A pré-eclâmpsia (PE) é uma doença multifatorial de etiologia ainda não completamente esclarecida. A hipertensão arterial sistêmica e proteinúria maciça que surgem após a 20ª semana de gestação são as características marcantes desta enfermidade. Fatores genéticos, endoteliais e imunológicos, além de taxa de apoptose alterada, falha na invasão trofoblástica e estresse psicossocial também estão envolvidos com o desenvolvimento de PE. Mulheres grávidas apresentam uma maior vulnerabilidade ao estresse, devido às constantes alterações hormonais durante a gestação. O hormônio cortisol, também chamado de hormônio do estresse, é produzido pela supra-renal e atua em várias células e tecidos, a partir da sua ligação com receptores específicos (receptores de glicocorticóide – GR). Níveis elevados de cortisol podem desencadear apoptose celular devido ao aumento do estresse oxidativo. O gene NR3C1 codifica o GR, essencial para a interação entre o cortisol e os diversos mecanismos fisiológicos. A presença de polimorfismos como o BclI (rs41423247) e ER22/23EK (rs6189/6190) já foi relacionada com uma maior ou menor sensibilidade ao cortisol, respectivamente. Dessa maneira, objetivamos investigar a frequência destes polimorfismos em gestantes saudáveis e com PE. Além disso, avaliamos também a presença de polimorfismos em genes que codificam proteínas chave na cascata de apoptose (rs1042522, rs2279744, rs929271 nos genes TP53, MDM2 e LIF respectivamente) e sua relação com a PE. O alelo A do polimorfismo ER22/23EK esteve mais presente no grupo controle, enquanto que o alelo G do polimorfismo BclI apresentou maior frequência em grávidas que desenvolveram a forma leve de PE. Nenhuma diferença entre mulheres com PE e o grupo controle foi observada em relação aos polimorfismos em genes de cascata apoptótica. Concluímos que alterações genéticas no gene codificador dos receptores de cortisol podem afetar a resposta frente ao estresse, aumentando a probabilidade para o desenvolvimento de PE. Porém, os genes envolvidos na via apoptótica aqui avaliados não parecem estar relacionados com esta desordem. Mais pesquisas devem ser realizadas buscando elucidar a complexa fisiopatologia da pré-eclampsia. / Preeclampsia (PE) is a multifactorial disease which etiology is not fully elucidated. Systemic hypertension and massive proteinuria that arise after the 20th week of pregnancy are the hallmarks of this disorder. Genetic, endothelial and immune factors, modified rate of apoptosis, trophoblast invasion failure and psychosocial stress are also involved with PE development. Pregnant women have an increased vulnerability to stress due to constant hormonal changes during pregnancy. The cortisol hormone, also called the stress hormone, is produced by the adrenal and acts on several cells and tissues trough its binding to specific receptors (glucocorticoid receptor – GR). High cortisol levels may trigger apoptosis due to increased oxidative stress. The gene NR3C1 encodes the GR, essential for the interaction between cortisol and the various physiological mechanisms. The presence of polymorphisms as BclI (rs41423247) and ER22/23EK (rs6189/6190) has been associated with a higher and lower sensitivity to cortisol, respectively. Thus, we aimed to investigate the frequency of these polymorphisms in healthy and PE pregnant. Moreover, we also assessed the presence of polymorphisms in genes that encode key proteins in the apoptosis pathway (rs1042522, rs2279744, rs929271 in TP53, MDM2 and LIF genes) and its relationship with PE. The A allele of the ER22/23EK polymorphism was more frequent in the control group, while the G allele of the BclI polymorphism had a higher frequency in pregnant women who developed mild PE. No differences between women with PE and the control group were observed for polymorphisms in genes of apoptotic pathway. We conclude that genetic alterations of cortisol receptors may affect the response to stress, modulating the development of PE. However genes of apoptotic pathway evaluated here do not seem to be related to this disorder. More research should be done seeking to elucidate the complex pathophysiology of preeclampsia.

Os fatores que afetam a susceptibilidade a infecção com E. granulosus são pouco conhecidos. Neste trabalho, foi avaliada a interação de protoescólices e um antígeno imunodominante secretado (AgB) de E. granulosus com neutrófilos humanos saudáveis. A intensidade de expressão de CD11b e produção de H2O2 foram avaliadas por citometria de fluxo usando sangue total. Os neutrófilos isolados também foram incubados com protoescólices ou AgB, e a interleucina 8 (IL-8) foi determinada por ELISA de captura. Os protoescólices induziram um aumento significativo na expressão de CD11b em neutrófilos (p=0,026) e na produção de H2O2 (p=0,026), entretanto a sua viabilidade não foi afetada. Em contraste, nenhum efeito foi observado com o AgB em ambos ensaios. Uma moderada produção de IL-8 foi detectada somente em sobrenadantes de neutrófilos cultivados com protoescólices comparada com a produção basal (p=0,028). O efeito de uma incubação prévia com o AgB foi avaliada em relação a expressão de CD11 e H2O2 induzida pelo tratamento dos neutrófilos com forbol meristato acetato (PMA). Nenhuma mudança foi observada na expressão de CD11b, entretanto, a intensidade de produção de H2O2 foi significantemente reduzida em comparação ao tratamento apenas com PMA (p=0,038) quando o fator ativador de plaquetas (PAF) foi usado como priming. Como os protoescólices ocasionalmente podem ser liberados dos cistos em compartimentos do hospedeiro causando a hidatidose secundária, estes resultados contribuem para elucidação da defesa do hospedeiro e dos mecanismos imunomoduladores do parasito. A identificação de produtos de secreção e/ou excreção de protoescólices de E. granulosus também foi avaliada neste trabalho. Os produtos de secreção e/ou excreção foram obtidos a partir das primeiras 48 h de cultivo de protoescólices in vitro. A caracterização imunológica foi feita por western blotting com um pool de soros de indivíduos infectados com hidatidose cística. Os produtos de secreção e/ou excreção também foram analisados por espectrometria de massas. As preparações de seis diferentes amostras de protoescólices continham componentes protéicos, os quais foram visualizados por SDS-PAGE com aparentes massas moleculares entre 10 e 200 kDa. Os ensaios de western blotting mostraram a presença de diversos antígenos imunogênicos de massas moleculares maiores (acima de 50 kDa), e do AgB. Os resultados de espectrometria de massas foram obtidos com um pool de seis amostras de sobrenadantes de cultivo contendo produtos de secreção e/ou excreção, e foram identificadas onze proteínas: malato desidrogenase, ciclofilina, miofilina, P-29, 14-3-3, enolase, duas serinoproteases, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e tiorredoxina peroxidase. Estes resultados também podem contribuir para elucidação de novos aspectos da complexa interação parasito-hospedeiro, e de mecanismos