O transplante ortotópico de fígado (TOF) é o tratamento de escolha para pacientes com doença hepática terminal. Entretanto, o benefício desse procedimento, em termos de sobrevida, é incerto, especialmente em longo prazo. Estudos recentes sugerem que, enquanto existe claro benefício na sobrevida para indivíduos com doença hepática mais avançada, para aqueles com doença menos significativa, o risco de óbito pode ser maior com o transplante do que permanecer em lista de espera. O objetivo deste trabalho é comparar a sobrevida em transplantados e listados a fim de definir o benefício atribuído ao TOF, especialmente considerando-se a gravidade da doença hepática. Neste estudo, foram incluídos pacientes com doença hepática crônica terminal listados para transplante hepático no estado do Rio Grande do Sul, Brasil, entre janeiro de 2001 e dezembro de 2005. Os pacientes foram seguidos até junho de 2006. Dos 1130 pacientes listados, 520 foram transplantados. Os critérios para alocação de órgãos neste período foram exclusivamente o tempo de espera em lista e o grupo sanguíneo. O escore MELD foi utilizado como marcador da gravidade da doença hepática. Foram observados 290 óbitos por 1000 pacientes/ano entre pacientes listados e 119 óbitos por 1000 pacientes/ano entre os pacientes transplantados. As estimativas de sobrevida de Kaplan-Meier demonstraram cruzamento da sobrevida de listados e transplantados, confirmando a inadequação dos métodos tradicionais de análise de sobrevida. Já através do modelo Gama Generalizado, as funções de sobrevida e risco (hazards) puderam ser adequadamente estimadas. Foram definidos parâmetros de localização, formato e escala específicos para listados e transplantados, permitindo funções de risco distintas para cada grupo. O escore MELD foi incluído como variável explanatória para o parâmetro de localização, sendo significativamente associado ao tempo de sobrevida tanto em listados (redução de 11% na mediana para cada aumento de um ponto no escore MELD) quanto em transplantados (redução de 12% na mediana). Através da utilização dos parâmetros do modelo Gama Generalizado, foram calculadas razões de risco em função do tempo de seguimento com intervalos de confianca estimados pelo método Delta. Foi observado um aumento imediato na razão de risco pós-TOF quando comparado à permanência em lista de espera, com razão de risco (RR) de 7,12 e intervalo de confiança com 95% de significância (IC 95%) de 3,52-14,39 para indivíduos com escore MELD de 15, a média desta população. A RR decresceu exponencialmente até cruzar a igualdade (RR igual a um) em aproximadamente três meses. Funções de sobrevida em função do escore MELD foram também estimadas através dos mesmos parâmetros. A magnitude na diferença da sobrevida em um ano aumentou proporcionalmente ao aumento do escore MELD (MELD 10: 83% vs. 90%; MELD 15: 81% vs. 80%; MELD 20: 63% vs. 78%; MELD 25: 42% vs. 74%; MELD 30: 21% vs. 71%; listados vs. transplantados, respectivamente). O escore MELD, para o qual o transplante foi significativamente benéfico relativamente a permanecer em lista de espera, foi 23 em 6 meses, 17 em 12 meses, 15 em 24 meses e 12 em 60 meses de seguimento. No modelo multivariado, outras possíveis variáveis explanatórias foram incluídas para o parâmetro de localização. Nesta análise, a idade do receptor demonstrou-se significativamente associada com a sobrevida pós-TOF, com redução de 9% na mediana por cada ano adicional. Em conclusão, o transplante hepático aumenta a sobrevida em longo prazo de pacientes elegíveis, mesmo em pacientes com doença hepática menos avançada. Entretanto, os benefícios do transplante são mais marcantes e imediatos em pacientes com doença hepática mais avançada.

COELHO, Gustavo Rego. Fatores relacionados à disfunção e não função primária do enxerto no transplante de fígado. 2007.93 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2007. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-02-17T12:37:05Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_grcoelho.pdf: 587649 bytes, checksum: 493787c31f3c92080bd035b3538ee160 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-02-17T12:38:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_grcoelho.pdf: 587649 bytes, checksum: 493787c31f3c92080bd035b3538ee160 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-17T12:38:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_grcoelho.pdf: 587649 bytes, checksum: 493787c31f3c92080bd035b3538ee160 (MD5) Previous issue date: 2007 / A hepatic insufficiency of the graft after liver transplantation can be defined with Primary Graft Dysfunction (PGD) or Primary Nonfunction (PNF). The Objective of this work is to evaluate the factors related to the donor and the recipient with PGD or PNF in patients submitted to the liver transplant. 176 patients were submitted a liver transplantation in the Walter Cantidio University Hospital of the Federal University of Ceara. The mortality, in 30 days, of the patients with normal enzymatic evolution was of 5%; of the patients with PGD was 19.7% and the patients with PNF was of 100%. The patients who had evolved in the postoperative (PO) with PGD and PNF had had 3,69 times more possibilities of death in 30 days than the patients who had had normal evolution. In this work, we evaluated donors and recipients vaiables: age, peak serum sodium, aminotransferases, liver steatosis, score MELD, the Cold Ischemia Time of Isquemia Fria (CIT) and the Warm Ischemia Time (WIT). The TIF bigger that 600 minutes, the WIT bigger that 55 minutes and liver steatosis > 30% were factors of risk for the PGD/PNF development. The correlation between the CIT, in minutes, with the evolution aminotransferases of the first one to the seventh postoperative day, it disclosed to significance statistic in 1st PO, 2nd PO, 3rd PO, 4th PO, 6th PO and 7th PO for AST. In relation the ALT had significance statistics in 1st PO, 2nd PO, 3rd PO, 4th PO, 5th PO, 6th PO and 7th PO. The correlation between WIT, in minutes, with the