Resumo: Paramyxoviridae, é um vírus envelopado com tamanho médio de 120 a 300nm, de simetria helicoidal, que apresenta um genoma de RNA fita simples não segmentado de polaridade negativa. Este genoma codifica 11 proteínas, dentre as quais as glicoproteínas de membrana que são responsáveis pela infectividade do vírus. A proteína F, em associação com a proteína G e SH, é responsável pela fusão da membrana viral à célula que será infectada, ou seja, esta proteína proporciona a entrada e instalação do vírus na célula. Conhecer a forma de interação das proteínas da membrana viral com a célula que será infectada é importante para propor um mecanismo de inibição deste processo de infecção viral. Existem evidências que os glicosaminoglicanos são potenciais inibidores da infecção causada por vários vírus. A hipótese é de que este processo de inibição ocorra devido à ligação dos glicosaminoglicanos às proteínas da membrana viral, mais especificamente na proteína G, que apresenta um domínio de ligação para heparina, impedindo desta forma, que o vírus se ligue na célula hospedeira e que inicie o processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi verificar a atuação de glicosaminoglicanos como potenciais inibidores da infecção viral. Esta análise foi realizada por meio de experimento de cultivo de células Hep2 na presença dos glicosaminoglicanos heparina e dextrana sulfatada que foram inoculadas com o vírus sincicial respiratório do tipo A (RSVA) e analisados por meio das técnicas de PCR e Imunofluorescência Indireta. Os resultados mostraram que a heparina e a dextrana sulfatada apresentam efeito inibitório da infecção viral em cultivo de células Hep2. / Abstract: The respiratory sincicial virus (RSV) is part of Pneumovirus genus of the Paramyxoviridae family, is an enveloped virus with average size of 120 to 300nm, helical symmetry, that presents a genome consisting of a single strand, no segmented, RNA negative. This genome codifies for 11 proteins including the membrane glycoproteins which are responsible for the infectivity of the virus. Protein F in association with protein G and SH is responsible for the fusion of the viral membrane with the cell that will be infected, that is, this protein provides the entrance and the virus to settle in the cell. To know the form of interaction of viral membrane proteins with the cell that will be infected is important to propose a mechanism to inhibit of this process of viral infection. Evidences exist that the glycosaminoglycans are potential inhibitors of the infection caused by some viruses. The hypothesis is that this process of inhibition occurs more specifically due to the interation between glycosaminoglycans and the proteins of the viral membrane, more specifically in protein G, that presents a domain of linking for heparin, avoiding the virus to bind to the host cell and initiating the infection process. The aim of this work was to verify the performance of glycosaminoglycans as inhibitors of the viral infection. This analysis was accomplished through experiments of Hep2 cell culture in the presence of these glycosaminoglycans (heparin and dextran sulfate) that was inoculated with the respiratory sincicial virus type A (RSVA) and analyzed through the technique of PCR and Indirect Imunofluorecence. The results had shown that the heparin and the dextran sulfate presented an inhibitory effect of the viral infection in Hep2 cells culture. / Orientador: Fátima Pereira de Souza / Coorientador: Paula Rahal / Banca: Karina Alves de Toledo / Banca: Paola Jocelan Provazzi Scaranzi / Mestre

Resumo: Estudaram-se os efeitos do sulfato de condroitina 3% (SC), da N-acetilcisteína 10% (NAC), do EDTA 1% (EDTA) e solução salina (GC), sobre a viabilidade do epitélio corneal e a concentração de metaloproteinases (MMP-2 e MMP-9), em córneas de ratos submetidos à ulceração química por NaOH 1N. Compuseram-se quatro grupos de vinte e quatro animais, que foram submetidos à queimadura química corneal com NaOH 1N. Os tratamentos foram realizados a intervalos de 6 horas e as córneas fotografadas, nos mesmos períodos, após tingimento com fluoresceína, até a reepitelização. Doze animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia humanitaria, 20 horas após ulcerações. O mesmo procedimento foi repetido às 42 horas para os outros doze animais de cada grupo. As córneas foram processadas para quantificação de