imunomoduladores, uma vez que as proteínas secretadas podem estar diretamente envolvidas nesses processos. / The factors affecting innate susceptibility to infection with E. granulosus are little known. In this work, the interaction of healthy human neutrophils with protoscoleces and a secreted immunodominant antigen (AgB) of E. granulosus was assessed. The intensity of CD11b expression and H2O2 production were evaluated by flow cytometry using whole blood. Isolated neutrophils were incubated also with PSC or AgB and interleukin 8 (IL-8) was measured by capture ELISA. The protoscoleces induced a significant increment of CD11b expression in neutrophils (p=0.026) and of H2O2 production (p=0.026), however their viability was not affected. In contrast, no effect was observed with AgB in both assays. A moderate IL-8 production was detected only in supernatants from neutrophils cultured with protoscoleces compared with basal production (p=0.028). The effect of previous AgB incubation was evaluated in relation with CD11b and H2O2 expression induced by phorbol meristate acetate (PMA) treatment. No changes were observed with CD11 expression, however the magnitude of H2O2 production was significant decreased in comparison with PMA alone (p=0.038) when platelet–activating factor was used for priming. As protoscoleces occasionally spillaged from cysts into compartments of the host causing secondary cysts, these results contribute to the elucidation of the host defense and parasite immunomodulatory mechanisms involved. The identification of excretory and/or secretory products from E. granulosus protoscoleces also was assessed in this work. Excretory and/or secretory products were obtained from the first 48 h maintenance of protoscoleces in vitro. Immunological characterization was performed by western blotting with a pool of sera from individuals infected by cystic hydatidosis. Excretory and/or secretory products also were assessed by mass spectrometry. The preparations of six differents sample of protoscoleces contained components proteins which could be distinguished by SDS-PAGE with apparent molecular masses between 10 and 200 kDa. The assays of western blotting showed the presence of the several immunogenic antigens of major molecular masses (above 50 kDa), and of the AgB. The results of the mass espectrometry were obtained with a pool of six cultive sobrenadants sample containing excretory and/or secretory products, and were identified eleven proteins: malate dehydrogenase, cyclofilin, myophilin, P-29, 14-3-3, enolase, tegumental protein, two serineproteases, phosphoenolpyruvate carboxykinase and thioredoxin peroxidase. These results can contribute also for elucidate novel aspects of the complex interaction host-parasite and of the immunomodulatory mechanisms, since that secreted proteins can be directly involved in these process.

A pré-eclâmpsia (PE) é uma doença multifatorial de etiologia ainda não completamente esclarecida. A hipertensão arterial sistêmica e proteinúria maciça que surgem após a 20ª semana de gestação são as características marcantes desta enfermidade. Fatores genéticos, endoteliais e imunológicos, além de taxa de apoptose alterada, falha na invasão trofoblástica e estresse psicossocial também estão envolvidos com o desenvolvimento de PE. Mulheres grávidas apresentam uma maior vulnerabilidade ao estresse, devido às constantes alterações hormonais durante a gestação. O hormônio cortisol, também chamado de hormônio do estresse, é produzido pela supra-renal e atua em várias células e tecidos, a partir da sua ligação com receptores específicos (receptores de glicocorticóide – GR). Níveis elevados de cortisol podem desencadear apoptose celular devido ao aumento do estresse oxidativo. O gene NR3C1 codifica o GR, essencial para a interação entre o cortisol e os diversos mecanismos fisiológicos. A presença de polimorfismos como o BclI (rs41423247) e ER22/23EK (rs6189/6190) já foi relacionada com uma maior ou menor sensibilidade ao cortisol, respectivamente. Dessa maneira, objetivamos investigar a frequência destes polimorfismos em gestantes saudáveis e com PE. Além disso, avaliamos também a presença de polimorfismos em genes que codificam proteínas chave na cascata de apoptose (rs1042522, rs2279744, rs929271 nos genes TP53, MDM2 e LIF respectivamente) e sua relação com a PE. O alelo A do polimorfismo ER22/23EK esteve mais presente no grupo controle, enquanto que o alelo G do polimorfismo BclI apresentou maior frequência em grávidas que desenvolveram a forma leve de PE. Nenhuma diferença entre mulheres com PE e o grupo controle foi observada em relação aos polimorfismos em genes de cascata apoptótica. Concluímos que alterações genéticas no gene codificador dos receptores de cortisol podem afetar a resposta frente ao estresse, aumentando a probabilidade para o desenvolvimento de PE. Porém, os genes envolvidos na via apoptótica aqui avaliados não parecem estar relacionados com esta desordem. Mais pesquisas devem ser realizadas buscando elucidar a complexa fisiopatologia da pré-eclampsia. / Preeclampsia (PE) is a multifactorial disease which etiology is not fully elucidated. Systemic hypertension and massive proteinuria that arise after the 20th week of pregnancy are the hallmarks of this disorder. Genetic, endothelial and immune factors, modified rate of apoptosis, trophoblast invasion failure and psychosocial stress are also involved with PE development. Pregnant women have an increased vulnerability to stress due to constant hormonal changes during pregnancy. The cortisol hormone, also called the stress hormone, is produced by the adrenal and acts on several cells and tissues trough its binding to specific receptors (glucocorticoid receptor – GR). High cortisol levels may trigger apoptosis due to increased oxidative stress. The gene NR3C1 encodes the GR, essential for the interaction between cortisol and the various physiological mechanisms. The presence of polymorphisms as BclI (rs41423247) and ER22/23EK (rs6189/6190) has been associated with a higher and lower sensitivity to cortisol, respectively. Thus, we aimed to investigate the frequency of these polymorphisms in healthy and PE pregnant. Moreover, we also assessed the presence of polymorphisms in genes that encode key proteins in the apoptosis pathway (rs1042522, rs2279744, rs929271 in TP53, MDM2 and LIF genes) and its relationship with PE. The A allele of the ER22/23EK polymorphism was more frequent in the control group, while the G allele of the BclI polymorphism had a higher frequency in pregnant women who developed mild PE. No differences between women with PE and the control group were observed for polymorphisms in genes of apoptotic pathway. We conclude that genetic alterations of cortisol receptors may affect the response to stress, modulating the development of PE. However genes of apoptotic pathway evaluated here do not seem to be related to this disorder. More research should be done seeking to elucidate the complex pathophysiology of preeclampsia.

