Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La résistance bactérienne aux antibiotiques est une menace en constante expansion. Les bactéries ne cessent de développer de nouvelles résistances à un rythme parfois plus rapide que notre capacité à développer de nouveaux médicaments pour les combattre. Il est donc important si l'on veut garder la cadence dans ce marathon contre les bactéries de continuer la recherche de nouvelles méthodes pour contrer la résistance aux antibiotiques. La présente étude se divise en deux projets portant chacun sur une approche distincte dans le but de développer de nouveaux antibiotiques. La première partie porte sur l'étude des peptides antimicrobiens comme nouvelle classe d'antibiotiques. Leur mode d'action distinct des antibiotiques sur le marché est prometteur pour un développement de résistance amoindrie. Par contre, leur complexité entraîne une conception de médicament plus ardue. Afin d'aider la compréhension des facteurs influençant l'interaction des peptides avec leur principale cible, les membranes cellulaires, un peptide modèle synthétique simple et neutre ainsi que des analogues chargés positivement furent développés dans notre groupe. Ces peptides, notamment surnommés 14-mère, R4R11 et R5R10, ont d'abord été étudiés par des multiples méthodes spectroscopiques, biophysiques et bio-informatique. Ces études démontrent qu'il est possible de moduler la structure secondaire des peptides par la position des acides aminés cationiques dans la séquence. De plus, la conformation des peptides influence leurs interactions avec les membranes modèles et les cellules où ceux en feuillets β sont plus sélectifs envers les modèles et cellules procaryotes alors que ceux sous forme d'hélice α interagissent indistinctement avec les deux types membranes modèles ou cellules. Il a aussi été observé une différence d'orientation entre les peptides hélicoïdaux neutres et cationiques en présence de différentes membranes lipidiques. Les peptides étudiés ont une plus grande affinité envers les bicouches plus minces et les peptides cationiques ont une plus grande interaction avec les membranes anioniques. Ensuite, le projet s'est poursuivi par l'étude de l'effet de l'ajout d'un groupement ayant une propension à se lier aux membranes procaryotes. Pour ce faire, un ligand bis-dipicolylamine (bis-DPA) a été ajouté à l'extrémité N-terminale des peptides 14-mère, R4R11 et R5R10 afin de former un complexe de Zn(II) in situ avec le ligand bis-DPA (Zn₂•bisDPA). En général, la présence du complexe augmente la sélectivité des peptides par l'entremise d'une interaction plus grande envers les cellules procaryotes et membranes modèles anioniques. La seconde partie vise plutôt la recherche de nouveaux inhibiteurs de β-lactamases visant sur une approche de combinaison de médicaments afin de diminuer la résistance aux antibiotiques β-lactames. Malgré leurs similitudes avec les composés β-lactames et leurs propriétés d'inhibiteurs de protéases, les molécules de la famille des sulfahydantoïnes n'ont pas été investiguées comme inhibiteurs de β-lactamases. Divers analogues ayant comme cœur l'hétérocycle sulfahydantoïne ont été synthétisés à partir d'acides aminés et ont été évalués pour leur pouvoir inhibiteur sur les β-lactamases courantes TEM-1 et TEM-15. De ces analogues, certain ont démontré une inhibition notable des deux β-lactamases avec des valeurs de IC₅₀ entre 130 et 510 μM et des valeurs inférées de Kᵢ entre 32 et 55 μM. Ces résultats indiquent que ce type de composés ont un potentiel intéressant comme futur inhibiteur de β-lactamases. / Antibiotic resistance is one of the top worldwide healthcare problems. Bacteria are continuously finding new ways to survive the treatment we develop. To stay ahead in this race, we must accelerate the development of new drugs that counteract bacterial resistance. The present study is divided in two projects each using a separate approach aiming to find new antimicrobial molecules. The first part of this thesis focusses