Le nucléole est le site de biogenèse des ribosomes, qui commence par la transcription des gènes d’ARN ribosomique (ARNr). Cependant, le nucléole est également impliqué dans d'autres processus cellulaires, comme l’organisation 3D du génome. Ainsi, des régions génomiques appelées NADs pour Nucleolus-Associated chromatin Domains, ont été identifiées dans des cellules animales et végétales. Ces régions sont surtout hétérochromatiques et les gènes associés ont tendance a être peu ou pas transcrits. Un des objectifs de ma thèse a été d’étudier l’implication du nucléole dans l’organisation de la chromatine au sein du noyau et la régulation transcriptionnelle de gènes transcrits par l’ARN Polymérase II chez Arabidopsis thaliana. Par ailleurs, parmi les centaines de copies de gènes d’ARNr, uniquement une fraction participe au processus de biogenèse des ribosomes. Dans un second temps, j’ai donc étudié le rôle de ces copies inactives. On a pu démontrer que l’absence des gènes d’ARNr inactifs n’engendre pas de changements majeurs dans la fonction nucléolaire. Par contre, ces copies participent à la stabilité du génome. En effet, en leur absence, des duplications génomiques allant jusqu’à plusieurs centaines de kilobases s’accumulent, entraînant des duplications de gènes et des différences du niveau d’expression de ces derniers. Finalement, les effets de ces changements structuraux sur la biologie de la plante sont discutés. / The nucleolus is the site of ribosome biogenesis, which begins with the transcription of ribosomal RNA (rRNA) genes. However, the nucleolus is also involved in other cellular processes, such as the 3D genome organization. Thus, genomic regions called NADs for Nucleolus-Associated chromatin Domains, have been identified in animal and plant cells. These regions are mostly heterochromatic and the associated genes tend to be poorly transcribed. One of the objectives of my thesis was to study the involvement of the nucleolus in the 3D genome organization and the transcriptional regulation of genes transcribed by RNA Polymerase II in Arabidopsis thaliana. In addition, only a fraction of rRNA gene copies participates in the process of ribosome biogenesis. In a second time, I studied the role of the inactive rRNA gene copies. We show that in their absence, there is no major changes in the nucleolus function. However, these copies contribute to genome stability. Indeed, in their absence, up to several hundred of kilobases long duplication events accumulate, resulting in the duplication and the differential expression of hundreds of genes. Finally, the impact of these structural changes on the plant biology are discussed.

Pour préserver l’intégrité de leur génome, les virus multipartite à ARN nécessitent une forte multiplicité d’infection qui représente un coût biologique inapproprié en terme de réplication virale. Dans cette étude, un réseau d’interaction entre ARN génomiques (ARNg), constitué d’au moins un type de chaque ARNg est proposé. Un tel réseau permet de réduire les coûts biologiques liés à la réplication en assurant une reconnaissance intermoléculaire et une mobilisation d’un complexe RNP modulaire maintenant l’intégrité du génome. Un tel complexe est considéré comme l’unité infectieuse mobile assurant la dissémination du virus dans la plante entière. Le but de cette thèse a été de démontrer l’existence d’interactions entre les ARNg du beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) et de déterminer l’incidence de ces interactions sur le cycle viral. Une formule génomique a été déterminée pour différentes plantes et tissus. Les ARNg ont tous été co-détectés dans des cellules isolées issues de tissus infectés. Un domaine d’interaction entre l’ARN1 et 2 a été identifié in vitro et in silico puis évaluée in vivo par des approches de mutagenèse et de complémentation. / Multipartite RNA virus condition to provide a complete set of genomic segments in each infected cell implies a high level of MOI that results in an unsustainable biological cost in terms of viral replication. In the proposed model, to minimize the cost of the genome integrity preservation, a network of RNA/RNA interactions determines the recognition and the mobilization of at least one of each genomic RNAs in a modular RNP complex. Such complex must be considered as the mobile infectious unit of the segmented genome during viral spread in the plant. The Aim of this thesis was to experimentally determine the existence of RNA/RNA interactions between BNYVV RNAs and their implication in the viral cycle. BNYVV genomic segments have been co-detected within isolated single cells from systemic tissues where they accumulate to reach set point genome formulas. In the model where vRNAs interact each other to form the minimal mobile infective unit, RNA1 and RNA2 interaction domain has been identified in silico and in vitro. The rationale of such an interaction has been provided in vivo using BNYVV and Beet soil-borne mosaic virus chimeras.