Os fatores que afetam a susceptibilidade a infecção com E. granulosus são pouco conhecidos. Neste trabalho, foi avaliada a interação de protoescólices e um antígeno imunodominante secretado (AgB) de E. granulosus com neutrófilos humanos saudáveis. A intensidade de expressão de CD11b e produção de H2O2 foram avaliadas por citometria de fluxo usando sangue total. Os neutrófilos isolados também foram incubados com protoescólices ou AgB, e a interleucina 8 (IL-8) foi determinada por ELISA de captura. Os protoescólices induziram um aumento significativo na expressão de CD11b em neutrófilos (p=0,026) e na produção de H2O2 (p=0,026), entretanto a sua viabilidade não foi afetada. Em contraste, nenhum efeito foi observado com o AgB em ambos ensaios. Uma moderada produção de IL-8 foi detectada somente em sobrenadantes de neutrófilos cultivados com protoescólices comparada com a produção basal (p=0,028). O efeito de uma incubação prévia com o AgB foi avaliada em relação a expressão de CD11 e H2O2 induzida pelo tratamento dos neutrófilos com forbol meristato acetato (PMA). Nenhuma mudança foi observada na expressão de CD11b, entretanto, a intensidade de produção de H2O2 foi significantemente reduzida em comparação ao tratamento apenas com PMA (p=0,038) quando o fator ativador de plaquetas (PAF) foi usado como priming. Como os protoescólices ocasionalmente podem ser liberados dos cistos em compartimentos do hospedeiro causando a hidatidose secundária, estes resultados contribuem para elucidação da defesa do hospedeiro e dos mecanismos imunomoduladores do parasito. A identificação de produtos de secreção e/ou excreção de protoescólices de E. granulosus também foi avaliada neste trabalho. Os produtos de secreção e/ou excreção foram obtidos a partir das primeiras 48 h de cultivo de protoescólices in vitro. A caracterização imunológica foi feita por western blotting com um pool de soros de indivíduos infectados com hidatidose cística. Os produtos de secreção e/ou excreção também foram analisados por espectrometria de massas. As preparações de seis diferentes amostras de protoescólices continham componentes protéicos, os quais foram visualizados por SDS-PAGE com aparentes massas moleculares entre 10 e 200 kDa. Os ensaios de western blotting mostraram a presença de diversos antígenos imunogênicos de massas moleculares maiores (acima de 50 kDa), e do AgB. Os resultados de espectrometria de massas foram obtidos com um pool de seis amostras de sobrenadantes de cultivo contendo produtos de secreção e/ou excreção, e foram identificadas onze proteínas: malato desidrogenase, ciclofilina, miofilina, P-29, 14-3-3, enolase, duas serinoproteases, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e tiorredoxina peroxidase. Estes resultados também podem contribuir para elucidação de novos aspectos da complexa interação parasito-hospedeiro, e de mecanismos imunomoduladores, uma vez que as proteínas secretadas podem estar diretamente envolvidas nesses processos. / The factors affecting innate susceptibility to infection with E. granulosus are little known. In this work, the interaction of healthy human neutrophils with protoscoleces and a secreted immunodominant antigen (AgB) of E. granulosus was assessed. The intensity of CD11b expression and H2O2 production were evaluated by flow cytometry using whole blood. Isolated neutrophils were incubated also with PSC or AgB and interleukin 8 (IL-8) was measured by capture ELISA. The protoscoleces induced a significant increment of CD11b expression in neutrophils (p=0.026) and of H2O2 production (p=0.026), however their viability was not affected. In contrast, no effect was observed with AgB in both assays. A moderate IL-8 production was detected only in supernatants from neutrophils cultured with protoscoleces compared with basal production (p=0.028). The effect of previous AgB incubation was evaluated in relation with CD11b and H2O2 expression induced by phorbol meristate acetate (PMA) treatment. No changes were observed with CD11 expression, however the magnitude of H2O2 production was significant decreased in comparison with PMA alone (p=0.038) when platelet–activating factor was used for priming. As protoscoleces occasionally spillaged from cysts into compartments of the host causing secondary cysts, these results contribute to the elucidation of the host defense and parasite immunomodulatory mechanisms involved. The identification of excretory and/or secretory products from E. granulosus protoscoleces also was assessed in this work. Excretory and/or secretory products were obtained from the first 48 h maintenance of protoscoleces in vitro. Immunological characterization was performed by western blotting with a pool of sera from individuals infected by cystic hydatidosis. Excretory and/or secretory products also were assessed by mass spectrometry. The preparations of six differents sample of protoscoleces contained components proteins which could be distinguished by SDS-PAGE with apparent molecular masses between 10 and 200 kDa. The assays of western blotting showed the presence of the several immunogenic antigens of major molecular masses (above 50 kDa), and of the AgB. The results of the mass espectrometry were obtained with a pool of six cultive sobrenadants sample containing excretory and/or secretory products, and were identified eleven proteins: malate dehydrogenase, cyclofilin, myophilin, P-29, 14-3-3, enolase, tegumental protein, two serineproteases, phosphoenolpyruvate carboxykinase and thioredoxin peroxidase. These results can contribute also for elucidate novel aspects of the complex interaction host-parasite and of the immunomodulatory mechanisms, since that secreted proteins can be directly involved in these process.

