Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias / Para caracteres de resistencia a enfermedades dentro del objetivo de mejoramiento en programas de selección genética acuícolas, los candidatos a selección son evaluados usando información fenotípica de sus parientes para obtener los valores de cría (EBVs) por medio del método BLUP. La obtención de fenotipos implica el sacrificio de los peces antes de que se puedan reproducir, por lo que el uso de información molecular para su evaluación genética se esta volviendo una práctica común en especies acuícolas de interés comercial. La selección genómica (GBLUP) es un método que usa información genotípica desde paneles de SNPs, la que podría aumentar la precisión con que se seleccionan individuos. Una limitante de esto, es el elevado costo en la obtención de esta información, pero la imputación de genotipos puede representar una solución a bajo costo para resolver este problema. La presente tesis permitió evaluar y comparar, por medio de la simulación de evaluación genómica, los valores de precisión para EBVs usando los métodos BLUP y GBLUP como una aproximación inicial para estudiar la inclusión de dicha información. Se simularon 5 generaciones de 3,600 individuos de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) cada una desde una población fundadora de 831 padres y 831 madres los cuales cuentan con datos genotípicos reales. Las posiciones de los QTLs se muestrearon aleatoriamente en cada cromosoma (4 QTLs por cromosoma, 116 QTLs totales) desde 42,822 SNP disponibles. Los escenarios variaron de acuerdo con tres niveles de heredabilidad (0.1, 0.2 y 0.4), cuatro densidades de SNPs (0.5K, 3K. 7K y 42K), con un error de imputación asociado a cada uno (10%, 5%, 1% y 0%, respectivamente). Las simulaciones, análisis estadístico posterior y evaluación económica mostraron que: (1) Existen diferencias significativas (p<0.05) al comparar valores de precisión de BLUP y GBLUP en todos los escenarios; (2) un incremento no-lineal en los valores de precisión de GBLUP a través de las diferentes densidades de SNPs y niveles de heredabilidad; (3) se detectaron diferencias significativas entre precisión y exactitud de EBVs al comparar BLUP y GBLUP, en todos los casos; (4) no se detectaron diferencias significativas entre precisión de paneles 0.5K, 3K y 7K SNPs, especialmente a valores de h2 medias y altas. (5) Debido a esto, sería suficiente contar con 500 SNPs para realizar selección genómica de manera rentable y con mayor precisión que utilizando el método BLUP. Palabras Claves: selección genómica; simulación; precisión; heredabilidad; densidad de panel de SNP; error de imputación; programa de selección acuícola / For disease resistance traits included in aquaculture breeding programs, candidates for selection are tested using phenotypic information of relatives to obtain breeding values by the BLUP method because it implies the slaughtering of fishes before reproduction. Therefore, the use of molecular information for genetic evaluations is becoming a common practice in most relevant aquaculture species. Genomic selection (GBLUP) is a methodology that uses genotypic information obtained from single nucleotide polymorphism (SNP) panels and it could increase the accuracy of individuals’ selection. A limitation of this method is the high costs of obtaining molecular information, but the imputation of genotypes could be a low-cost solution. In the present study was evaluated and compared the precision and accuracy of EBVs using BLUP and GBLUP methods at varying levels of genotypes imputation as an approach to study the inclusion of this molecular information. We simulated 5 generations of 3,600 rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) each one from 831 sires and 831 dams as founder population with real genotypic data from. The QTLs positions were randomly sampled in each chromosome (4 QTLs per chromosome, 116 QTLs in total) from 42,822 available SNPs. The scenarios vary in heritability levels (0.1, 0.2 and 0.4) and density of SNPs panel (0.5K, 3K, 7K and 42K), rendering varying error rates (10%, 5%, 1% and 0%, respectively). The simulations, statistical analyses and economic evaluation showed: (1) significant differences (p<0.05) in precision between BLUP and GBLUP estimates in all scenarios; (2) a non-linear increase in GBLUP precision with SNP density and heritability levels; (3) significant differences were found between BLUP and GBLUP in precision and accuracy of EBVs, (4) non-significant differences between GBLUP0.5K, GBLUP3K and GBLUP7K precisions, especially for medium and high heritability levels. (5) Consequently, a 500 SNPs panel would be enough to obtain higher precision of EBVs from genomic selection than from pedigreebased method in a rentable way / Proyecto Fondef IT/10100