evolution of aminotransaminases the first one to the seventh postoperative day, revealed a significance statistic in 1st PO, 5th PO, 6th PO and 7th PO for AST. In relation the ALT we had significance statistic in the 1st PO. The liver steatosis > 30%, the increase of the CIT and the WIT consequently have correlation with increase of aminotransaminases in postoperative and the bigger risk of DPE/NFE. / A insuficiência hepática do enxerto no pós-operatório pode se manifestar como uma Disfunção Primaria do Enxerto (DPE) ou uma Não Função do Enxerto (NFE). O Objetivo desse trabalho é avaliar os fatores relacionados ao doador e ao receptor com a disfunção primária e a não função do enxerto em pacientes submetidos ao transplante de fígado. Foram avaliados 176 transplantes de fígado no Hospital Universitário Walter Cantídio da Universidade Federal do Ceará (HUWC/UFC). A mortalidade em 30 dias dos pacientes com evolução enzimática normal foi de 5%; dos pacientes com DPE foi 19,7% e dos pacientes com NFE foi de 100%. Os pacientes que evoluíram no pós-operatório com DPE e NFE tiveram 3,69 vezes mais chances de óbito em 30 dias que os pacientes que tiveram evolução normal. Nesse estudo, foram avaliados diversos fatores do doador e do receptor: idade, níveis séricos de sódio, transaminases, grau de esteatose do enxerto, escore MELD, Tempo de Isquemia Fria (TIF) e Tempo de Isquemia Quente(TIQ). O TIF maior que 600 minutos, TIQ maior que 55 minutos e o grau de esteatose hepática maior que 30% foram fatores de risco para o desenvolvimento de DPE/NFE. A correlação entre TIF em minutos com a evolução das transaminases hepáticas do primeiro ao sétimo pós-operatório, revelou significância estatística no 1o PO, 2o PO, 3o PO, 4o PO, 6o PO e 7o PO para AST. Em relação a ALT houve significância estatística no 1o PO, 2o PO, 3o PO, 4o PO, 5o PO, 6o PO e 7o PO. A correlação entre TIQ em minutos com a evolução das transaminases hepáticas do primeiro ao sétimo pós-operatório, revelou significância estatística no 1o PO, 5o PO, 6o PO e 7o PO para AST. Em relação a ALT houve significância estatística no 1o PO. Conclui-se que o grau de esteatose no enxerto maior que 30%, o aumento do TIF e do TIQ tem correlação com aumento das transaminases no pós-operatório e conseqüentemente maior risco de DPE/NFE.

O transplante ortotópico de fígado (TOF) é o tratamento de escolha para pacientes com doença hepática terminal. Entretanto, o benefício desse procedimento, em termos de sobrevida, é incerto, especialmente em longo prazo. Estudos recentes sugerem que, enquanto existe claro benefício na sobrevida para indivíduos com doença hepática mais avançada, para aqueles com doença menos significativa, o risco de óbito pode ser maior com o transplante do que permanecer em lista de espera. O objetivo deste trabalho é comparar a sobrevida em transplantados e listados a fim de definir o benefício atribuído ao TOF, especialmente considerando-se a gravidade da doença hepática. Neste estudo, foram incluídos pacientes com doença hepática crônica terminal listados para transplante hepático no estado do Rio Grande do Sul, Brasil, entre janeiro de 2001 e dezembro de 2005. Os pacientes foram seguidos até junho de 2006. Dos 1130 pacientes listados, 520 foram transplantados. Os critérios para alocação de órgãos neste período foram exclusivamente o tempo de espera em lista e o grupo sanguíneo. O escore MELD foi utilizado como marcador da gravidade da doença hepática. Foram observados 290 óbitos por 1000 pacientes/ano entre pacientes listados e 119 óbitos por 1000 pacientes/ano entre os pacientes transplantados. As estimativas de sobrevida de Kaplan-Meier demonstraram cruzamento da sobrevida de listados e transplantados, confirmando a inadequação dos métodos tradicionais de análise de sobrevida. Já através do modelo Gama Generalizado, as funções de sobrevida e risco (hazards) puderam ser adequadamente estimadas. Foram definidos parâmetros de localização, formato e escala específicos para listados e transplantados, permitindo funções de risco distintas para cada grupo. O escore MELD foi incluído como variável explanatória para o parâmetro de localização, sendo significativamente associado ao tempo de sobrevida tanto em listados (redução de 11% na mediana para cada aumento de um ponto no escore MELD) quanto em transplantados (redução de 12% na mediana). Através da utilização dos parâmetros do modelo Gama Generalizado, foram calculadas razões de risco em função do tempo de seguimento com intervalos de confianca estimados pelo método Delta. Foi observado um aumento imediato na razão de risco pós-TOF quando comparado à permanência em lista de espera, com razão de risco (RR) de 7,12 e intervalo de confiança com 95% de significância (IC 95%) de 3,52-14,39 para indivíduos com escore MELD de 15, a média desta população. A RR decresceu exponencialmente até cruzar a igualdade (RR igual a um) em aproximadamente três meses. Funções de sobrevida em função do escore MELD foram também estimadas através dos mesmos parâmetros. A magnitude na diferença da sobrevida em um ano aumentou proporcionalmente ao aumento do escore MELD (MELD 10: 83% vs. 90%; MELD 15: 81% vs. 80%; MELD 20: 63% vs. 78%; MELD 25: 42% vs. 74%; MELD 30: 21% vs. 71%; listados vs. transplantados, respectivamente). O escore MELD, para o qual o transplante foi significativamente benéfico relativamente a permanecer em lista de espera, foi 23 em 6 meses, 17 em 12 meses, 15 em 24 meses e 12 em 60 meses de seguimento. No modelo multivariado, outras possíveis variáveis explanatórias foram incluídas para o parâmetro de localização. Nesta análise, a idade do receptor demonstrou-se significativamente associada com a sobrevida pós-TOF, com redução de 9% na mediana por cada ano adicional. Em conclusão, o transplante hepático aumenta a sobrevida em longo prazo de pacientes elegíveis, mesmo em pacientes com doença hepática menos avançada. Entretanto, os benefícios do transplante são mais marcantes e imediatos em pacientes com doença hepática mais avançada.

