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Rôle de la protéine p14 du BNYVV et de l'ARN-3 viral dans la suppression de l'interférence par l'ARN et le mouvement à longue distance / Role of the BNYVV-p14 protein and the viral RNA-3 in the RNA silencing suppression and the long distance movementFlobinus, Alyssa 16 September 2016 (has links)
Le beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) est un phytovirus qui possède un génome segmenté à ARN de polarité positive. L’ARN3 viral renferme le domaine « core » qui contient une séquence de 20 nucléotides appelée « coremin », indispensable au mouvement systémique du virus chez Beta macrocarpa. L’ARN3 subit un processus de dégradation qui conduit à la formation d’un ARN non codant (ncRNA3) correspondant à son extrémité 3’. Ce dernier est stabilisé par la séquence « coremin » à son extrémité 5’. Grâce à l’outil génétique levure, l’exoribonucléase Xrn1 puis l’exoribonucléase XRN4 de plante ont été identifiées comme étant responsable de l’accumulation du ncRNA3 à partir d’ARN3. Nous avons démontré in vitro que l’accumulation de ncRNA3 est liée au blocage de Xrn1 par « coremin ». La protéine virale p14, un suppresseur du RNA silencing codée par l’ARN2, est aussi nécessaire au mouvement systémique du virus et interagit avec la séquence « coremin ». Nos travaux confirment que l’ARN3 est capable de complémenter partiellement un mutant allélique de p14 dans l’infection locale et systémique. Nos résultats mettent en évidence un effet de la protéine p14 sur la systémie du RNA silencing et sur une éventuelle cible cellulaire RDR6. / The beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) is a multipartite positive-stranded RNA phytovirus. The RNA3 contains a « core » sequence in which resides the « coremin » motif of 20 nucleotides absolutely required for the viral systemic movement in Beta macrocarpa. The RNA3 undergoes a process that produces a noncoding RNA3 (ncRNA3), stabilized by « coremin » at its 5’ end. Using a yeast genetic approach, the exoribonuclease Xrn1 and plant XRN4 have been identified as being responsible for the ncRNA3 accumulation from RNA3 processing. In vitro, we showed that the ncRNA3 accumulation is due to the stalling of Xrn1 by “coremin”. The viral p14 protein, an RNA silencing suppressor encoded by the RNA2, is also required for the systemic movement and interacts with the “coremin” sequence. Our studies demonstrated the ability of RNA3 to partially complement an allelic p14 mutant in local and systemic infections. Our data highlighted an effect of the p14 protein on the RNA silencing movement and on the potential cellular target RDR6.
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RNA/RNA interactions involved in the regulation of Benyviridae viral cicle / Interactions ARN/ARN impliquées dans la régulation du cycle viral des BenyviridaeDall'Ara, Mattia 18 May 2018 (has links)
Pour préserver l’intégrité de leur génome, les virus multipartite à ARN nécessitent une forte multiplicité d’infection qui représente un coût biologique inapproprié en terme de réplication virale. Dans cette étude, un réseau d’interaction entre ARN génomiques (ARNg), constitué d’au moins un type de chaque ARNg est proposé. Un tel réseau permet de réduire les coûts biologiques liés à la réplication en assurant une reconnaissance intermoléculaire et une mobilisation d’un complexe RNP modulaire maintenant l’intégrité du génome. Un tel complexe est considéré comme l’unité infectieuse mobile assurant la dissémination du virus dans la plante entière. Le but de cette thèse a été de démontrer l’existence d’interactions entre les ARNg du beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) et de déterminer l’incidence de ces interactions sur le cycle viral. Une formule génomique a été déterminée pour différentes plantes et tissus. Les ARNg ont tous été co-détectés dans des cellules isolées issues de tissus infectés. Un domaine d’interaction entre l’ARN1 et 2 a été identifié in vitro et in silico puis évaluée in vivo par des approches de mutagenèse et de complémentation. / Multipartite RNA virus condition to provide a complete set of genomic segments in each infected cell implies a high level of MOI that results in an unsustainable biological cost in terms of viral replication. In the proposed model, to minimize the cost of the genome integrity preservation, a network of RNA/RNA interactions determines the recognition and the mobilization of at least one of each genomic RNAs in a modular RNP complex. Such complex must be considered as the mobile infectious unit of the segmented genome during viral spread in the plant. The Aim of this thesis was to experimentally determine the existence of RNA/RNA interactions between BNYVV RNAs and their implication in the viral cycle. BNYVV genomic segments have been co-detected within isolated single cells from systemic tissues where they accumulate to reach set point genome formulas. In the model where vRNAs interact each other to form the minimal mobile infective unit, RNA1 and RNA2 interaction domain has been identified in silico and in vitro. The rationale of such an interaction has been provided in vivo using BNYVV and Beet soil-borne mosaic virus chimeras.