Memoria para optar el título de Bioquímico / Los receptores tipo Toll (TLR) son proteínas de transmembrana que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). El TLR2 reconoce PAMPs de bacterias gram positivas, los cuales activan una vía de señalización clásica que involucra el reclutamiento de la proteína MyD88 y una alternativa donde participa la Fosfoinositol 3-Quinasa (PI3K). A su vez, los glucocorticoides (GCs) son moléculas que suprimen la inflamación y la inmunidad adaptativa, que recientemente han sido reportadas como potenciadoras de la expresión de ciertas moléculas de la inmunidad innata, tales como el TLR2. La importancia de PI3K y los GC en la regulación de la vía alternativa del TLR2 no ha sido estudiada aún. El objetivo general fue determinar la participación de PI3K en la producción de TNFα inducida por agonistas del TLR2 y GCs. Los objetivos específicos fueron: 1) Analizar el efecto de Pam3Cys-Ser-Lys4 un lipopéptido sintético análogo a la porción NH2-terminal de lipoproteínas de bacterias gram positivas, y Dexametasona, sobre la secreción de TNFα y la activación transcripcional de NFκB, en células A549. 2) Estudiar la participación de PI3K-Akt en la ruta de señalización del TLR2 inducida por Pam3Cys-Ser-Lys4 y Dexametasona. 3) Determinar la interacción entre TLR2-PI3K y GR-PI3K. Los resultados obtenidos muestran que la activación del TLR2 por Pam3Cys-Ser- Lys4 provocó un aumento en la expresión de TNFα y la activación transcripcional del TLR2, sin embargo el co-tratamiento con Dexametasona no alteró el efecto del agonista del TLR2. Al mismo tiempo, PI3K aumenta la expresión de TNFα e inhibe la transcripción del TLR2, al usar un dominante negativo para PI3K (p85-DN). PI3K activa la transcripción de genes que responden a la movilización de NFκB y AP-1, ya que células expuestas a Pam3Cys-Ser-Lys4 y que expresan el constructo p85-DN, presentan una disminución significativa de la activación transcripcional de NFκB y APLos resultados indicaron que Pam3Cys-Ser-Lys4 aumentó significativamente la fosforilación de Akt, como un indicador indirecto de la actividad de PI3K, y Dexametasona la revirtió. Por otra parte, se determinó la interacción entre p85 con el GR o el TLR2, siendo la primera modulada exclusivamente por Dexametasona. Estos resultados demuestran que PI3K presenta diversos mecanismos de regulación en la vía de señalización del TLR2 y además proponen mecanismos por los que los GCs intervienen en la ruta transduccional / Toll-like receptors (TLRs) are transmembrane proteins that recognize pathogenassociated molecular patterns (PAMPs). TLR2 identify PAMPs from gram positive bacteria, which activate a classical signaling pathway involving MyD88 recruitment to the receptor intracellular domain, and an alternative signaling pathway, which comprises the activation of the phosphoinositol 3-kinase (PI3K). Moreover, glucocorticoids (GCs) suppress the inflammation and adaptive immune responses, and have been recently reported to enhance the TNFα-induced expression of TLR2. The relevance of GCs in the regulation of the alternative pathway has not yet been described. The general aim of this thesis was to determine PI3K participation on TNFα production induced by TLR2 agonists in the presence or absence of GCs. The specific aims were: 1) To analyze the effect of Pam3Cys-Ser-Lys4, a specific synthetic ligand analogue to the NH2-terminal portion of gram positive bacterial lipoproteins, and Dexamethasone, a synthetic GC, on TNFα expression and NFκB transcriptional activation,in A549 cells. 2) To study the role of PI3K-Akt in the TLR2 signaling pathway induced by Pam3Cys-Ser-Lys4 in the presence or absence of Dexamethasone. 3) To determine the interaction between TLR2-PI3K and GR-PI3K. The results show that TLR2 activation by Pam3Cys-Ser-Lys4 promotes TNFα expression and TLR2 transcriptional activity, however co-treatment of cells with Pam3Cys-Ser-Lys4 and Dexamethasone did not revert TNFα increase. In relation to this pathway, we investigated if PI3K was involved in TNFα expression and TLR2 transcription activity regulation. Pam3Cys-Ser-Lys4 significantly increased Akt phosphorylation, as an indicator of PI3K activity, and Dexamethasone reverted to it. Moreover, by using a PI3K regulatory subunit dominant negative mutant cDNA (p85-DN) transiently expressed in cells, a remarkably decrease in NFκB and AP-1 transcriptional activation was observed. On the other hand, we determined p85 regulatory PI3K subunit interaction with GR or TLR2, and we were able to identify interaction between p85-GR in the presence of Dexamethasone. These results demonstrate that PI3K shows different mechanism of regulation in the TLR2 signaling and propose pathways in which GCs may be participating