O transplante ortotópico de fígado (TOF) é o tratamento de escolha para pacientes com doença hepática terminal. Entretanto, o benefício desse procedimento, em termos de sobrevida, é incerto, especialmente em longo prazo. Estudos recentes sugerem que, enquanto existe claro benefício na sobrevida para indivíduos com doença hepática mais avançada, para aqueles com doença menos significativa, o risco de óbito pode ser maior com o transplante do que permanecer em lista de espera. O objetivo deste trabalho é comparar a sobrevida em transplantados e listados a fim de definir o benefício atribuído ao TOF, especialmente considerando-se a gravidade da doença hepática. Neste estudo, foram incluídos pacientes com doença hepática crônica terminal listados para transplante hepático no estado do Rio Grande do Sul, Brasil, entre janeiro de 2001 e dezembro de 2005. Os pacientes foram seguidos até junho de 2006. Dos 1130 pacientes listados, 520 foram transplantados. Os critérios para alocação de órgãos neste período foram exclusivamente o tempo de espera em lista e o grupo sanguíneo. O escore MELD foi utilizado como marcador da gravidade da doença hepática. Foram observados 290 óbitos por 1000 pacientes/ano entre pacientes listados e 119 óbitos por 1000 pacientes/ano entre os pacientes transplantados. As estimativas de sobrevida de Kaplan-Meier demonstraram cruzamento da sobrevida de listados e transplantados, confirmando a inadequação dos métodos tradicionais de análise de sobrevida. Já através do modelo Gama Generalizado, as funções de sobrevida e risco (hazards) puderam ser adequadamente estimadas. Foram definidos parâmetros de localização, formato e escala específicos para listados e transplantados, permitindo funções de risco distintas para cada grupo. O escore MELD foi incluído como variável explanatória para o parâmetro de localização, sendo significativamente associado ao tempo de sobrevida tanto em listados (redução de 11% na mediana para cada aumento de um ponto no escore MELD) quanto em transplantados (redução de 12% na mediana). Através da utilização dos parâmetros do modelo Gama Generalizado, foram calculadas razões de risco em função do tempo de seguimento com intervalos de confianca estimados pelo método Delta. Foi observado um aumento imediato na razão de risco pós-TOF quando comparado à permanência em lista de espera, com razão de risco (RR) de 7,12 e intervalo de confiança com 95% de significância (IC 95%) de 3,52-14,39 para indivíduos com escore MELD de 15, a média desta população. A RR decresceu exponencialmente até cruzar a igualdade (RR igual a um) em aproximadamente três meses. Funções de sobrevida em função do escore MELD foram também estimadas através dos mesmos parâmetros. A magnitude na diferença da sobrevida em um ano aumentou proporcionalmente ao aumento do escore MELD (MELD 10: 83% vs. 90%; MELD 15: 81% vs. 80%; MELD 20: 63% vs. 78%; MELD 25: 42% vs. 74%; MELD 30: 21% vs. 71%; listados vs. transplantados, respectivamente). O escore MELD, para o qual o transplante foi significativamente benéfico relativamente a permanecer em lista de espera, foi 23 em 6 meses, 17 em 12 meses, 15 em 24 meses e 12 em 60 meses de seguimento. No modelo multivariado, outras possíveis variáveis explanatórias foram incluídas para o parâmetro de localização. Nesta análise, a idade do receptor demonstrou-se significativamente associada com a sobrevida pós-TOF, com redução de 9% na mediana por cada ano adicional. Em conclusão, o transplante hepático aumenta a sobrevida em longo prazo de pacientes elegíveis, mesmo em pacientes com doença hepática menos avançada. Entretanto, os benefícios do transplante são mais marcantes e imediatos em pacientes com doença hepática mais avançada.