Os fatores que afetam a susceptibilidade a infecção com E. granulosus são pouco conhecidos. Neste trabalho, foi avaliada a interação de protoescólices e um antígeno imunodominante secretado (AgB) de E. granulosus com neutrófilos humanos saudáveis. A intensidade de expressão de CD11b e produção de H2O2 foram avaliadas por citometria de fluxo usando sangue total. Os neutrófilos isolados também foram incubados com protoescólices ou AgB, e a interleucina 8 (IL-8) foi determinada por ELISA de captura. Os protoescólices induziram um aumento significativo na expressão de CD11b em neutrófilos (p=0,026) e na produção de H2O2 (p=0,026), entretanto a sua viabilidade não foi afetada. Em contraste, nenhum efeito foi observado com o AgB em ambos ensaios. Uma moderada produção de IL-8 foi detectada somente em sobrenadantes de neutrófilos cultivados com protoescólices comparada com a produção basal (p=0,028). O efeito de uma incubação prévia com o AgB foi avaliada em relação a expressão de CD11 e H2O2 induzida pelo tratamento dos neutrófilos com forbol meristato acetato (PMA). Nenhuma mudança foi observada na expressão de CD11b, entretanto, a intensidade de produção de H2O2 foi significantemente reduzida em comparação ao tratamento apenas com PMA (p=0,038) quando o fator ativador de plaquetas (PAF) foi usado como priming. Como os protoescólices ocasionalmente podem ser liberados dos cistos em compartimentos do hospedeiro causando a hidatidose secundária, estes resultados contribuem para elucidação da defesa do hospedeiro e dos mecanismos imunomoduladores do parasito. A identificação de produtos de secreção e/ou excreção de protoescólices de E. granulosus também foi avaliada neste trabalho. Os produtos de secreção e/ou excreção foram obtidos a partir das primeiras 48 h de cultivo de protoescólices in vitro. A caracterização imunológica foi feita por western blotting com um pool de soros de indivíduos infectados com hidatidose cística. Os produtos de secreção e/ou excreção também foram analisados por espectrometria de massas. As preparações de seis diferentes amostras de protoescólices continham componentes protéicos, os quais foram visualizados por SDS-PAGE com aparentes massas moleculares entre 10 e 200 kDa. Os ensaios de western blotting mostraram a presença de diversos antígenos imunogênicos de massas moleculares maiores (acima de 50 kDa), e do AgB. Os resultados de espectrometria de massas foram obtidos com um pool de seis amostras de sobrenadantes de cultivo contendo produtos de secreção e/ou excreção, e foram identificadas onze proteínas: malato desidrogenase, ciclofilina, miofilina, P-29, 14-3-3, enolase, duas serinoproteases, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e tiorredoxina peroxidase. Estes resultados também podem contribuir para elucidação de novos aspectos da complexa interação parasito-hospedeiro, e de mecanismos imunomoduladores, uma vez que as proteínas secretadas podem estar diretamente envolvidas nesses processos. / The factors affecting innate susceptibility to infection with E. granulosus are little known. In this work, the interaction of healthy human neutrophils with protoscoleces and a secreted immunodominant antigen (AgB) of E. granulosus was assessed. The intensity of CD11b expression and H2O2 production were evaluated by flow cytometry using whole blood. Isolated neutrophils were incubated also with PSC or AgB and interleukin 8 (IL-8) was measured by capture ELISA. The protoscoleces induced a significant increment of CD11b expression in neutrophils (p=0.026) and of H2O2 production (p=0.026), however their viability was not affected. In contrast, no effect was observed with AgB in both assays. A moderate IL-8 production was detected only in supernatants from neutrophils cultured with protoscoleces compared with basal production (p=0.028). The effect of previous AgB incubation was evaluated in relation with CD11b and H2O2 expression induced by phorbol meristate acetate (PMA) treatment. No changes were observed with CD11 expression, however the magnitude of H2O2 production was significant decreased in comparison with PMA alone (p=0.038) when platelet–activating factor was used for priming. As protoscoleces occasionally spillaged from cysts into compartments of the host causing secondary cysts, these results contribute to the elucidation of the host defense and parasite immunomodulatory mechanisms involved. The identification of excretory and/or secretory products from E. granulosus protoscoleces also was assessed in this work. Excretory and/or secretory products were obtained from the first 48 h maintenance of protoscoleces in vitro. Immunological characterization was performed by western blotting with a pool of sera from individuals infected by cystic hydatidosis. Excretory and/or secretory products also were assessed by mass spectrometry. The preparations of six differents sample of protoscoleces contained components proteins which could be distinguished by SDS-PAGE with apparent molecular masses between 10 and 200 kDa. The assays of western blotting showed the presence of the several immunogenic antigens of major molecular masses (above 50 kDa), and of the AgB. The results of the mass espectrometry were obtained with a pool of six cultive sobrenadants sample containing excretory and/or secretory products, and were identified eleven proteins: malate dehydrogenase, cyclofilin, myophilin, P-29, 14-3-3, enolase, tegumental protein, two serineproteases, phosphoenolpyruvate carboxykinase and thioredoxin peroxidase. These results can contribute also for elucidate novel aspects of the complex interaction host-parasite and of the immunomodulatory mechanisms, since that secreted proteins can be directly involved in these process.

