Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-29Bitstream added on 2014-06-13T19:28:55Z : No. of bitstreams: 1 barros_ac_me_botib_parcial.pdf: 177767 bytes, checksum: 6e03eeb7f2b4d288bf363856776ce73f (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:50Z: barros_ac_me_botib_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:13Z : No. of bitstreams: 1 000691671_20150729.pdf: 177273 bytes, checksum: 1165399c11c2160349be3e18d5484858 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:21:12Z: 000691671_20150729.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:25Z : No. of bitstreams: 1 000691671.pdf: 1177243 bytes, checksum: 866f3caf560a4a70badf707c949ccf65 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A estabilidade e integridade do material genético são fundamentais para manutenção e continuação da vida. O genoma humano é composto por três bilhões de pares de bases, os quais codificam entre 30.000 – 40.000 genes, e é constantemente atacado por metabólitos reativos endógenos, drogas terapêuticas e uma infinidade de agentes mutagênicos ambientais que afetam sua integridade. Assim, é evidente que a estabilidade do genoma deve estar sob vigilância contínua. Isso é conseguido através de mecanismos de reparo de DNA, que se desenvolveram para remover ou tolerar lesões e erros no DNA. Dentre os mecanismos de reparo de DNA presentes nos organismos, eles podem ser divididos em: i) reparo por excisão de bases (BER), ii) excisão de nucleotídeos (NER), iii) mal-pareamento de bases (MMR) e iv) reparo de DNA por junção de terminais não homólogos (NHEJ). Para o que esses mecanismos funcionem de maneira adequada, é evidente a importância da interação entre proteínas responsáveis pela função de reparo, bem como é essencial a regulação da importação nuclear para localização correta das proteínas responsáveis pelos mecanismos mencionados. Dentre os mecanismos responsáveis pela regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-α/β é um dos principais mecanismos de deslocamento. Algumas proteínas de reparo parecem interagir somente com algumas isoformas da Importina-α (Imp), indicando uma regulação adicional do processo de reparo, porém, pouco se sabe a respeito do reconhecimento das sequências de localização nuclear (NLS) dessas proteínas. Esse trabalho trata especificamente do estudo do complexo estrutural de complexos de Imp com peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA utilizando... / The stability and integrity of the genetic material are essential for the maintenance and continuation of life. The human genome, comprising three billion base pairs coding for 30.000 – 40.000 genes, is constantly attacked by endogenous reactive metabolites, therapeutic drugs and a plethora of environmental mutagens that impact its integrity. Thus it is obvious that the stability of the genome must be under continuous surveillance. This is accomplished by DNA repair mechanisms, which were developed to remove or tolerate injuries and mistakes in DNA. In the DNA repair mechanisms available in the organisms, they can be divided in: i) base excision repair (BER), ii) nucleotide excision repair (NER), iii) mismatch repair (MMR) and iv) DNA repair by non-homologous end joining (NHEJ). To an adequate operation of these mechanisms, it is evident the importance of the interaction between proteins responsible for the function of DNA repair, as well as the regulation for nuclear import is essential for the correct localization of the proteins responsible for the mentioned mechanisms. In the group of the mechanisms responsible for nuclear import regulation, the classical pathway composed by Importin-α/β heterodimer is one of the major mechanisms of transport. Some DNA repair proteins seem to interact only with certain isoforms of Importin-α (Imp), indicating an additional regulation of the repair process. However, little information is known about the recognition of nuclear localization sequences (NLS) of these proteins. This work concerns specifically the structural studies of complexes with Imp and NLSs peptides from proteins related to DNA repair using crystallographic techniques. The expression and purification of Impα from Mus musculus N-terminally truncated were performed as well as the co-crystalization of... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Coorientador: Agnes Alessandra Sekijima Takeda / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: André Luis Berteli Ambrósio / Resumo: A estabilidade e integridade do material genético são fundamentais para manutenção e continuação da vida. O genoma humano é composto por três bilhões de pares de bases, os quais codificam entre 30.000 - 40.000 genes, e é constantemente atacado por metabólitos reativos endógenos, drogas terapêuticas e uma infinidade de agentes mutagênicos ambientais que afetam sua integridade. Assim, é evidente que a estabilidade do genoma deve estar sob vigilância contínua. Isso é conseguido através de mecanismos de reparo de DNA, que se desenvolveram para remover ou tolerar lesões e erros no DNA. Dentre os mecanismos de reparo de DNA presentes nos organismos, eles podem ser divididos em: i) reparo por excisão de bases (BER), ii) excisão de nucleotídeos (NER), iii) mal-pareamento de bases (MMR) e iv) reparo de DNA por junção de terminais não homólogos (NHEJ). Para o que esses mecanismos funcionem de maneira adequada, é evidente a importância da interação entre proteínas responsáveis pela função de reparo, bem como é essencial a regulação da importação nuclear para localização correta das proteínas responsáveis pelos mecanismos mencionados. Dentre os mecanismos responsáveis pela regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-α/β é um dos principais mecanismos de deslocamento. Algumas proteínas de reparo parecem interagir somente com algumas isoformas da Importina-α (Imp), indicando uma regulação adicional do processo de reparo, porém, pouco se sabe a respeito do reconhecimento das sequências de localização nuclear (NLS) dessas proteínas. Esse trabalho trata especificamente do estudo do complexo estrutural de complexos de Imp com peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA utilizando... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The stability and integrity of the genetic material are essential for the maintenance and continuation of life. The human genome, comprising three billion base pairs coding for 30.000 - 40.000 genes, is constantly attacked by endogenous reactive metabolites, therapeutic drugs and a plethora of environmental mutagens that impact its integrity. Thus it is obvious that the stability of the genome must be under continuous surveillance. This is accomplished by DNA repair mechanisms, which were developed to remove or tolerate injuries and mistakes in DNA. In the DNA repair mechanisms available in the organisms, they can be divided in: i) base excision repair (BER), ii) nucleotide excision repair (NER), iii) mismatch repair (MMR) and iv) DNA repair by non-homologous end joining (NHEJ). To an adequate operation of these mechanisms, it is evident the importance of the interaction between proteins responsible for the function of DNA repair, as well as the regulation for nuclear import is essential for the correct localization of the proteins responsible for the mentioned mechanisms. In the group of the mechanisms responsible for nuclear import regulation, the classical pathway composed by Importin-α/β heterodimer is one of the major mechanisms of transport. Some DNA repair proteins seem to interact only with certain isoforms of Importin-α (Imp), indicating an additional regulation of the repair process. However, little information is known about the recognition of nuclear localization sequences (NLS) of these proteins. This work concerns specifically the structural studies of complexes with Imp and NLSs peptides from proteins related to DNA repair using crystallographic techniques. The expression and purification of Impα from Mus musculus N-terminally truncated were performed as well as the co-crystalization of... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ney Lemke / Resumo: Os sistemas de importação nuclear são responsáveis pelo intercâmbio entre o citoplasma e o núcleo da célula, permitindo que proteínas com função nuclear migrem através da membrana que separa essas duas regiões. A via de importação mais estudada é a via clássica de importação nuclear mediada pela Importina-α (Impα). A Impα é uma proteína solenóide, composta por repetições em tandem do motivo Armadillo (ARM) que formam uma estrutura longa e contorcida, com pequenos arcabouços ao longo do eixo da proteína. As sequências de localização nuclear clássicas (cNLSs) presentes nas proteínas-alvo de importação são compostas por resíduos carregados positivamente e estabelecem pontes salinas, ligações de hidrogênio e contatos hidrofóbicos com esses arcabouços da Impα. Esse reconhecimento pode ocorrer em um ou em dois sítios da Impα, caracterizando a cNLS como monopartida ou bipartida, respectivamente. A maioria das informações estruturais do complexo cNLS-Impα provém de dados de cristalografia e pouco se sabe sobre a dinâmica conformacional deste sistema. Uma abordagem para tratar da dinâmica de um sistema é o uso de técnicas de simulação de biomoléculas, tais como dinâmica molecular e análise de modos normais. Com base nessas técnicas de simulação, o presente estudo teve como objetivo compreender os mecanismos de interação e dinâmica conformacional envolvidos no reconhecimento de cNLSs pela Impα. Particularmente, este trabalho focou nas cNLSs das proteínas Nucleoplasmina e Ku70 complexa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nuclear import systems are responsible for the exchange between the cytoplasm and the nucleus of a cell, allowing nuclear proteins to migrate through the membrane that separates these two regions. The most studied import pathway is the classical nuclear import mediated by Importin-α (Impα). Impα is a solenoid protein consisting of tandem repeats of the Armadillo (ARM) motif, forming an extended and twisted structure with small grooves along the protein axis. The classical nuclear localization sequences (cNLSs) of cargo proteins are composed of positively charged residues and establish salt bridges, hydrogen bonds and hydrophobic contacts with the grooves of Impα. Such recognition can occur at one or two sites of Impα, thus characterizing the cNLS as monopartite or bipartite, respectively. Most structural information of the cNLS-Impα complex is from crystallographic data and little is known about the conformational dynamics of this system. One approach to address the dynamics of a system is the use of biomolecular simulation techniques such as molecular dynamics and normal modes analysis. Based on these techniques, this study aimed to understand the mechanisms of interaction and conformational dynamics involved in the recognition of cNLSs by Impα. In particular, this work focused on the cNLSs of Nucleoplasmin and Ku70 proteins complexed with Impα. The study of Nucleoplasmin determined two main motions of Impα that may be associated to the cNLS recognition: bending and twisting... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tese(doutorado)-Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2011. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-06-23T16:27:42Z No. of bitstreams: 1 tese corrigida marcio figueiredo.pdf: 4782449 bytes, checksum: df5bb424fe5c9736a80fdc4a63db03a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-07-27T20:22:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese corrigida marcio figueiredo.pdf: 4782449 bytes, checksum: df5bb424fe5c9736a80fdc4a63db03a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-27T20:22:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese corrigida marcio figueiredo.pdf: 4782449 bytes, checksum: df5bb424fe5c9736a80fdc4a63db03a1 (MD5) Previous issue date: 2011 / A aquicultura tem crescido significativamente nas últimas décadas devido ao aumento da demanda de pescado no mundo e à estagnação do setor pesqueiro. Porém, este crescimento depende do desenvolvimento de novos pacotes tecnológicos que visem o aumento da produtividade. Uma alternativa é a manipulação genética (transgenia), sendo que o hormônio do crescimento (GH) tem sido o principal alvo das pesquisas com peixes transgênicos. Entretanto, está comprovado que o excesso de GH acarreta uma série de efeitos adversos devido a sua ação pleiotrópica. A ativação do eixo somatotrófico de forma tecido-específica e independente do excesso de hormônio circulante pode contornar estes problemas. Neste contexto, o objetivo desta tese foi superexpressar o gene do receptor do GH (GHR) no tecido muscular esquelético do zebrafish (Danio rerio) e estudar os efeitos desta manipulação sobre os mecanismos envolvidos na regulação gênica do crescimento muscular. A linhagem transgênica estável obtida expressa o GHR especificamente no tecido muscular 100 vezes mais do que os não transgênicos. Estes transgênicos não apresentaram aumento significativo no crescimento, provavelmente devido à queda na expressão do fator de crescimento tipo insulina I (IGF-I). Esta queda foi, provavelmente, relacionada à ação dos principais moduladores da sinalização do GH (SOCS1 e 3), os quais apresentaram-se aumentados nos transgênicos. Ainda, foi observada uma queda na expressão das principais proteínas musculares estruturais (Acta1, myhc4 e mylz2), o que explica a ausência de hipertrofia nos transgênicos. Por outro lado, o aumento na expressão dos principais fatores reguladores miogênicos (myod, myf5 e myog) explica a hiperplasia observada nas análises histológicas. Para verificar como a superexpressão do GHR ativou a transcrição dos fatores reguladores miogênicos (MRFs) e, por consequência a hiperplasia, foram estudados os possíveis mecanismos envolvidos neste processo. Dentre estes, tanto a via proliferativa (MEK/ERK) quanto à via relacionada com a síntese protéica (PI3K/Akt), não tiveram alteração na expressão de seus genes. Entretanto, foi observado aumento na expressão das proteínas de transporte para o núcleo (importinas 1, 3 e 1), podendo-se concluir que a ativação dos MRFs está relacionada ao transporte do GHR para o núcleo das células musculares. Desta forma, pode se concluir que hiperplasia e hipertrofia seguem duas vias de sinalização intracelular distintas, ambas desencadeadas pelo GH, mas reguladas por mecanismos diferentes. / Aquiculture practice has been significantly increasing during the last decades due to the fish rising demand and to fishery activity stagnation. However, such increase depends on new technological packages development aiming to productivity rises. Genetic manipulation is an alternative, once growth hormone (GH) has been the main target on transgenic fish researches. Nevertheless, it has been proved that GH excess leads to many adverse effects due to its pleiotropic action. The somatotropic axis activation in a tissue-specific manner and independent on the circulating hormone excess may bypass these problems. Following these ideas, the present thesis objective was overexpressing GH receptor’s gene (GHR), in zebrafish (Danio rerio) skeletal muscular tissue, and studying such manipulation effects over the mechanisms involved in muscular growth gene regulation. The stable transgenic lineage obtained expresses GHR, specifically in muscular tissue, 100 times more than non-transgenic. These transgenic did not present significant growth, possibly due to a gene expression fall in insulin-like growth factor I (IGF-I). The mentioned fall is, probably, related to GH main signaling modulators (SOCS1 and 3) action, which were increased in transgenic. Also, a gene expression fall from the main structural muscle proteins (Acta1, myhc4 and mylz2) was observed, explaining the transgenic hypertrophy absence. However, the main myogenic regulatory factors (myod, myf5 and myog) expression rising explains the observed hyperplasia in histological analysis. Intending to verify how GHR overexpression has activated the myogenic regulatory factors (MRFs) transcription and, consequently, the hyperplasia, the mechanisms possibly involved in this process were studied. Among these, even the proliferative pathway (MEK/ERK) or the pathway related to protein synthesis (PI3K/Akt), did not presented gene expression altering. However, a gene expression rise in transporting proteins into nucleus (importins 1, 3 and 1) was observed, which may be understood as a correlation between MRFs activation and GHR transport into muscular cell’s nucleus. Therefore, it may be understood that hyperplasia and hypertrophy follow two distinct intracellular signaling pathways, both triggered by GH, but regulated by different mechanisms. These data may be important for aquiculture new transgenic lineages development.