O uso de células da medula óssea no tratamento da insuficiência hepática aguda é uma alternativa promissora, visto que o único tratamento disponível atualmente é o transplante hepático o qual, devido à falta de órgãos para transplante e complicações pós-cirúrgicas, está associado a uma alta mortalidade. O interesse na identificação de populações celulares capazes de se diferenciar em células tipo-hepatócitos tem ganhado grande atenção, não somente como uma promissora fonte de células para terapia celular de doenças hepáticas, mas também como potencial fonte celular para modelos in vitro de testes pré-clínicos de medicamentos, modelos para estudo da hepatogênese, e desenvolvimento de fígados bioartificiais. O presente estudo teve como objetivo identificar a capacidade de diferentes populações de células da fração mononuclear da medula óssea (FMMO) de se diferenciar em células tipo-hepatócitos. Para isso, utilizamos um sistema de co-cultivo, onde as células da fração aderente e nãoaderente da FMMO eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos derivados de animais com ou sem lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4). Nossos resultados mostram que células da fração não-aderente são capazes de adquirir características típicas de hepatócitos após 24 horas de exposição às células do tecido lesionado, tais como expressão gênica de Albumina e Citokeratina-18, e produção e secreção de uréia. Foi identificada a presença de microvesículas carregando material genético específico de hepatócitos no sobrenadante das células diferenciadas, indicando um possível mecanismo molecular na indução da diferenciação. Este trabalho permitiu o estudo da diferenciação celular in vitro e análise do papel do microambiente de lesão neste processo. / Cell therapy using bone marrow-derived cells is a promising approach for the treatment of acute liver failure, as liver transplant is associated to high mortality due to lack of organs and post-surgical complications. The identification of cell populations capable of generating hepatocyte-like cells has gained immense interest, not only as a promising cell source for cell-based therapy of liver diseases, but also as a potential cell source for in vitro models of drug safety testing, models for studying hepatogenesis, and development of bioartificial livers. In the present study, we investigated the capability of different populations from the bone marrow mononuclear cells (BMMC) to differentiate into hepatocyte-like cells. For that, adherent and non-adherent cells from the BMMC were co-cultured with hepatocytes obtained from animals with or without Carbon Tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. Our results showed that non-adherent BMMC presented signs of differentiation, such as Albumin and Cytokeratin-18 expression and urea production, after 24 hours of co-culture with damaged hepatocytes. Microvesicles carrying hepatocyte-specific genetic material were detected in the supernatant from differentiated cells, thus suggesting a mechanism of differentiation. In summary, this study assessed in vitro differentiation of BMMC and analyzed the role of injury micro-environment in cell plasticity.

A insuficiência hepática aguda resulta da perda súbita das funções vitais do fígado em conseqüência da perda maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado de urgência é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com hepatócitos e células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos da terapia com células imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio na sobrevivência e na regeneração hepática em ratos Wistar machos adultos submetidos à insuficiência hepática aguda. Na primeira fase foi realizada a padronização de modelo de insuficiência hepática aguda por hepatectomia de 85% ou 90% com janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A segunda fase teve por objetivo avaliar os efeitos da terapia com células HepG2 e células da medula óssea total (MOT) e fração mononuclear (FM), contidas em microcápsulas de alginato de sódio colocadas no peritônio, sobre os níveis de glicose e lactato sanguíneos e sobre a sobrevida em 10 dias. Na fase 3, foram avaliados os efeitos da terapia celular com MOT e FM sobre a proliferação hepatocitária e os níveis séricos de citocinas e de fatores de crescimento nas primeiras 72 horas após hepatectomia de 90%. Na fase 1, mesmo utilizando ketamina e xilazina como anestésico e independentemente da suplementação de glicose, hepatectomia de 85% resultou em sobrevida de 50% em 72 horas, não adequada a um modelo de insuficiência hepática aguda. Hepatectomia de 90% sob anestesia com ketamina e xilazina determinou aumento da mortalidade, com a maioria dos óbitos ocorrendo nas primeiras 6 horas do pós-operatório. A troca do regime anestésico para isoflurano reduziu o tempo de recuperação anestésica e aumentou a sobrevida imediata permitindo uma janela terapêutica adequada. A sobrevida foi de 26,7% às 72 horas e de 6,7% aos 10 dias. Na fase 2 foram administradas microcápsulas contendo células em ratos submetidos a hepatectomia de 90%. O transplante de células da medula óssea aumentou a sobrevida em 10 dias de forma significativa em relação ao grupo sem células (MOT 1x106 células: 63,6%, P=0,002; FM 1x106: 57,1%, P=0,001 e FM 3x107: 54,5%, P=0,003). A sobrevida (30,8%) dos animais tratados com HepG2 não foi diferente do grupo sem células. Na terceira fase, às 72 horas após a hepatectomia, o grupo sem células apresentou peso dos lobos remanescentes e razão de massa hepática significativamente superiores aos dos animais que receberam MOT (P=0,001 e P=0,020) e FM (P=0,002 e P=0,008). Não houve diferença estatística significativa no número de hepatócitos em mitose e nos níveis de IL-6 entre os grupos em todos os momentos avaliados. Somente às 12 horas houve diferença significativa dos níveis de TGF-beta entre os grupos, sendo maiores no grupo sem células (P=0,036). Os valores do PDGF-BB às 48 horas do grupo sem células foram significativamente inferiores aos dos ratos tratados com FM (P=0,017). Esses resultados nos permitem concluir que hepatectomia de 90% de ratos Wistar anestesiados com isoflurano possibilita janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A terapia com células da medula óssea, imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio resulta em aumento da sobrevida de ratos submetidos à hepatectomia de 90%. Essa terapêutica reduziu o ganho de massa dos lobos remanescentes, mas não modificou a regeneração hepatocitária e os níveis de IL-6, de TGF-beta e de PDGF-BB