A pré-eclâmpsia (PE) é uma doença multifatorial de etiologia ainda não completamente esclarecida. A hipertensão arterial sistêmica e proteinúria maciça que surgem após a 20ª semana de gestação são as características marcantes desta enfermidade. Fatores genéticos, endoteliais e imunológicos, além de taxa de apoptose alterada, falha na invasão trofoblástica e estresse psicossocial também estão envolvidos com o desenvolvimento de PE. Mulheres grávidas apresentam uma maior vulnerabilidade ao estresse, devido às constantes alterações hormonais durante a gestação. O hormônio cortisol, também chamado de hormônio do estresse, é produzido pela supra-renal e atua em várias células e tecidos, a partir da sua ligação com receptores específicos (receptores de glicocorticóide – GR). Níveis elevados de cortisol podem desencadear apoptose celular devido ao aumento do estresse oxidativo. O gene NR3C1 codifica o GR, essencial para a interação entre o cortisol e os diversos mecanismos fisiológicos. A presença de polimorfismos como o BclI (rs41423247) e ER22/23EK (rs6189/6190) já foi relacionada com uma maior ou menor sensibilidade ao cortisol, respectivamente. Dessa maneira, objetivamos investigar a frequência destes polimorfismos em gestantes saudáveis e com PE. Além disso, avaliamos também a presença de polimorfismos em genes que codificam proteínas chave na cascata de apoptose (rs1042522, rs2279744, rs929271 nos genes TP53, MDM2 e LIF respectivamente) e sua relação com a PE. O alelo A do polimorfismo ER22/23EK esteve mais presente no grupo controle, enquanto que o alelo G do polimorfismo BclI apresentou maior frequência em grávidas que desenvolveram a forma leve de PE. Nenhuma diferença entre mulheres com PE e o grupo controle foi observada em relação aos polimorfismos em genes de cascata apoptótica. Concluímos que alterações genéticas no gene codificador dos receptores de cortisol podem afetar a resposta frente ao estresse, aumentando a probabilidade para o desenvolvimento de PE. Porém, os genes envolvidos na via apoptótica aqui avaliados não parecem estar relacionados com esta desordem. Mais pesquisas devem ser realizadas buscando elucidar a complexa fisiopatologia da pré-eclampsia. / Preeclampsia (PE) is a multifactorial disease which etiology is not fully elucidated. Systemic hypertension and massive proteinuria that arise after the 20th week of pregnancy are the hallmarks of this disorder. Genetic, endothelial and immune factors, modified rate of apoptosis, trophoblast invasion failure and psychosocial stress are also involved with PE development. Pregnant women have an increased vulnerability to stress due to constant hormonal changes during pregnancy. The cortisol hormone, also called the stress hormone, is produced by the adrenal and acts on several cells and tissues trough its binding to specific receptors (glucocorticoid receptor – GR). High cortisol levels may trigger apoptosis due to increased oxidative stress. The gene NR3C1 encodes the GR, essential for the interaction between cortisol and the various physiological mechanisms. The presence of polymorphisms as BclI (rs41423247) and ER22/23EK (rs6189/6190) has been associated with a higher and lower sensitivity to cortisol, respectively. Thus, we aimed to investigate the frequency of these polymorphisms in healthy and PE pregnant. Moreover, we also assessed the presence of polymorphisms in genes that encode key proteins in the apoptosis pathway (rs1042522, rs2279744, rs929271 in TP53, MDM2 and LIF genes) and its relationship with PE. The A allele of the ER22/23EK polymorphism was more frequent in the control group, while the G allele of the BclI polymorphism had a higher frequency in pregnant women who developed mild PE. No differences between women with PE and the control group were observed for polymorphisms in genes of apoptotic pathway. We conclude that genetic alterations of cortisol receptors may affect the response to stress, modulating the development of PE. However genes of apoptotic pathway evaluated here do not seem to be related to this disorder. More research should be done seeking to elucidate the complex pathophysiology of preeclampsia.

