Tese(doutorado)-Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2011. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-06-23T16:27:42Z No. of bitstreams: 1 tese corrigida marcio figueiredo.pdf: 4782449 bytes, checksum: df5bb424fe5c9736a80fdc4a63db03a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-07-27T20:22:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese corrigida marcio figueiredo.pdf: 4782449 bytes, checksum: df5bb424fe5c9736a80fdc4a63db03a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-27T20:22:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese corrigida marcio figueiredo.pdf: 4782449 bytes, checksum: df5bb424fe5c9736a80fdc4a63db03a1 (MD5) Previous issue date: 2011 / A aquicultura tem crescido significativamente nas últimas décadas devido ao aumento da demanda de pescado no mundo e à estagnação do setor pesqueiro. Porém, este crescimento depende do desenvolvimento de novos pacotes tecnológicos que visem o aumento da produtividade. Uma alternativa é a manipulação genética (transgenia), sendo que o hormônio do crescimento (GH) tem sido o principal alvo das pesquisas com peixes transgênicos. Entretanto, está comprovado que o excesso de GH acarreta uma série de efeitos adversos devido a sua ação pleiotrópica. A ativação do eixo somatotrófico de forma tecido-específica e independente do excesso de hormônio circulante pode contornar estes problemas. Neste contexto, o objetivo desta tese foi superexpressar o gene do receptor do GH (GHR) no tecido muscular esquelético do zebrafish (Danio rerio) e estudar os efeitos desta manipulação sobre os mecanismos envolvidos na regulação gênica do crescimento muscular. A linhagem transgênica estável obtida expressa o GHR especificamente no tecido muscular 100 vezes mais do que os não transgênicos. Estes transgênicos não apresentaram aumento significativo no crescimento, provavelmente devido à queda na expressão do fator de crescimento tipo insulina I (IGF-I). Esta queda foi, provavelmente, relacionada à ação dos principais moduladores da sinalização do GH (SOCS1 e 3), os quais apresentaram-se aumentados nos transgênicos. Ainda, foi observada uma queda na expressão das principais proteínas musculares estruturais (Acta1, myhc4 e mylz2), o que explica a ausência de hipertrofia nos transgênicos. Por outro lado, o aumento na expressão dos principais fatores reguladores miogênicos (myod, myf5 e myog) explica a hiperplasia observada nas análises histológicas. Para verificar como a superexpressão do GHR ativou a transcrição dos fatores reguladores miogênicos (MRFs) e, por consequência a hiperplasia, foram estudados os possíveis mecanismos envolvidos neste processo. Dentre estes, tanto a via proliferativa (MEK/ERK) quanto à via relacionada com a síntese protéica (PI3K/Akt), não tiveram alteração na expressão de seus genes. Entretanto, foi observado aumento na expressão das proteínas de transporte para o núcleo (importinas 1, 3 e 1), podendo-se concluir que a ativação dos MRFs está relacionada ao transporte do GHR para o núcleo das células musculares. Desta forma, pode se concluir que hiperplasia e hipertrofia seguem duas vias de sinalização intracelular distintas, ambas desencadeadas pelo GH, mas reguladas por mecanismos diferentes. / Aquiculture practice has been significantly increasing during the last decades due to the fish rising demand and to fishery activity stagnation. However, such increase depends on new technological packages development aiming to productivity rises. Genetic manipulation is an alternative, once growth hormone (GH) has been the main target on transgenic fish researches. Nevertheless, it has been proved that GH excess leads to many adverse effects due to its pleiotropic action. The somatotropic axis activation in a tissue-specific manner and independent on the circulating hormone excess may bypass these problems. Following these ideas, the present thesis objective was overexpressing GH receptor’s gene (GHR), in zebrafish (Danio rerio) skeletal muscular tissue, and studying such manipulation effects over the mechanisms involved in muscular growth gene regulation. The stable transgenic lineage obtained expresses GHR, specifically in muscular tissue, 100 times more than non-transgenic. These transgenic did not present significant growth, possibly due to a gene expression fall in insulin-like growth factor I (IGF-I). The mentioned fall is, probably, related to GH main signaling modulators (SOCS1 and 3) action, which were increased in transgenic. Also, a gene expression fall from the main structural muscle proteins (Acta1, myhc4 and mylz2) was observed, explaining the transgenic hypertrophy absence. However, the main myogenic regulatory factors (myod, myf5 and myog) expression rising explains the observed hyperplasia in histological analysis. Intending to verify how GHR overexpression has activated the myogenic regulatory factors (MRFs) transcription and, consequently, the hyperplasia, the mechanisms possibly involved in this process were studied. Among these, even the proliferative pathway (MEK/ERK) or the pathway related to protein synthesis (PI3K/Akt), did not presented gene expression altering. However, a gene expression rise in transporting proteins into nucleus (importins 1, 3 and 1) was observed, which may be understood as a correlation between MRFs activation and GHR transport into muscular cell’s nucleus. Therefore, it may be understood that hyperplasia and hypertrophy follow two distinct intracellular signaling pathways, both triggered by GH, but regulated by different mechanisms. These data may be important for aquiculture new transgenic lineages development.