durante as primeiras 72 horas após o procedimento. / Acute liver failure is caused by the sudden loss of liver vital functions due to massive loss of hepatic tissue. In most cases, emergency liver transplant is the curative treatment, despite liver’s regenerative capacity. Mechanisms of liver regeneration involve intricate regulatory pathways, with the recruitment of growth factors and cytokines. Cell therapy, either with hepatocytes or with bone marrow cells, has been proposed as a therapeutic option but remains in the experimental area. The present study aimed to investigate the effects of the therapy with cells immobilized in alginate microcapsules on the survival and hepatic regeneration of adult male Wistar rats with acute liver failure. On the first phase the acute liver failure model by 85% or 90% hepatectomy was standardized to achieve an adequate therapeutic window to study the mechanisms and effects of cell therapy. The second phase aimed to evaluate the effects of therapy using Hep G2 cells and bone marrow cells, either whole bone marrow (WBM) or mononuclear fraction (MF), in alginate microcapsules implanted in the peritoneum, on glucose and lactate levels, and 10-day survival. On phase 3, the effects of cell therapy with WBM and MF on hepatocyte proliferation and serum levels of cytokines and growth factors were evaluated in the first 72 hours after 90% hepatectomy. On phase 1, using ketamine and xylazine as anesthetic, despite glucose supplementation, 85% hepatectomy resulted in 50% survival at 72 hours, which is not adequate for a model of acute liver failure. Ninety-percent hepatectomy under ketamine and xylazine anesthesia resulted in increased mortality, although in the first 6 hours postoperatory. The change in anesthetic regimen for isofluorane reduced recovery time and increased early survival, allowing for an adequate therapeutic window. Survival was 26.7% at 72 hours and 6.7% at 10 days. On phase 2 microcapsules containing cells were implanted in rats after 90% hepatectomy. Bone marrow cell transplantation significantly increased 10-day survival over empty capsules group (WBM 1x106 cells: 63.6%, P=0.002; MF 1x106: 57.1%, P=0.001 and MF 3x107: 54.5%, P=0.003). Survival of animals treated with HepG2 (30.8%) was not different from empty capsules group. On the third phase, 72 hours after hepatectomy, empty capsules group showed significantly increase in the weight of remnant liver lobe and hepatic mass ratio compared to WBM (P=0.001 and P=0.020) and MF (P=0.002 and P=0.008). There was not statistic difference in the number of mitotic hepatocytes and in the serum levels of IL-6 between groups in any of the time points analyzed. Serum levels of TGF-beta were higher in the empty capsules group at 12 hours only (P=0.036). Serum levels of PDGF-BB in this group were significantly lower (P=0.017) than those from the MF group at 48 hours posthepatectomy. These findings suggest that 90% partial hepatectomy in Wistar rats anesthetized with isoflurane provides an adequate therapeutic window to study the effects and mechanisms of cell therapy. Cell therapy with bone marrow cells microencapsulated in alginate beads leads to increased survival in rats with 90% partial hepatectomy. This therapy reduced the weight of remnant lobes but did not changed hepatocyte regeneration and serum levels of IL-6, TGF-beta and PDGF-BB in the first 72 hours after surgery.

O uso de células da medula óssea no tratamento da insuficiência hepática aguda é uma alternativa promissora, visto que o único tratamento disponível atualmente é o transplante hepático o qual, devido à falta de órgãos para transplante e complicações pós-cirúrgicas, está associado a uma alta mortalidade. O interesse na identificação de populações celulares capazes de se diferenciar em células tipo-hepatócitos tem ganhado grande atenção, não somente como uma promissora fonte de células para terapia celular de doenças hepáticas, mas também como potencial fonte celular para modelos in vitro de testes pré-clínicos de medicamentos, modelos para estudo da hepatogênese, e desenvolvimento de fígados bioartificiais. O presente estudo teve como objetivo identificar a capacidade de diferentes populações de células da fração mononuclear da medula óssea (FMMO) de se diferenciar em células tipo-hepatócitos. Para isso, utilizamos um sistema de co-cultivo, onde as células da fração aderente e nãoaderente da FMMO eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos derivados de animais com ou sem lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4). Nossos resultados mostram que células da fração não-aderente são capazes de adquirir características típicas de hepatócitos após 24 horas de exposição às células do tecido lesionado, tais como expressão gênica de Albumina e Citokeratina-18, e produção e secreção de uréia. Foi identificada a presença de microvesículas carregando material genético específico de hepatócitos no sobrenadante das células diferenciadas, indicando um possível mecanismo molecular na indução da diferenciação. Este trabalho permitiu o estudo da diferenciação celular in vitro e análise do papel do microambiente de lesão neste processo. / Cell therapy using bone marrow-derived cells is a promising approach for the treatment of acute liver failure, as liver transplant is associated to high mortality due to lack of organs and post-surgical complications. The identification of cell populations capable of generating hepatocyte-like cells has gained immense interest, not only as a promising cell source for cell-based therapy of liver diseases, but also as a potential cell source for in vitro models of drug safety testing, models for studying hepatogenesis, and development of bioartificial livers. In the present study, we investigated the capability of different populations from the bone marrow mononuclear cells (BMMC) to differentiate into hepatocyte-like cells. For that, adherent and non-adherent cells from the BMMC were co-cultured with hepatocytes obtained from animals with or without Carbon Tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. Our results showed that non-adherent BMMC presented signs of differentiation, such as Albumin and Cytokeratin-18 expression and urea production, after 24 hours of co-culture with damaged hepatocytes. Microvesicles carrying hepatocyte-specific genetic material were detected in the supernatant from differentiated cells, thus suggesting a mechanism of differentiation. In summary, this study assessed in vitro differentiation of BMMC and analyzed the role of injury micro-environment in cell plasticity.