A imunidade inata mostra-se importante na defesa do hospedeiro contra a infecção por fungos, e dentro desse contexto macrófagos e neutrófilos (PMN) desempenham papel central na Paracoccidioidomicose. O tratamento desta doença inclui o uso de antifúngicos que, além do prolongado tempo de administração, podem ter diversos efeitos colaterais, sendo necessário pesquisa de tratamentos mais eficientes ou adjuvantes. A laserterapia de baixa potência (LLLT) vem sendo utlizada como tratamento adjuvante para muitas enfermidades, e já foi demonstrado seu efeito modulador em células imunes. Neste trabalho avaliamos os efeitos da LLLT (λ= 780 nm e 50 mW) aplicadas in vivo e em dias alternado em dois pontos das patas traseiras de camundongos Swiss inoculados pela via “air pouch” subcutânea com P. brasiliensis cepa 18 (Pb18) ou com Zymosan. Grupos de animais que não sofreram irradiação foram utilizados como controle. Após 10 dias da infecção nós obtivemos uma população de PMN altamente pura, que posteriormente foram mantidos em cultura na presença de Pb18 para ensaios de produção de proteínas, avaliação da atividade mitocondrial, produção de metabólitos do oxigênio e quantificação de fungos viáveis por ensaios de UFC. Os resultados mostraram que os PMN de animais que sofreram irradiação, independente do estímulo in vivo para sua obtenção, apresentaram maior produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), atividade mitocondrial elevada e maior atividade fungicida. Com relação à produção de proteínas, os PMN de animais que não sofreram irradiação in vivo apresentaram crescimento constante na produção, enquanto que nos PMN de animais que sofreram irradiação essa produção diminuiu com o tempo de incubação. Podemos concluir que a LLLT rende aos PMN maior atividade metabólica, o que resulta em maior atividade fungicida contra o Pb18, provavelmente devido à maior produção de ERO independente do estímulo utilizado para sua obtenção. / Innate immunity is an important component of host defense against by fungi, and into this context macrophages and neutrophils (PMN) play a central role in paracoccidioidomycosis. The treatment of this disease includes the use of antifungals that, which in addition to the prolonged administration time needed may have many side effects, so research for more efficient drugs or adjuvant treatments is needed. Low level laser therapy (LLLT) has been used as adjuvant treatment for many ailments, and its modulating effect on immune cells has already been demonstrated. In this work, we evaluated the effects of LLLT (λ= 780 nm e 50 mW) applied “in vivo” in alternate days at two points of hind paws of Swiss mice inoculated in the subcutaneous air pouch with the virulent P. brasiliensis Pb18 isolated or with Zymosan. Unirradiated animals were used as controls. After 10 days of infection we obtained a highly pure population of PMN, which subsequently were maintained in culture in presence of Pb18 for trials to protein production, evaluation of mitochondrial activity, production of reactive oxygen species (ROS) and quantification of viable fungi. The results showed that PMN from irradiated animals, regardless of the “in vivo” stimulus for their obtention, presented higher production of ROS, elevated mitochondrial activity and increased fungicidal capacity. Regarding the production of proteins, PMN from unirradiated animals showed increased production, while the treated group decreased gradually this production with the time of incubation. We conclude that LLLT renders PMN more active metabolically, resulting in higher fungicidal activity against Pb18, probably due to increased production of ROS, independently of the stimulus used to obtain it.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é um dos principais patógenos responsáveis pela infecção nosocomial e recentemente tem sido isolada fora do ambiente hospitalar, trazendo uma grande preocupação a médicos e pesquisadores. Esta resistência à meticilina é devida à presença do gene mecA, o qual codifica a PLP2a, uma proteína ligadora de penicilina, que tem baixa afinidade pelos antibióticos β-Lactâmicos. A vancomicina, até recentemente, era o tratamento de escolha para pacientes acometidos pela SARM; porém o isolamento de cepas com resistência intermediária e S. aureus totalmente resistentes à vancomicina, gerou uma grande mobilização da comunidade científica na busca de alternativas para o tratamento destas cepas multirresistentes, através do desenvolvimento de vacinas e soroterapia. A vacina de DNA é uma técnica recente que, entre outras vantagens, não necessita da purificação do antígeno protéico para induzir uma resposta imune, diminuindo o custo de produção, quando comparada às vacinas protéicas. Neste trabalho, demonstramos que a utilização de uma vacina de DNA com um fragmento do gene mecA produz uma resposta imune humoral, com a produção de anticorpos específicos anti-PLP2a em eqüinos imunizados com esta vacina, e que estes anticorpos, após sua purificação, permanecem ativos. Como ainda não existe informação suficiente em relação à segurança do uso das vacinas de DNA diretamente em humanos, o uso desta técnica em eqüinos, com o objetivo de gerar um soro hiperimune, para utilizá-lo após sua purificação no tratamento de pacientes acometidos com infecção provocada por SARM, poderia ser uma alternativa viável e segura no combate a esta bactéria resistente a quase todos agentes antimicrobianos. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major pathogens responsible for nosocomial infection and has been recently isolated outside the hospital environment, causing a great concern to physicians and researchers. This methicillinresistance is due to the presence of the mecA gene, which codes for PBP2a, a penicillinbinding protein, which has low affinity for β-Lactamic antibiotics. The treatment of choice for patients afflicted by MRSA was, until recently, vancomicyn; however the isolation of vancomycin-intermediate and resistant S. aureus strains generated a great mobilization of the scientific community for the search of alternatives for the treatment of these multiresistant strains, such as, for example vaccines and soroterapy. The DNA vaccine is a recent method that, among others, does not require the purification of the of the proteic antigen to induce a immune response, reducing production costs as compared to protein vaccines. In the present study we demonstrated that the use of a DNA vaccine with a fragment of the mecA gene produces an humoral immune response, with the production of anti-PBP2a specific antibodies in horses immunized with this vaccine, and these antibodies, once purified, maintain their activity. Since there is not sufficient information about the safety of DNA vaccines used directly to humans, the use of this vaccine in horses, with the intent of generating an hyperimmune serum to be used after its purification in the treatment of patients afflicted with infection caused by MRSA could be a possible and safe alternative to fight this bacteria resistant to almost all antimicrobial agents.