Atualmente, a maioria dos endocrinologistas pediátricos usa uma dose fixa de GH, calculada por quilo de peso ou área de superfície corporal, para todos os pacientes. Algumas crianças com DGH, tratadas com as doses atuais, não atingem uma estatura normal e outras não atingem a estatura-alvo geneticamente prevista pela altura dos pais. Além disso, algumas crianças com DGH desenvolvem características acromegalóides após o uso por longo prazo da medicação. A existência de um marcador preciso e eficiente seria útil para a individualização da dose de rGH. Esse marcador deveria ser mensurado em um período de tempo menor que a velocidade de crescimento (VC). Neste estudo usamos as concentrações de IGF-I como esse marcador. Durante 12 meses, acompanhamos trinta crianças portadoras de DGH grave, em tratamento prévio por cerca de quatro anos, divididas em dois grupos de 15, para comparar o tratamento com a dose de rGH baseada no peso versus o tratamento com a dose de rGH ajustada pelas concentrações de IGF-I para mantê-las em uma faixa alvo (entre 0 a +2 DP). Foi possível manter concentrações de IGF-I dentro de valores predeterminados pelo ajuste da dose de rGH em 13 dos 15 pacientes, mas a VC não foi diferente entre os grupos (6,8±2,6 vs. 6,9±2,7 cm/ano; p=NS); porém, quando considerados apenas os pacientes prépúberes que mantiveram concentrações de IGF-I entre 0 e +2DP em pelo menos 75% das dosagens, sua velocidade de crescimento foi maior em comparação com as crianças que mantiveram concentrações de IGF-I abaixo de 0DP em 50% ou mais das dosagens (8,8±1,8 vs. 6,3±2,9 cm/ano; p<0,05). Em paralelo, comparamos as concentrações de IGF-I de diferentes genótipos do exon 3 do receptor de GH (GHR), nessas trinta crianças, durante o tratamento. Duas das mais comuns isoformas em seres humanos são geradas pela retenção (full length GHR - GHRfl) e exclusão do exon 3 (exon 3 deleted GHR - GHRd3). A influência desse polimorfismo na resposta ao tratamento com rGH em pacientes com DGH tem sido alvo de controvérsia. No presente estudo, apesar de receberem a mesma dose de rGH (41±10 vs. 41±8 ug/kg d; p=NS), pacientes carreando ao menos um alelo-d3 GHR, como grupo, tiveram maiores níveis de IGF-I que aqueles homozigotos para o alelo GHR full-length (0,9±0,9 vs. -0,3±1,2 DP; p<0,05) , indicando uma melhor sensibilidade ao GH para o primeiro genótipo. A VC não foi diferente entre os grupos GHRd3 vs. GHRfl (7,3±1,9 vs. 6,4±3,1cm/ano; p=NS). / Currently, most pediatric endocrinologists use a fixed rGH dose calculated according to the weight or body surface area for all patients. Some children with GHD, treated with the present doses, do not achieve normal height, and some, even reaching normal height, do not achieve the genetic target height determined by their parents\' heights. At the same time, some children with GHD develop acromegalic characteristics after long-term treatment with rGH. The existence of a specific and effective marker to individualize rGH dose would be useful to control therapy of children with GHD. This marker ideally should be obtained in a shorter time interval than the growth velocity (GV). In the present study, we measured insulin-like growth factor (IGF-I) as this marker. During one year, we followed 30 children with severe GHD, treated previously with rGH for an average of 4yrs, divided in two groups of 15, to compare weight-based versus IGF-I-based rGH dosing to reach IGF-I levels between a target range (0 and +2 SDS). It was feasible to maintain IGF-I levels in this predetermined range by adjusting the rGH dose in 13 of 15 patients, but growth velocity was not different in groups with weight-based or IGF-I based rGH dose (6.8±2.6 vs. 6.9±2.7cm/y; p=NS); however, in prepubertal children who reached predetermined target IGF-I levels in 75% of the measurements GV was higher than in those who did not (8.8±1.8 vs. 6.3±2.9 cm/y; p<0.05). In parallel, we compared IGF-I levels of different GH receptor (GHR) exon 3 genotypes in these 30 children during treatment. Two of the more common GHR isoforms in humans are generated by retention (full length GHR - GHRfl) and by exclusion of exon 3 (exon 3 deleted GHR - GHRd3). The influence of this polymorphism on the response to rGH treatment in patients with GH deficiency has been controversial. In the present study, despite receiving similar rGH doses (41±10 vs. 41±8 ug/kg d; p=NS), patients carrying at least one GHR d3-allele, as a group, had higher IGF-I levels than those homozygous for the GHR full-length allele (0.9±0.9 vs. -0.3±1.2 SDS; p<0.05), indicating a greater GH sensitivity with the former genotype. GV was not different between groups GHRd3 vs. GHRfl (7.3±1.9 vs. 6.4±3.1cm/y; p=NS).