A insuficiência hepática aguda resulta da perda súbita das funções vitais do fígado em conseqüência da perda maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado de urgência é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com hepatócitos e células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos da terapia com células imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio na sobrevivência e na regeneração hepática em ratos Wistar machos adultos submetidos à insuficiência hepática aguda. Na primeira fase foi realizada a padronização de modelo de insuficiência hepática aguda por hepatectomia de 85% ou 90% com janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A segunda fase teve por objetivo avaliar os efeitos da terapia com células HepG2 e células da medula óssea total (MOT) e fração mononuclear (FM), contidas em microcápsulas de alginato de sódio colocadas no peritônio, sobre os níveis de glicose e lactato sanguíneos e sobre a sobrevida em 10 dias. Na fase 3, foram avaliados os efeitos da terapia celular com MOT e FM sobre a proliferação hepatocitária e os níveis séricos de citocinas e de fatores de crescimento nas primeiras 72 horas após hepatectomia de 90%. Na fase 1, mesmo utilizando ketamina e xilazina como anestésico e independentemente da suplementação de glicose, hepatectomia de 85% resultou em sobrevida de 50% em 72 horas, não adequada a um modelo de insuficiência hepática aguda. Hepatectomia de 90% sob anestesia com ketamina e xilazina determinou aumento da mortalidade, com a maioria dos óbitos ocorrendo nas primeiras 6 horas do pós-operatório. A troca do regime anestésico para isoflurano reduziu o tempo de recuperação anestésica e aumentou a sobrevida imediata permitindo uma janela terapêutica adequada. A sobrevida foi de 26,7% às 72 horas e de 6,7% aos 10 dias. Na fase 2 foram administradas microcápsulas contendo células em ratos submetidos a hepatectomia de 90%. O transplante de células da medula óssea aumentou a sobrevida em 10 dias de forma significativa em relação ao grupo sem células (MOT 1x106 células: 63,6%, P=0,002; FM 1x106: 57,1%, P=0,001 e FM 3x107: 54,5%, P=0,003). A sobrevida (30,8%) dos animais tratados com HepG2 não foi diferente do grupo sem células. Na terceira fase, às 72 horas após a hepatectomia, o grupo sem células apresentou peso dos lobos remanescentes e razão de massa hepática significativamente superiores aos dos animais que receberam MOT (P=0,001 e P=0,020) e FM (P=0,002 e P=0,008). Não houve diferença estatística significativa no número de hepatócitos em mitose e nos níveis de IL-6 entre os grupos em todos os momentos avaliados. Somente às 12 horas houve diferença significativa dos níveis de TGF-beta entre os grupos, sendo maiores no grupo sem células (P=0,036). Os valores do PDGF-BB às 48 horas do grupo sem células foram significativamente inferiores aos dos ratos tratados com FM (P=0,017). Esses resultados nos permitem concluir que hepatectomia de 90% de ratos Wistar anestesiados com isoflurano possibilita janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A terapia com células da medula óssea, imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio resulta em aumento da sobrevida de ratos submetidos à hepatectomia de 90%. Essa terapêutica reduziu o ganho de massa dos lobos remanescentes, mas não modificou a regeneração hepatocitária e os níveis de IL-6, de TGF-beta e de PDGF-BB durante as primeiras 72 horas após o procedimento. / Acute liver failure is caused by the sudden loss of liver vital functions due to massive loss of hepatic tissue. In most cases, emergency liver transplant is the curative treatment, despite liver’s regenerative capacity. Mechanisms of liver regeneration involve intricate regulatory pathways, with the recruitment of growth factors and cytokines. Cell therapy, either with hepatocytes or with bone marrow cells, has been proposed as a therapeutic option but remains in the experimental area. The present study aimed to investigate the effects of the therapy with cells immobilized in alginate microcapsules on the survival and hepatic regeneration of adult male Wistar rats with acute liver failure. On the first phase the acute liver failure model by 85% or 90% hepatectomy was standardized to achieve an adequate therapeutic window to study the mechanisms and effects of cell therapy. The second phase aimed to evaluate the effects of therapy using Hep G2 cells and bone marrow cells, either whole bone marrow (WBM) or mononuclear fraction (MF), in alginate microcapsules implanted in the peritoneum, on glucose and lactate levels, and 10-day survival. On phase 3, the effects of cell therapy with WBM and MF on hepatocyte proliferation and serum levels of cytokines and growth factors were evaluated in the first 72 hours after 90% hepatectomy. On phase 1, using ketamine and xylazine as anesthetic, despite glucose supplementation, 85% hepatectomy resulted in 50% survival at 72 hours, which is not adequate for a model of acute liver failure. Ninety-percent