérisées par une expression aberrante d’antigènes qui peuvent provenir de protéines mutées, mais aussi de séquences rapportées comme non codantes. Les réponses contre ces néoantigènes tumoraux « cryptiques » demeurent non caractérisées. Afin de définir l’existence d’un répertoire varié de récepteurs des lymphocytes T (TCR) qui reconnaitraient ces néoantigènes, des cellules mononuclées du sang périphérique de patients sains sont isolées puis enrichies en cellules T CD8+ naïves. L’expansion et l’activation de ces cellules sont ensuite réalisées avec des cellules dendritiques autologues chargées avec l’antigène d’intérêt puis triées à l’aide de multimères HLA-peptides spécifiques. L’ARN des cellules avec TCR spécifiques aux antigènes spécifiques des tumeurs (TSA) leucémiques est isolé afin de réaliser un séquençage du TCR-bêta. L’expansion cellulaire a été réalisée de façon suffisante pour effectuer le séquençage des cellules identifiées comme positives par le marquage avec dextramères. Une réponse T est obtenue pour 50% des néoantigènes testés avec une réactivité montrée par ELISpot et se traduisant par une sécrétion de cytokines inflammatoires. Des lymphocytes T spécifiques aux TSA d’intérêt sont donc présents dans le sang périphérique de donneurs sains. Le séquençage de ces cellules a permis d’identifier les clonotypes pour lesquels une réponse anti-leucémique forte est possible. Il serait intéressant d’utiliser ces clonotypes spécifiques aux tumeurs cryptiques dans le développement de nouveaux traitements d’immunothérapie adoptive. / The treatment of acute myeloid and lymphoblastic leukemia has seen significant advances in the past decade. Despite this progress, the relapse rate remains high and the medical need is real. These leukemias are characterized by an aberrant expression of antigens, some from mutated proteins but also from sequences of DNA that were reported as non-coding. Responses against these “cryptic” neoantigens remains uncharacterized. In order to verify whether a diverse repertoire of T cell receptors (TCR) does recognize these neoantigens, mononuclear cells from peripheral blood of healthy patients are isolated and enriched with naive CD8+ T cells. The expansion and activation of these cells are then carried out with autologous dendritic cells loaded with the antigen of interest and then sorted using HLA-peptide specific multimers. RNA from cells with TCR specific for leukemic tumor-specific antigens (TSA) is isolated in order to perform TCR-beta sequencing. Cell expansion was sufficient to perform the sequencing of cells identified as positive by staining with dextramers. A T-cell response is obtained for 50% of the neoantigens tested with reactivity shown by ELISpot and resulting in a secretion of inflammatory cytokines. T lymphocytes specific to the TSA of interest are therefore present in the peripheral blood of healthy donors. Sequencing of these cells made it possible to identify clonotypes for which a strong anti-leukemic response can be expected. It would be interesting to use these cryptic tumor-specific clonotypes in the development of new adoptive immunotherapy treatments.