Les membres de la famille SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), présents dans tous les domaines de la vie, sont impliqués dans des processus allant de la cohésion des chromatides-sœurs jusqu’à la réparation de l’ADN. Chacun des membres de cette famille, composée de 6 membres (Smc1 à Smc6), s’associe avec un autre membre ainsi qu’à des sous-unités non-SMC pour former 3 complexes : cohésine, condensine et Smc5-6. L’implication du complexe Smc5-6 dans plusieurs aspects du maintien de l’intégrité génomique est bien démontrée. Néanmoins, une question fondamentale concernant ce complexe demeure encore sans réponse: comment peut-il être impliqué dans autant d’aspects de la vie d’une cellule? Encore à ce jour, il est difficile de répondre à cette question en raison du manque d’information disponible au sujet des activités biochimiques de ce complexe. C’est pourquoi l’objectif de ce travail consiste en la caractérisation biochimique du complexe Smc5-6. La biochimie de cohésine et condensine suggère diverses possibilités en ce qui a trait aux activités biochimiques du complexe Smc5-6. La première étape de mon projet fut donc d’élaborer une procédure pour la purification de Smc5 et Smc6 après surexpression en levure. Après plusieurs expériences, il apparut clair que les deux protéines possèdent une activité de liaison à l’ADN simple brin (ADNsb) ainsi qu’à l’ADN double brins (ADNdb) et que, même si les protéines peuvent se lier aux deux types d’ADN, elles possèdent une plus grande affinité pour l’ADNsb. De plus, ces expériences permirent de démontrer que l’interaction entre Smc5 ou Smc6 et l’ADNsb est très stable, alors que l’interaction avec l’ADNdb ne l’est pas. Suite à l’obtention de ces résultats, la seconde étape fut la détermination de la ou des partie(s) de Smc5 et Smc6 permettant la liaison à l’ADN. Pour répondre à cette question, une dissection moléculaire fut réalisée, suivi d’une caractérisation des différents domaines constituants Smc5 et Smc6. De cette façon, il fut possible de démontrer qu’il existe deux sites de liaison à l’ADN sur Smc5 et Smc6 ; le premier site se trouvant dans le domaine «hinge» ainsi que dans la région adjacente du domaine «coiled-coil» et le second au niveau de la tête ATPase des deux protéines. Bien que les deux domaines puissent lier l’ADNsb, il fut démontré qu’une différence majeure existe au niveau de leur affinité pour ce type d’ADN. En effet, le domaine «hinge» possède une affinité plus forte pour l’ADNsb que la tête ATPase. De plus, cette dernière est incapable de lier l’ADNdb alors que le domaine «hinge» le peut. L’identification des sites de liaison à l’ADN sur Smc5 et Smc6 permettra de créer de nouveaux mutants possédant un défaut dans la liaison à l’ADN. Ainsi, l’étude du complexe Smc5-6 durant la réparation de l’ADN in vivo sera facilité. / The Smc5-6 complex is part of the SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) family and is involved in the maintenance of genome integrity. This complex is required for the replication and repair of DNA. Unfortunately, the DNA substrates recognized by the Smc5-6 complex are still unknown. To address this gap, I used a biochemical approach to purify and functionally characterize the core of the Smc5-6 complex represented by the two SMC proteins. Subsequently, I wanted to understand which part(s) of Smc5 or Smc6 mediate their binding to DNA. I show here that Smc5 and Smc6 bind to all types of DNA tested. Despite this ability to associate with several types of nucleic acids, they have a clear preference for single-stranded DNA (ssDNA). The ability of Smc5 and Smc6 to link DNA independently of each other suggests that both SMC proteins have the potential to target the Smc5-6 complex to its DNA substrates in vivo. Furthermore, the minimal length of ssDNA required for the binding of Smc5 or Smc6 is between 45 to 75 nucleotides. This length of ssDNA is shorter than the size of ssDNA intermediates created during DNA repair or replication reactions. In addition to having a preference for ssDNA, the binding of both SMC proteins to this type of DNA is stronger than their binding to double-stranded DNA (dsDNA). Finally, the molecular dissection of SMC proteins into functional domains revealed that there are two independent DNA-binding sites on each molecule of Smc5 or Smc6. The first region is located in the hinge domain, while the second region is located in the ATPase head of the protein. The affinity and selectivity of independent domains towards DNA substrates suggest a functional differentiation between the two DNA-binding sites of SMC molecules. Indeed, the hinge domain has a greater affinity for ssDNA than the ATPase head. In terms of selectivity, the hinge domain is capable of binding to dsDNA whereas the ATPase head cannot. Taken together, our identification of the DNA-binding domains on Smc5 and Smc6 will enable the creation of new mutants with a defect in their DNA-binding activity. Thus, the study of the Smc5-6 complex during DNA repair, in vivo, will be facilitated.

No description available.