Memoria para optar al título Bioquímico / Como parte del sistema inmune innato existe un grupo de receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) capaces de detectar aquellos patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Entre estos PRRs, destacan los receptores de tipo Toll o TLRs. Dentro de esta familia de receptores, TLR2 reconoce PAMPs derivados de bacterias gram positivas, los que promueven la activación de la vía de señalización intracelular dependiente del adaptador molecular MyD88, que conduce a la activación de IKK y de las MAPKs, las que tienen un impacto fundamental sobre la expresión de citoquinas proinflamatorias. El estudio de los mecanismos fisiológicos de control de esta vía de señalización constituye un área de investigación relevante en inmunología. En este sentido, los glucocorticoides, anti-inflamatorios naturales, ejercen su efecto vía un receptor citoplasmático (GR) mediante procesos de trans-represión y de expresión de proteínas reguladoras. A pesar de esto, se desconoce su efecto sobre las vías de inducción de citoquinas pro-inflamatorias mediadas por TLR2, tal como la vía de p38. Basados en estos antecedentes, el objetivo general de esta memoria de título consistió en determinar la participación de p38 en la producción de TNF-α en células A549, inducida por un agonista de TLR2, Pam3Cys-Ser-Lys4, en presencia o ausencia de dexametasona. Los objetivos específicos se centraron en: 1) determinar la expresión de TNF-α, a nivel de transcrito y proteína, en células activadas con el agonista sintético Pam3Cys-Ser-Lys4, en presencia o ausencia de dexametasona 2) evaluar la fosforilación de la proteína quinasa p38 en células estimuladas con Pam3Cys-Ser-Lys4, en presencia o ausencia de dexametasona y 3) evaluar la contribución de la proteína quinasa p38 sobre la expresión de TNF-α en células estimuladas con Pam3Cys-Ser-Lys4, en presencia o ausencia de dexametasona. Los resultados obtenidos indican que la activación de TLR2 por Pam3Cys-Ser-Lys4 induce un aumento en la expresión de TNF-α, el que no es reprimido por dexametasona. Se observó una activación de la vía p38 inducida por Pam3Cys-Ser-Lys4, que está involucrada en la expresión de TNF-α. Por otro lado, constatamos que dexametasona ejerce su efecto anti-inflamatorio clásico mediante la expresión de moléculas reguladoras de la vía de p38, como la fosfatasa MKP-1. Sin embargo, no podemos descartar un efecto independiente de la expresión de genes regulados por el glucocorticoide. Además, observamos que dexametasona no actuaría en los eventos tempranos de señalización de la vía de TLR2, como lo constatamos con la fosforilación de p38. Estos datos demostrarían un mecanismo a través del cual los glucocorticoides regulan procesos inflamatorios inducidos por TLR2, con un impacto relevante en el desarrollo de la inmunidad innata y la inflamación / As part of innate immune system, it exists a group of pattern-recognition receptors (PRRs) capable of detecting those molecular pattern associated to pathogens (pathogenassociated molecular patterns; PAMPs). Among these PRRs, Toll-like receptors (TLRs) stand out. Inside this receptor family, TLR2 recognizes PAMPs derived from gram positive bacteria, thus promoting activation of MyD88-dependent intracellular pathway. It leads to IKK and MAPKs activation, which have a fundamental impact on the expression of proinflammatory cytokines. The study of the physiological control mechanisms of this pathway constitutes an area of relevant research in immunology. In this sense, glucocorticoids, natural anti-inflammatory molecules, exert its effect by a cytoplasmatic receptor (GR) by trans-repression mechanism and regulatory proteins expression. In spite of this, the effect of glucocorticoid on the TLR2-mediated pro-inflammatory cytokine pathway induction, specially on p38, is unknown. Based on these precedents, the general aim of this study was determining the role of p38 in TNF-α production in A549 cells induced with Pam3Cys-Ser-Lys4, a TLR2 agonist, in presence or absence of dexametasona. The specific objectives were centered to: 1) determine TNF-α expression, at messenger and protein level; 2) evaluate the p38 protein kinase phosphorylation and 3) evaluate the contribution of p38 protein kinase on TNF-α expression under the stimulation with Pam3Cys-Ser-Lys4, in presence or absence of dexamethasone. The results indicate that the activation of TLR2 by Pam3Cys-Ser-Lys4 induces an increase in TNF-α expression, which is not suppressed for dexamethasone. It also was observed an activation of p38 pathway induced by Pam3Cys-Ser-Lys4, that was involved in TNF-α expression. On the other hand, that dexametasona exert its classic anti-inflammatory effect by means of expression of regulatory molecules of the p38 pathway, as phosphatase MKP-1. Nevertheless, we can’t reject an independent effect from the expression of glucocorticoid regulated genes. Besides, dexamethasona wouldn’t work on early events of TLR2 signalling pathway, as we observed for p38 phosphorylation. This data would show a mechanism by which glucocorticoids regulates the TLR2- induced inflammatory processes, with a relevant impact in the processes involved in the development of the innate immunity and inflammation