O Brasil tem uma posição de destaque no setor de negócios avícola mundial. Esta posição é resultado de uma atividade com alto grau de desenvolvimento tecnológico, destacando-se os avanços na área da genética. Características produtivas importantes têm sido o foco dos melhoristas de galinhas. Entretanto, em termos de selecionar aves visando o aumento da resistência a doenças, pouco ou nada tem sido feito. Recentemente, a avicultura nacional voltou-se para o resgate desta característica e uma série de linhagens mais rústicas, as chamadas linhagens caipiras, têm sido desenvolvidas. Este resgate, porém tem se baseado apenas em traços fenotípicos de rusticidade, não se levando em consideração as bases da genética molecular dos mesmos. A grande maioria das doenças que atacam as galinhas é de origem vírica, sendo os genes B-F (classe I- do MHC) os principais responsáveis pelo desencadeamento da resposta imune a estes agentes. Logo, tornam-se necessárias maiores investigações nestes genes para obter-se um melhor conhecimento sobre a imunidade aos vírus, possibilitando medidas que incrementem esta imunidade. Tais investigações ainda não tinham sido realizadas em galinhas caipiras brasileiras. Das técnicas utilizadas para genotipar os genes B-F o seqüenciamento de DNA é a única que apresenta 100% de fidelidade; entretanto, é cara e trabalhosa. Assim, técnicas mais ágeis e baratas e que apresentem resultados significantes para esta finalidade são sempre pertinentes. Recentemente, um microssatélite (LEI0258) foi descrito numa localização muito próxima da região dos genes B-F, o qual tem-se mostrado uma ótima ferramenta para genotipar os haplótipos B-F; mas novamente, não havia estudos a respeito em aves caipiras. Este trabalho teve por finalidade investigar a variabilidade dos genes B-F, através da técnica de seqüenciamento do DNA, e deduzir as seqüências de aminoácidos codificadas pelos alelos destes genes encontrados em galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis. Concomitantemente, procurou-se estudar o polimorfismo do microssatélite LEI0258 em duas populações desses animais (caipiras de ovos azuis criadas livremente e a linhagem caipira Paraíso Pedrês), assim como a relação dos alelos LEI0258 com os alelos ou haplótipos B-F na amostra de aves de ovos azuis. Os resultados e conclusões alcançados podem ser resumidos como segue: 1. Vinte e seis diferentes seqüências nucleotídicas B-F de DNA, que correspondem ao fragmento que vai do exon 2 ao 4 destes genes, foram detectadas na amostra de galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis. Dez seqüências foram similares as já descritas para aves comerciais mas 16 foram inéditas. Este resultado demonstra uma grande variabilidade, a maioria da qual ainda não detectada, apresentada por estes genes nestas aves. Em alguns animais foram amplificados os dois genes B-F (B-FI e B-FIV) mas em outros, aparentemente, apenas um deles. Conclui-se que em algumas aves o fragmento analisado possa ser idêntico para os dois genes, e portanto a mesma seqüência para ambos esteja sendo detectada. Entretanto, é possível que alterações na seqüência alvo dos iniciadores utilizados possam impedir a amplificação de determinados alelos. 2. Foi observada a diferença de expressão apresentada pelos genes B-F na análise do cDNA de três animais que diferiram quanto ao número de seqüências de DNA amplificadas. (a) animal no. 169 (*CC1/*CC12): dos oito clones analisados, cinco foram *CC1 e três *CC12; (b) no. 125 (*CC7-1/*CC7-2/*CC13): 14 clones, 13 *CC7-1, um *CC13, nenhum *CC7-2; e (c) no. 132 (*CC3-1/*CC3-2/*CC4-1/*CC4-2): seis clones, três *CC3-1, três *CC4-1, nenhum *CC3-2 ou *CC4-2. A ausência de amplificação dos clones *CC3-2, *CC4-2 e *CC7-2 deve ter sido devida aos seus baixos níveis de expressão. O fato de que, dos 14 clones analisados do animal 125, 13 foram *CC7-1 sugere que, além da diferença de expressão entre os lócus B-F, pode haver também diferenças de expressão entre alelos B-F dentro de um mesmo lócus. 3. Trinta e nove diferentes seqüências de aminoácidos dos domínios 1 e 2 foram geradas a partir de 45 seqüências nucleotídicas (23 obtidas no presente trabalho e outras 22 retiradas da literatura). Três outras seqüências caipiras (*CC18, *CC19 e *CC20) determinadas posteriormente a esta análise, não foram incluídas na predição. Das 13 seqüências caipiras ainda inéditas utilizadas, dez condicionam diferenças na composição de aminoácidos quando comparadas com as já descritas. Estas são de particular interesse em futuras investigações de diferenças na resposta a patógenos. 4. Ao todo foram encontrados 15 alelos LEI0258, e o tamanho destes variou de 205 a 457 pb. Nove alelos mostraram-se presentes nas duas populações, e cada população apresentou três alelos específicos. Este grande polimorfismo habilita este microssatélite a ser utilizado como um bom marcador molecular para estudos futuros de variabilidade populacional, de paternidade e de endogamia, entre outros. 5. Foi observado um desequilíbrio de ligação total entre o lócus do microssatélite e os lócus B-F. Esta associação permite a tipagem parcial dos haplótipos B-F através deste microssatélite. Nos casos em que não se tem alelos deste microssatélite exclusivos para cada um dos haplótipos B-F, pode-se utilizá-los associados à técnica de PCR alelo-específico (PCR-SSP), pois a verificação da ocorrência de um alelo LEI0258 específico restringiria a determinação para dois ou três haplótipos B-F apenas, o que, de qualquer modo, é mais acessível do que o seqüenciamento. Esta associação também capacita os alelos LEI0258 a serem utilizados em programas de melhoramento genético de resistência a patógenos através da seleção assistida por marcadores, já que é mais fácil e rápido analisar uma população pelo método da PCR do que pelo do seqüenciamento. / Brazil has a distinguished position in the world of poultry business. This position is due to an activity involving a high degree of technological development, with emphasis in the advances in the area of genetics. Important production characteristics have been the focus of chicken breeders. However, in the area of disease resistance nothing, or very little, have been done. Recently the Brazilian poultry breeders turned to the investigation of this characteristic, and a series of rustic lines, the so-called “caipira” lines, had been developed. But these studies are based just in phenotypic traits, no consideration being given to their molecular genetic bases. The large majority of the diseases which attack chickens is of viral origin, the B-F (MHC class I-) genes being the main responsible for the development of the immune response to these agents. Therefore, more investigation on these genes is needed, to