on the study of antimicrobial peptides as a potential new class of antibiotics. Their mode of action is different than commercially available antibiotics and is less prone to induce resistance development. However, the design of new peptides for clinical uses is challenging because of the complexity of these compounds. To have a better understanding of the molecular determinants affecting their interaction with cellular membranes, we have developed a simple synthetic model peptide with a neutral global charge named 14-mer. Multiple analogs were synthesized bearing cationic amino acids at different positions in the sequence. Notably, analogs R4R11 and R5R10, bearing arginine residues at positions 4 and 11, and 5 and 10 respectively, were studied alongside the 14-mer model by various spectroscopic, biophysical and bioinformatics methods. These experiments show that the secondary structure and supramolecular self-assembly can be modulated by the position of the cationic residue in the peptide sequence. The peptide secondary structure affects their interactions with model membranes and living cells. The β-strand peptides tend to interact more selectively toward prokaryotic model membranes and cell whereas α-helical peptides interact indistinctly with both prokaryotic and eukaryotic model membranes and cells. In addition, a difference in peptide orientation has been observed between uncharged and cationic α-helical peptides when they interact with phospholipid membranes. These peptides have generally a higher affinity with thinner bilayers, and cationic peptides possess better interaction with cationic membranes. The investigation was continued by studying the effect of the incorporation of a molecular tag that is known to have a high affinity toward prokaryotic membranes. This was achieved by adding a bis-dipicolylamine (bis-DPA) ligand at the N-terminus of peptides 14-mer, R4R11 and R5R10 to form a Zn(II) complex in situ. The Zn(II) complex tends to increase the selectivity of the studied peptides toward prokaryotic model membranes and cells. The second part of this thesis instead focusses on finding new β-lactamase inhibitors in order to reduce the antibiotic resistance of one of the most versatile antibiotic families, the β-lactams. As potential candidates, the sulfahydantoin family has never been investigated for this application even if they possess similar structure to β-lactam antibiotics and has been shown to inhibit similar enzymes like proteases. To evaluate their potential, we synthesized multiple analogs containing the sulfahydantoin heterocycle starting from amino acids. These analogs were tested as inhibitors of two of the most prevalent β-lactamases, TEM-1 and TEM-15. Out of these compounds, two analogs have shown substantial inhibition with IC₅₀ values between 130 and 510 μM and inferred Kᵢ values between 32 and 55 μM. These results suggest that sulfahydantoin compounds have a good potential for the development of new and improved β-lactamase inhibitors.

La protéine BACE (?-site APP Cleaving Enzyme) joue un rôle clé dans la production du peptide amyloïde ? (A?) à l'origine de l'établissement de la maladie d'Alzheimer. À cause de son rôle central dans la maladie, BACE représente une cible potentielle dans le développement de thérapies. Récemment, un premier rôle physiologique pour BACE a été identifié, remettant en doute les approches thérapeutiques visant son inhibition. Des stratégies alternatives ciblant des modulateurs de l'activité de BACE pourraient représenter une approche plus sécuritaire pour traiter la maladie. Dans cette étude, nous avons tenté de développer un essai pour cribler des modulateurs de l'activité de BACE en utilisant deux systèmes différents : le système raporteur luciférase et un système basé sur le Bioluminescence Resonance Energy Transfert 2 (BRET2). Malgré les nombreuses optimisations réalisées, nous n'avons pas réussi à mettre au point un essai efficace permettant de cribler des modulateurs de l'activité de BACE.