microvilosidades do epitelio corneal por microscopia eletrônica de varredura e para quantificação da MMP-2 e -9, por zimografia. O tempo médio de epitelização em horas foi de 28,00±12,82 (SC), 29,00±11,01 (NAC), 35,00±7,01 (EDTA) e de 35,00±7,01 (GC), sem diferença signficativa (p=0,46) entre os grupos. Não se observou diferença quanto ao número de MEC entre os grupos (p>0,05). Às 20 e às 42 horas, a forma latente da MMP-2 foi significativamente mais elevada nos grupos NAC e SC (p<0,001), e às 42 horas observou-se maior concentração em EDTA, relativamente ao GC (p<0,001). Às 42 horas, a concentração da MMP-2, em sua forma ativa, foi significativamente maior, no grupo SC, relativamente aos demais grupos (p<0,001). A MMP-9 só se expressou em sua forma latente, sendo sua concentração significativamente mais elevada, no grupo NAC, às 42 horas (p<0,001). Concluiu-se, que das substâncias testadas, só o sulfato de condroitina acelerou a epitelização corneal, mas nenhuma delas apresentou efeitos protetores às microvilosidades do epitélio corneal ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed evaluate the effects of topical 3% chondroitin sulfate (SC), 10% N-acetylcysteine (NAC), 1% EDTA (EDTA) and 0,9% NaCl on corneal epithelial viability and the expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 (MMP-2 and -9), in alkali burned rat corneas. Ninety eight healthy rats were divided into four groups and animals were submitted to corneal burn with NaOH 1N. All treatments occurred every 6 hours, and the corneas were photographed at the same time points until lesions were fluorescein negative. Twelve animals of each group were euthanized 24 and 42 hours after burn, and corneas were processed for corneal epithelial microvilli quantification (CEM) by scanning electron microscopy and MMP-2 and -9 evaluation by zimography. Images were quantified by Image J. Average corneal wound healing rate was 28,00±12,82 (SC), 29,00±11,01 (NAC), 35,00±7,01 (EDTA) and 35,00±7,01 hours in controls (GC) (p=0,46). CEM count did not change significantly among groups (p>0,05). At 20 and 42 hours, MMP-2 latent form quantity was significantly increased in NAC and SC groups (p<0.001); at 42 hours, MMP-2 latent form was significantly elevated in EDTA, in comparison to GC (p<0,001). At 42 hours, MMP-2 active form was significantly increased only in SC (p<0,001). MMP-9 was expressed only in its latent form, being significantly higher in NAC, at 42 hours (p<0,001). This study indicated that only 3% chondroitin sulfate accelerated corneal wound healing. 10% N-acetylcysteine, 1% EDTA and 3% chondroitin sulfate did not protect the corneal epithelial microvilli. In addition, none of the tested agents showed any benefit over MMPs inhibition in alkali burned / Orientador: José Luiz Laus / Coorientador: Adriana Morales / Banca: Cristiane dos Santos Honsho / Banca: Alexandre Lima de Andrade / Mestre

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Antônio Carlos Martins Camargo / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Beatriz Gómez Guimarães / Banca: Roberto da Silva / Abstract: This work presents some features of essential biological processes such as the haemostatic system, integrity of biological membranes and thermostability of proteins. Crystallographic, spectroscopic and in silico tools have been used to obtain information at the molecular level of macromolecular complexes, action mechanisms and inhibition pathways. Worms, snakes, ticks, leeches and spiders produce a variety of proteins, which interfere in the regulation of these systems. Different toxins isolated from these organisms were characterized providing necessary information for the development of a new anti-myonecrotic molecule and reveal a new factor Xa exosite that is important for macromolecular substrates recognition and inhibition. The first crystal structure of a member of the sphingomyelinases D family was determined by the "quick cryo-soaking" technique and the catalytic mechanism was proposed, which involves a magnesium-binding site and two catalytic histidines. An alternative activation of the protein C pathway that does not require thrombomodulin was structurally characterized and revealed the dual role of the elestrotatic surface charge around the active site and the three strategically positioned carbohydrate moieties in the approach, recognition and activation of protein C. / Doutor