Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-24 / O ultrassom (US) vem sendo amplamente utilizado para melhorar a eficiência de transfecção de vetores não-virais. No entanto, o mecanismo pelo qual o US promove a entrega de DNA nas células ainda é pouco entendido. Este fenômeno é normalmente atribuído a sonoporação. Porém, com base em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, suspeitamos que outro mecanismo esteja envolvido no processo de captação de DNA. Para estudar o mecanismo de entrega, um vetor plasmideal expressando EGFP (pEGFP-N3, 4,7 kb) foi utilizado para transfectar células NIH3T3 com um aparelho de US terapêutico sem a adição de microbolhas. Em condições de insonação de 2 W/cm2, duty cycle de 20% por 30s o US promoveu cerca de 40% de eficiência de transfecção, mas com 1 W/cm2 resultou em níveis muito baixos de transfecção. Fixados esses parâmetros, também foi avaliada a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i) e as alterações no potencial de membrana através de microscopia confocal. A produção de ROS foi aumentada durante a insonação, sendo interrompida logo que o US foi desligado. A [Ca2+]i também foi aumentada durante a exposição ao US, mas seus níveis não retornaram ao basal durante os 3 minutos de observação. Porém, 1 W/cm2 não foi suficiente para mobilizar o cálcio durante a insonação, e o influxo de cálcio teve início apenas 12 segundos após o término do US. Quando expostas ao US, as células também apresentaram mudanças no potencial de membrana atingindo um estado de hiperpolarização, retornando ao estado normal logo que o US foi desligado. A alteração desses três parâmetros pelo US sugere que a entrega de DNA plasmideal deva ocorrer por endocitose. Por fim, utilizando DNA plasmideal fluorescente, mostramos que esta molécula entra na célula via endocitose mediada por clatrina. / Ultrasound (US) has been widely used to improve the efficiency of non-viral vector transfection. However, the mechanism that enables the uptake of plasmid DNA in cells by US insonation is poorly understood, but it is typically attributed to sonoporation. Based on our previous results, we hypothesized that other mechanisms, such as endocytosis, are involved in this process. To explore the mechanism of plasmid DNA uptake, a plasmid vector expressing EGFP (pEGFP-N3: 4.7 kb) was used to transfect NIH3T3 cells using a therapeutic US without microbubbles and was monitored in real-time using a confocal microscope. We achieved about 40% transfection efficiency when we applied 2 W/cm2 with 20% of duty-cycle for 30 s, but 1 W/cm2 resulted in a very low level of transfection. In these experiments, the production of reactive oxygen species was augmented during the insonation but was stopped soon after turning off the US. Calcium influx was also augmented during the insonation, but its level did not return to basal levels following the 3-min observation period. However, 1 W/cm2 was not sufficient to mobilize calcium influx during the insonation, and calcium influx began 12 s after turning off the US. US insonation also changed the cell membrane potential to promote a hyperpolarization state, which returned to the normal state soon after turning off the US. The alteration of these parameters by US indicates the uptake of plasmid DNA by endocytosis. Finally, using a fluorescently labeled plasmid, we showed that this molecule enters into cells via clathrin-mediated endocytosis, not via caveolin-1. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) is a calcium permeable channel responsible for the transduction and modulation of acute and chronic pain signaling, being a potential target for treatment of different pain disorders. In spite of that, AMG517, a TRPV1 antagonist, presents several clinical limitations, such as the development of severe hypertermia. The aim of this study was to investigate the possible interaction of the flavonoid eriodictyol with the TRPV1 receptor and its putative antinociceptive and hyperthermic effect. Eriodictyol was able to displace the [3H]-resiniferatoxin binding (IC50 = 47 (21 - 119) nM) and to inhibit the calcium influx mediated by capsaicin (IC50 = 44 (16 125) nM), suggesting that eriodictyol acts as a TRPV1 antagonist. Moreover, eriodictyol induces antinociception in the intraplantar capsaicin test, with maximal effect of 49±10 and 64±4% of inhibition for oral (ED50 = 2 (1-5) mg/kg) and intrathecal (ED50 = 2 (1-3) nmol/site) routes, respectively. Concomitantly, eriodictyol did not induce any alteration on body temperature or locomotor activity. Orally administered eriodictyol (4.5 mg/kg) prevented the nociception induced by intrathecal injection of capsaicin (72±6% of inhibition), the non-protein thiol loss and the 3-nitrotyronise (3-NT) formation induced by capsaicin in spinal cord. Eriodictyol (4.5 mg/kg, p.o.) also reduced the thermal hyperalgesia (100% of inhibition) and mechanical allodynia (62±9% of inhibition) elicited by complete Freund s adjuvant (CFA) paw injection. In conclusion, Eriodictyol acts as an antagonist of TRPV1 receptor and an antioxidant, inducing antinociception without some side effects and limitations expected for TRPV1 antagonists, as hyperthermia. / O receptor de potencial transiente vanilóide 1 (TRPV1) é um canal iônico permeável a cátions ativado por uma série de estímulos nocivos, como calor, acidificação e agentes irritantes como a capsaicina. Este receptor é responsável pela detecção e transmissão da dor aguda e crônica. Devido a isso, substâncias que modulem a atividade deste receptor apresentam um potencial clínico para o tratamento da dor. Assim, este trabalho objetiva a possível interação do flavonóide eriodictiol com o receptor TRPV1. Inicialmente, observamos que o eriodictiol foi capaz de deslocar o radioligante [3H]-resiniferatoxina, em ensaio de união específica, do receptor TRPV1 com uma concentração inibitória 50% (IC50) de 46.9 (20.70 - 118.9) nM. Ao mesmo tempo, o eriodictiol também inibiu o influxo de cálcio estimulado por capsaicina com IC50 de 44,4 (15,6 125,1) nM, sugerindo que este aja como um antagonista do receptor. Além disso, também observamos que o eriodictiol induz antinocicepção no teste da capsaicina intraplantar com efeito máximo de 49,0±10.5 e 63,9±4.0 % de inibição máxima para o tratamento oral e intratecal, respectivamente, e com uma dose efetiva 50% (DE50) de 2,4 (1,0 5,5) mg/kg 2,2 (1,6 2,9) nmol/site, respectivamente. Além disso, não observamos alterações na atividade locomotora ou temperatura corporal dos animais. A administração oral de eriodictiol também foi capaz de prevenir a nocicepção induzida por capsaicina intratecal (71,7±5,7 % de inibição). Ao mesmo tempo, o eriodictiol também aboliu a hiperalgesia térmica e reduziu a alodínia mecânica (62,4±9,2 %) induzidas por adjuvante completo de Freund. Da mesma forma, o eriodictiol também preveniu totalmente a diminuição de tiois não protéicos e formação de 3-nitrotirosina (3-NT) espinhais induzidas por capsaicina, ao passo que apresentou atividade antioxidante direta no texto de neutralização do radical ABTS. Em conclusão, nossos resultados mostram que o eriodictiol age como um antagonista do receptor TRPV1, com atividade antioxidante, induzindo antinocicepção sem os efeitos colaterais e limitações esperados para antagonistas do receptor TRPV1.