Initialement, les cancers du sein sont majoritairement hormonodépendants, c’est-à-dire qu'ils sont stimulés par les hormones estrogéniques endogènes. Une première approche pour traiter ce type de cancer consiste à utiliser un antiestrogène pour bloquer l’activation du récepteur des estrogènes dans le tissu mammaire. Une seconde approche consiste à inhiber la synthèse des estrogènes par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques pour certaines enzymes clés de la stéroïdogénèse. La stéroïde sulfatase (STS), une enzyme impliquée dans la biosynthèse des estrogènes, constituerait une importante cible thérapeutique. Dans le cadre de ce mémoire, je discuterai d’un nouveau projet de recherche qui consiste à développer des composés à double-action combinant les deux types d’approches nommées précédemment. Nous cherchons à développer une molécule non-stéroïdienne qui serait en mesure d’inhiber la STS mais également de bloquer le récepteur des estrogènes dans le tissu mammaire. Notre composé doit donc posséder un effet SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator), c’est-à-dire de jouer le rôle d’un antagoniste dans le tissu mammaire tout en jouant le rôle d’un agoniste dans d’autres tissus (i.e. tissu osseux) où l’action des estrogènes est importante. Dans ce mémoire, j’aborderai rapidement la synthèse chimique des deux générations de composés pour m’attarder davantage sur les tests biologiques in vitro nécessaires à l’évaluation de leur potentiel à double-action. Les composés ont d’abord été testés sur la STS pour évaluer leur potentiel d’inhibition de l’enzyme. Ensuite, les composés ont été testés sur des cellules cancéreuses du sein sensibles aux estrogènes pour s’assurer qu’ils ne stimulent pas leur prolifération. Afin de vérifier l’effet SERM désiré, les composés furent testés sur des ostéoblastes pour déterminer s’ils sont en mesure d’induire leur prolifération et leur différentiation. Finalement, l’affinité pour le récepteur des estrogènes de type alpha (REα) fut également évaluée. La 2e génération de composés a produit de bons résultats car certains composés inhibent bien la STS et possèdent l’effet SERM désiré. Ce projet a donc permis de développer des composés à double-action qui pourraient être utilisés lors de futures études in vivo.

Les virus influenza ont toujours eu un impact considérable sur l’humanité. Les virus influenza B (IB) ont longtemps été négligés et sous-estimés par rapport aux virus influenza A (IA). Ils ne représentent que 10 à 20% des infections annuelles par les virus influenza, mais peuvent devenir majoritaire certaines années et entrainer des symptômes similaires à ceux des virus IA. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INA) sont les principaux traitements disponibles contre les virus influenza. Cependant, à la suite de mutations, certains virus influenza ont développé des mécanismes de résistance limitant dangereusement les options thérapeutiques. Actuellement, très peu de souches résistantes sont isolées en clinique car le fitness de ces virus résistants, c’est-à-dire leur capacité à se répliquer et se transmettre, est altéré. Or, il a été montré que des virus IA peuvent améliorer leur fitness et propager le phénotype de résistance. L’objectif de ce projet de thèse est de mieux comprendre la résistance des virus influenza B et son impact sur le fitness viral afin de mieux prévenir l’émergence de souches résistantes. Nous avons, dans un premier temps, étudié la résistance des virus influenza A et B au peramivir, le plus récent des INA. Nous avons confirmé que cette molécule est hautement active contre les souches saisonnières A et B. De plus, elle conserve une activité antivirale in vitro contre certaines souches virales ayant une sensibilité réduite ou hautement réduite contre d’autres INA (l’oseltamivir et le zanamivir). Dans un second temps, nous avons étudié le fitness de virus influenza B contemporains résistants in vitro et chez la souris. Nous avons montré que certains virus influenza B, ayant un phénotype de résistance croisée, peuvent maintenir un fitness similaire à celui du virus sauvage in vitro et in vivo. De plus, nous avons pu décrire et analyser un nouveau mécanisme de résistance chez les virus influenza B observé chez un cas clinique. Ces résultats soulignent la dangerosité de notre dépendance aux INA et nous encouragent à faire évoluer les stratégies thérapeutiques.