Atualmente, a maioria dos endocrinologistas pediátricos usa uma dose fixa de GH, calculada por quilo de peso ou área de superfície corporal, para todos os pacientes. Algumas crianças com DGH, tratadas com as doses atuais, não atingem uma estatura normal e outras não atingem a estatura-alvo geneticamente prevista pela altura dos pais. Além disso, algumas crianças com DGH desenvolvem características acromegalóides após o uso por longo prazo da medicação. A existência de um marcador preciso e eficiente seria útil para a individualização da dose de rGH. Esse marcador deveria ser mensurado em um período de tempo menor que a velocidade de crescimento (VC). Neste estudo usamos as concentrações de IGF-I como esse marcador. Durante 12 meses, acompanhamos trinta crianças portadoras de DGH grave, em tratamento prévio por cerca de quatro anos, divididas em dois grupos de 15, para comparar o tratamento com a dose de rGH baseada no peso versus o tratamento com a dose de rGH ajustada pelas concentrações de IGF-I para mantê-las em uma faixa alvo (entre 0 a +2 DP). Foi possível manter concentrações de IGF-I dentro de valores predeterminados pelo ajuste da dose de rGH em 13 dos 15 pacientes, mas a VC não foi diferente entre os grupos (6,8±2,6 vs. 6,9±2,7 cm/ano; p=NS); porém, quando considerados apenas os pacientes prépúberes que mantiveram concentrações de IGF-I entre 0 e +2DP em pelo menos 75% das dosagens, sua velocidade de crescimento foi maior em comparação com as crianças que mantiveram concentrações de IGF-I abaixo de 0DP em 50% ou mais das dosagens (8,8±1,8 vs. 6,3±2,9 cm/ano; p<0,05). Em paralelo, comparamos as concentrações de IGF-I de diferentes genótipos do exon 3 do receptor de GH (GHR), nessas trinta crianças, durante o tratamento. Duas das mais comuns isoformas em seres humanos são geradas pela retenção (full length GHR - GHRfl) e exclusão do exon 3 (exon 3 deleted GHR - GHRd3). A influência desse polimorfismo na resposta ao tratamento com rGH em pacientes com DGH tem sido alvo de controvérsia. No presente estudo, apesar de receberem a mesma dose de rGH (41±10 vs. 41±8 ug/kg d; p=NS), pacientes carreando ao menos um alelo-d3 GHR, como grupo, tiveram maiores níveis de IGF-I que aqueles homozigotos para o alelo GHR full-length (0,9±0,9 vs. -0,3±1,2 DP; p<0,05) , indicando uma melhor sensibilidade ao GH para o primeiro genótipo. A VC não foi diferente entre os grupos GHRd3 vs. GHRfl (7,3±1,9 vs. 6,4±3,1cm/ano; p=NS). / Currently, most pediatric endocrinologists use a fixed rGH dose calculated according to the weight or body surface area for all patients. Some children with GHD, treated with the present doses, do not achieve normal height, and some, even reaching normal height, do not achieve the genetic target height determined by their parents\' heights. At the same time, some children with GHD develop acromegalic characteristics after long-term treatment with rGH. The existence of a specific and effective marker to individualize rGH dose would be useful to control therapy of children with GHD. This marker ideally should be obtained in a shorter time interval than the growth velocity (GV). In the present study, we measured insulin-like growth factor (IGF-I) as this marker. During one year, we followed 30 children with severe GHD, treated previously with rGH for an average of 4yrs, divided in two groups of 15, to compare weight-based versus IGF-I-based rGH dosing to reach IGF-I levels between a target range (0 and +2 SDS). It was feasible to maintain IGF-I levels in this predetermined range by adjusting the rGH dose in 13 of 15 patients, but growth velocity was not different in groups with weight-based or IGF-I based rGH dose (6.8±2.6 vs. 6.9±2.7cm/y; p=NS); however, in prepubertal children who reached predetermined target IGF-I levels in 75% of the measurements GV was higher than in those who did not (8.8±1.8 vs. 6.3±2.9 cm/y; p<0.05). In parallel, we compared IGF-I levels of different GH receptor (GHR) exon 3 genotypes in these 30 children during treatment. Two of the more common GHR isoforms in humans are generated by retention (full length GHR - GHRfl) and by exclusion of exon 3 (exon 3 deleted GHR - GHRd3). The influence of this polymorphism on the response to rGH treatment in patients with GH deficiency has been controversial. In the present study, despite receiving similar rGH doses (41±10 vs. 41±8 ug/kg d; p=NS), patients carrying at least one GHR d3-allele, as a group, had higher IGF-I levels than those homozygous for the GHR full-length allele (0.9±0.9 vs. -0.3±1.2 SDS; p<0.05), indicating a greater GH sensitivity with the former genotype. GV was not different between groups GHRd3 vs. GHRfl (7.3±1.9 vs. 6.4±3.1cm/y; p=NS).