obtain a better knowledge of this viral immunity, thus making possible measures that would enhace such immunity. Investigations of this type had not been performed to date in Brazilian Caipira chicken. Of the techniques used to genotype the B-F genes, DNA sequencing is the only one that is 100% reliable; however, it is costly and demand much work. Easier and more cheap techniques, which would give significant results for this task, are naturally welcome. Recently a microsatellite (LEI0258) was described which is located in a region that is close to that of the B-F genes, and this microsatellite is being used with good results to genotype the B-F haplotypes; but again, no such studies had been performed in Brazilian Caipira chickens with this purpose. The objective of this work is to investigate the variability of the B-F genes through DNA sequencing, and to deduce the amino acid sequences which are coded by the alleles of these genes which are found in blue-egg Caipira Brazilian chicken. Concomitantly the polymorphism of the LEI0258 microsatellite was investigated in two populations of such animals (blue-egg Caipira chicken raised freely, and the Paraíso Pedrês Caipira line), as well as the relationship between the LEI0258 alleles with B-F alleles or haplotypes in the blue-egg Caipira sample. The results and conclusions found can be summarized as follows: 1. Twenty-six different DNA B-F nucleotide sequences were detected in the Brazilian blue-egg Caipira chickens. They correspond to a fragment located between exons 2 and 4 of these genes. Ten sequences were similar to those already described for commercial fowl, but 16 had not been described to date. This result indicates a large variability, the majority of which was undetected, for these genes in these birds. In some animals the two B-F (B-FI and B-FIV) genes had been amplified, but in others, apparently, just one. The inference is that in some birds the analyzed fragment could be the same for both genes, and that therefore the same sequence for both was being detected. However, it is possible that changes in the primers’ target sequences may prevent the amplification of certain alleles. 2. Expression differences in the B-F genes were observed in the cDNA analysis of these animals, which differed in the number of amplified DNA sequences. (a) Animal no. 169 (*CC1/*CC12): of the eight clones analyzed, five were *CC1 and three CC12; (b) no. 125 (*CC7-1/*CC7-2/*CC13): 14 clones, 13 *CC7-1, one *CC13, none *CC7-2; and (c) no. 132 (*CC3-1/*CC3-2/*CC4-1/*CC4-2): six clones, three *CC3-1, three *CC4-1, none *CC3-2 or *CC4-2. The absence of amplification of the *CC3-2, *CC4-2, and *CC7-2 clones can be due to their low expression levels. The fact that of the 14 clones recovered from animal 125 13 were *CC7-1 suggests that besides the B-F interloci expression differences, B-F intralocus differences may occur as well. 3. Thirty-nine different amino acid sequences from the 1 and 2 domains were generated from 23 nucleotide sequences obtained in the present work and 22 others reported in the literature. Three other Caipira sequences (*CC18, *CC19, and *CC20), determined after this analysis, were not included in it. Of the 13 new Caipira sequences used, ten condition amino acid differences in relation to those already described. They are, therefore, of special interest in future investigations related to responses to pathogens. 4. A total of 15 LEI0258 alleles were found, and their sizes varied from 205 to 457 bp. Nine alleles occurred in both populations while each population presented three specific alleles. This high degree of polymorphism determines that this microsatellite should be useful as a molecular marker in future studies of population variability, paternity, and inbreeding, among others. 5. A total linkage desequilibrium was found between the LEI0258 and B-F loci. This association allows partial typing of the B-F haplotypes through this microsatellite. In cases in which there is no microsatellite allele which is exclusive to a given B-F haplotype, the system can still be used associated to the allele-specific PCR (SSP-PCR) technique, since the establishment of the occurrence of a specific LEI0258 allele would restrict the determination to two or three B-F haplotypes only, simplifying the process in relation to sequencing. This association also allows the LEI0258 to be used in genetic breeding programs of pathogen-resistance based on markers assisted selection, since it would be easier and faster to analyze a population using PCR instead of sequencing methods.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências / Made available in DSpace on 2013-03-04T19:12:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 305008.pdf: 1294464 bytes, checksum: 1c308bc869ef17da3ff0b5b2d4ed979c (MD5) / A tuberculose, causada principalmente pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), é uma doença responsável por aproximadamente 1,4 milhão de mortes anuais no mundo. Dado seu grande impacto na saúde pública, aliado à ausência de um modelo vacinal eficaz e ao surgimento de cepas resistentes, existe uma clara necessidade na busca por novos imunógenos, bem como novas estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento da TB. Nosso grupo caracterizou um possível antígeno vacinal, a lectina de 13 kDa secretada pelo Mtb (sMTL-13), que apresentou alto potencial antigênico na indução de respostas imunes celulares (IFN-?/PBMC) e humorais (IgG/soro) em pacientes com tuberculose ativa. A natureza ubíqua das lectinas reflete o seu envolvimento em diversos mecanismos celulares, tornando significante o estudo da sua interação em processos biológicos. Visando obter informações acerca da imunogenicidade da sMTL-13, este trabalho demonstrou que, além de secretada, esta proteína possui capacidade de ficar ancorada na parece celular do Mtb, provavelmente pela sua sequência conhecida como peptídeo sinal, tendo uma possível função na interação inicial do bacilo com células apresentadoras de antígeno (APCs), pois a incubação do Mtb com a D-Galactose, carboidrato que possui afinidade pela sMTL-13, e não L-Galactose, foi capaz de impedir essa interação. Esta lectina também foi capaz de induzir produção de citocinas pró-inflamatórias por APCs e essas foram capazes de levar a uma proliferação celular de linfócitos T CD4+ antígenos-específicos, indicando que a sMTL-13 possui atividade imunogênica. Estes dados demonstram que há uma importante regulação na interação de proteínas ligantes de carboidratos com o APCs e que a sMTL-13 pode atuar como padrão molecular associado a patógenos (PAMP) do Mtb, porém há a necessidade de mais estudos envolvendo a interação dessa lectina com células do sistema imune.