hepatectomy under ketamine and xylazine anesthesia resulted in increased mortality, although in the first 6 hours postoperatory. The change in anesthetic regimen for isofluorane reduced recovery time and increased early survival, allowing for an adequate therapeutic window. Survival was 26.7% at 72 hours and 6.7% at 10 days. On phase 2 microcapsules containing cells were implanted in rats after 90% hepatectomy. Bone marrow cell transplantation significantly increased 10-day survival over empty capsules group (WBM 1x106 cells: 63.6%, P=0.002; MF 1x106: 57.1%, P=0.001 and MF 3x107: 54.5%, P=0.003). Survival of animals treated with HepG2 (30.8%) was not different from empty capsules group. On the third phase, 72 hours after hepatectomy, empty capsules group showed significantly increase in the weight of remnant liver lobe and hepatic mass ratio compared to WBM (P=0.001 and P=0.020) and MF (P=0.002 and P=0.008). There was not statistic difference in the number of mitotic hepatocytes and in the serum levels of IL-6 between groups in any of the time points analyzed. Serum levels of TGF-beta were higher in the empty capsules group at 12 hours only (P=0.036). Serum levels of PDGF-BB in this group were significantly lower (P=0.017) than those from the MF group at 48 hours posthepatectomy. These findings suggest that 90% partial hepatectomy in Wistar rats anesthetized with isoflurane provides an adequate therapeutic window to study the effects and mechanisms of cell therapy. Cell therapy with bone marrow cells microencapsulated in alginate beads leads to increased survival in rats with 90% partial hepatectomy. This therapy reduced the weight of remnant lobes but did not changed hepatocyte regeneration and serum levels of IL-6, TGF-beta and PDGF-BB in the first 72 hours after surgery.

O uso de células da medula óssea no tratamento da insuficiência hepática aguda é uma alternativa promissora, visto que o único tratamento disponível atualmente é o transplante hepático o qual, devido à falta de órgãos para transplante e complicações pós-cirúrgicas, está associado a uma alta mortalidade. O interesse na identificação de populações celulares capazes de se diferenciar em células tipo-hepatócitos tem ganhado grande atenção, não somente como uma promissora fonte de células para terapia celular de doenças hepáticas, mas também como potencial fonte celular para modelos in vitro de testes pré-clínicos de medicamentos, modelos para estudo da hepatogênese, e desenvolvimento de fígados bioartificiais. O presente estudo teve como objetivo identificar a capacidade de diferentes populações de células da fração mononuclear da medula óssea (FMMO) de se diferenciar em células tipo-hepatócitos. Para isso, utilizamos um sistema de co-cultivo, onde as células da fração aderente e nãoaderente da FMMO eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos derivados de animais com ou sem lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4). Nossos resultados mostram que células da fração não-aderente são capazes de adquirir características típicas de hepatócitos após 24 horas de exposição às células do tecido lesionado, tais como expressão gênica de Albumina e Citokeratina-18, e produção e secreção de uréia. Foi identificada a presença de microvesículas carregando material genético específico de hepatócitos no sobrenadante das células diferenciadas, indicando um possível mecanismo molecular na indução da diferenciação. Este trabalho permitiu o estudo da diferenciação celular in vitro e análise do papel do microambiente de lesão neste processo. / Cell therapy using bone marrow-derived cells is a promising approach for the treatment of acute liver failure, as liver transplant is associated to high mortality due to lack of organs and post-surgical complications. The identification of cell populations capable of generating hepatocyte-like cells has gained immense interest, not only as a promising cell source for cell-based therapy of liver diseases, but also as a potential cell source for in vitro models of drug safety testing, models for studying hepatogenesis, and development of bioartificial livers. In the present study, we investigated the capability of different populations from the bone marrow mononuclear cells (BMMC) to differentiate into hepatocyte-like cells. For that, adherent and non-adherent cells from the BMMC were co-cultured with hepatocytes obtained from animals with or without Carbon Tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. Our results showed that non-adherent BMMC presented signs of differentiation, such as Albumin and Cytokeratin-18 expression and urea production, after 24 hours of co-culture with damaged hepatocytes. Microvesicles carrying hepatocyte-specific genetic material were detected in the supernatant from differentiated cells, thus suggesting a mechanism of differentiation. In summary, this study assessed in vitro differentiation of BMMC and analyzed the role of injury micro-environment in cell plasticity.