La résistance à l'insuline est un désordre métabolique précoce dans le développement de l'obésité et du diabète de type 2. Plusieurs évidences suggèrent que la surproduction de monoxyde d'azote (NO) via l'induction de la synthase du monoxyde d'azote inductible (iNOS) dans les principaux organes cibles de l'insuline conduit à un état de résistance à l'insuline. De plus, des études récentes ont montré que l'invalidation génétique de iNOS chez des souris obèses prévient l'apparition de la résistance à l'insuline au niveau systémique et périphérique. Plusieurs agents thérapeutiques sont présentement disponibles en clinique pour traiter la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2, mais aucun d'entre eux ne cible spécifiquement la voie de iNOS et du NO. Dans notre première étude, nous avons trouvé que l'inhibition pharmacologique et sélective de iNOS avec le 1400W améliore l'action de l'insuline après seulement 4 jours de traitement chez des souris db/db génétiquement obèses et diabétiques. L'effet bénéfique du 1400W était associé avec la diminution de l'hyperglycémie à jeun et du stress nitrosatif déterminé par la diminution du niveau de 3-nitrotyrosine dans le muscle. Cependant, l'effet sensibilisateur du 1400W sur l'action de l'insuline était transitoire puisque aucun effet n'a pu être observé après 10 jours de traitement. Lors de notre deuxième étude, nous avons montré que l'invalidation génétique de iNOS chez des souris obèses augmente les effets métaboliques de la rosiglitazone, un agoniste des PPARy utilisé en clinique dans le traitement de la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2. Nous avons entre autres observé une efficacité supérieure de la rosiglitazone à améliorer la tolérance au glucose et à améliorer le défaut d'activation de la voie Akt par l'insuline dans le foie chez les souris iNOS-/- obèses. Ces effets étaient associés avec une augmentation du niveau plasmatique des gros complexes de l'adiponectine (HMW) ainsi que l'activation de la voie de l'AMPK dans les principaux tissus cibles de l'insuline. Finalement, dans notre troisième étude, nous avons démontré que le resvératrol, un composé naturel contenu dans le raisin, diminue l'induction de iNOS et du NO induite par les cytokines dans les cellules musculaires et les adipocytes en culture. Chez la souris, l'expression de iNOS induite par l'endotoxine LPS a été inhibée par le resvératrol dans le muscle et le tissu adipeux, ce qui était associé avec une diminution de l'accumulation des dérivés du NO dans ces tissus. Cependant, aucun effet du resvératrol sur l'expression de iNOS et la production de NO n'a pu être observé dans le foie des souris LPS. Ensemble, les résultats de nos études suggèrent que l'inhibition pharmacologique de iNOS représente une nouvelle stratégie prometteuse à développer dans la gestion du traitement de la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2.

Pour que la vie puisse exister, des milliers de protéines doivent interagir ensemble pour permettre les divers processus biochimiques essentiels que l’on retrouve au niveau cellulaire. Le dérèglement d’une seule interaction protéine-protéine peut avoir des conséquences catastrophiques sur la qualité de vie d’une personne. C’est ainsi que de nombreux programmes de recherches sont basés sur l’exploration d’une ou de plusieurs cibles protéiques impliquées dans diverses maladies. Étant donné la localisation intracellulaire des nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que l’absence de ligands connus, le développement d’agents thérapeutiques devient de plus en plus ardu. En effet, la chimie combinatoire classique et le design rationnel ont leurs limitations et il y a un besoin évident de développer de nouvelles approches pour faire l’étude et la modulation des interactions protéine-protéine. C’est dans cet esprit que s’imbrique les suivants travaux, qui portent sur les peptoïdes comme outil moléculaire peptidomimétique. Ces oligomères de glycine N-substitutée présentent notamment des propriétés pharmacologiques avantageuses et représentent une base moléculaire de choix pour élaborer de nouvelles méthodologies de criblage à haut débit. En passant par le développement de nouvelles approches de synthèse sur support solide, jusqu’à l’évaluation de la pénétration cellulaire de peptoïdes macrocycliques, le suivant mémoire devrait être lu comme un préambule à l’utilisation des peptoïdes en chimie combinatoire pour la découverte d’inhibiteurs ou de modulateurs d’interactions protéine-protéine.