A insuficiência hepática aguda resulta da perda súbita das funções vitais do fígado em conseqüência da perda maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado de urgência é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com hepatócitos e células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos da terapia com células imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio na sobrevivência e na regeneração hepática em ratos Wistar machos adultos submetidos à insuficiência hepática aguda. Na primeira fase foi realizada a padronização de modelo de insuficiência hepática aguda por hepatectomia de 85% ou 90% com janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A segunda fase teve por objetivo avaliar os efeitos da terapia com células HepG2 e células da medula óssea total (MOT) e fração mononuclear (FM), contidas em microcápsulas de alginato de sódio colocadas no peritônio, sobre os níveis de glicose e lactato sanguíneos e sobre a sobrevida em 10 dias. Na fase 3, foram avaliados os efeitos da terapia celular com MOT e FM sobre a proliferação hepatocitária e os níveis séricos de citocinas e de fatores de crescimento nas primeiras 72 horas após hepatectomia de 90%. Na fase 1, mesmo utilizando ketamina e xilazina como anestésico e independentemente da suplementação de glicose, hepatectomia de 85% resultou em sobrevida de 50% em 72 horas, não adequada a um modelo de insuficiência hepática aguda. Hepatectomia de 90% sob anestesia com ketamina e xilazina determinou aumento da mortalidade, com a maioria dos óbitos ocorrendo nas primeiras 6 horas do pós-operatório. A troca do regime anestésico para isoflurano reduziu o tempo de recuperação anestésica e aumentou a sobrevida imediata permitindo uma janela terapêutica adequada. A sobrevida foi de 26,7% às 72 horas e de 6,7% aos 10 dias. Na fase 2 foram administradas microcápsulas contendo células em ratos submetidos a hepatectomia de 90%. O transplante de células da medula óssea aumentou a sobrevida em 10 dias de forma significativa em relação ao grupo sem células (MOT 1x106 células: 63,6%, P=0,002; FM 1x106: 57,1%, P=0,001 e FM 3x107: 54,5%, P=0,003). A sobrevida (30,8%) dos animais tratados com HepG2 não foi diferente do grupo sem células. Na terceira fase, às 72 horas após a hepatectomia, o grupo sem células apresentou peso dos lobos remanescentes e razão de massa hepática significativamente superiores aos dos animais que receberam MOT (P=0,001 e P=0,020) e FM (P=0,002 e P=0,008). Não houve diferença estatística significativa no número de hepatócitos em mitose e nos níveis de IL-6 entre os grupos em todos os momentos avaliados. Somente às 12 horas houve diferença significativa dos níveis de TGF-beta entre os grupos, sendo maiores no grupo sem células (P=0,036). Os valores do PDGF-BB às 48 horas do grupo sem células foram significativamente inferiores aos dos ratos tratados com FM (P=0,017). Esses resultados nos permitem concluir que hepatectomia de 90% de ratos Wistar anestesiados com isoflurano possibilita janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A terapia com células da medula óssea, imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio resulta em aumento da sobrevida de ratos submetidos à hepatectomia de 90%. Essa terapêutica reduziu o ganho de massa dos lobos remanescentes, mas não modificou a regeneração hepatocitária e os níveis de IL-6, de TGF-beta e de PDGF-BB durante as primeiras 72 horas após o procedimento. / Acute liver failure is caused by the sudden loss of liver vital functions due to massive loss of hepatic tissue. In most cases, emergency liver transplant is the curative treatment, despite liver’s regenerative capacity. Mechanisms of liver regeneration involve intricate regulatory pathways, with the recruitment of growth factors and cytokines. Cell therapy, either with hepatocytes or with bone marrow cells, has been proposed as a therapeutic option but remains in the experimental area. The present study aimed to investigate the effects of the therapy with cells immobilized in alginate microcapsules on the survival and hepatic regeneration of adult male Wistar rats with acute liver failure. On the first phase the acute liver failure model by 85% or 90% hepatectomy was standardized to achieve an adequate therapeutic window to study the mechanisms and effects of cell therapy. The second phase aimed to evaluate the effects of therapy using Hep G2 cells and bone marrow cells, either whole bone marrow (WBM) or mononuclear fraction (MF), in alginate microcapsules implanted in the peritoneum, on glucose and lactate levels, and 10-day survival. On phase 3, the effects of cell therapy with WBM and MF on hepatocyte proliferation and serum levels of cytokines and growth factors were evaluated in the first 72 hours after 90% hepatectomy. On phase 1, using ketamine and xylazine as anesthetic, despite glucose supplementation, 85% hepatectomy resulted in 50% survival at 72 hours, which is not adequate for a model of acute liver failure. Ninety-percent hepatectomy under ketamine and xylazine anesthesia resulted in increased mortality, although in the first 6 hours postoperatory. The change in anesthetic regimen for isofluorane reduced recovery time and increased early survival, allowing for an adequate therapeutic window. Survival was 26.7% at 72 hours and 6.7% at 10 days. On phase 2 microcapsules containing cells were implanted in rats after 90% hepatectomy. Bone marrow cell transplantation significantly increased 10-day survival over empty capsules group (WBM 1x106 cells: 63.6%, P=0.002; MF 1x106: 57.1%, P=0.001 and MF 3x107: 54.5%, P=0.003). Survival of animals treated with HepG2 (30.8%) was not different from empty capsules group. On the third phase, 72 hours after hepatectomy, empty capsules group showed significantly increase in the weight of remnant liver lobe and hepatic mass ratio compared to WBM (P=0.001 and P=0.020) and MF (P=0.002 and P=0.008). There was not statistic difference in the number of mitotic hepatocytes and in the serum levels of IL-6 between groups in any of the time points analyzed. Serum levels of TGF-beta were higher in the empty capsules group at 12 hours only (P=0.036). Serum levels of PDGF-BB in this group were significantly lower (P=0.017) than those from the MF group at 48 hours posthepatectomy. These findings suggest that 90% partial hepatectomy in Wistar rats anesthetized with isoflurane provides an adequate therapeutic window to study the effects and mechanisms of cell therapy. Cell therapy with bone marrow cells microencapsulated in alginate beads leads to increased survival in rats with 90% partial hepatectomy. This therapy reduced the weight of remnant lobes but did not changed hepatocyte regeneration and serum levels of IL-6, TGF-beta and PDGF-BB in the first 72 hours after surgery.