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Proteínas de movimiento de la familia 30K:interacción con membranas biológicas y factores proteicos y su implicación en el transporte viralPeiró Morell, Ana 30 March 2015 (has links)
Para que el proceso infeccioso de un virus de plantas tenga éxito la progenie
viral tiene que propagarse desde las primeras células infectadas al resto de la planta;
inicialmente se moverá célula a célula a través de los plasmodesmos (PDs) hasta
alcanzar el sistema vascular, lo cual le permitirá invadir las partes distales de la planta.
En este proceso, las proteínas de movimiento (MPs), junto con la colaboración de otros
actores secundarios, desempeñan un papel relevante. El conocimiento de la posible
asociación de las MPs con estructuras u orgánulos celulares así como de la interacción
con factores del huésped es de vital importancia para poder desarrollar estrategias
antivirales que permitan una mejora en la producción de los cultivos. Además, este tipo
de estudios no sólo han posibilitado un mayor conocimiento de las respuestas al estrés
en plantas sino que han sido pioneros en desentrañar los mecanismos de translocación
intercelular de factores celulares implicados en los procesos de desarrollo de las
plantas.
Las MPs virales se clasifican en familias/grupos en función de su grado de
similitud. Los virus, cuyas MPs pertenecen a la Superfamilia 30K, expresan una única MP
encargada de orquestar el movimiento intra- e intercelular de genoma viral. En el
Capítulo 1 de la presente Tesis se ha caracterizado la asociación de la MP del Virus del
mosaico del tabaco (TMV), miembro tipo de la familia 30K, al sistema de
endomembranas. Mediante el uso de aproximaciones in vivo se ha estudiado la
eficiencia de inserción de sus regiones hidrofóbicas (HRs) en la membrana del retículo
endoplasmático (ER). Nuestros resultados demuestran que ninguna de las dos HRs de la
MP es capaz de atravesar las membranas biológicas y que la alteración de la
hidrofobicidad de la primera HR es suficiente para modificar su asociación a la
membrana. En base a los resultados obtenidos, proponemos un modelo topológico en
el cual la MP del TMV se encontraría fuertemente asociada a la cara citosólica de la
membrana del ER, sin llegar a atravesarla. La observación de que i), el modelo
propuesto es compatible con otros motivos, previamente caracterizados, de la MP de
TMV y ii), concuerda con la topología descrita para otras MPs de la familia 30K, permite
cuestionar el modelo establecido desde el año 2000 para la MP de TMV así como
predecir, en base a la conservada estructura secundaria de las MPs de esta familia, una
topología similar para todos sus componentes.
Para el transporte intercelular de los virus de plantas se han descrito tres
modelos en base a la capacidad de transportar complejos ribonucloeprotéicos, a través
de PD modificados, formados por el RNA viral y la MP (ej. MP de TMV) más la proteína
de cubierta (ej. MP del virus del mosaico del pepino, CMV) o la capacidad de transportar
viriones a través estructuras tubulares formadas por la MP (ej. MP del Virus del mosaico
del caupí, CPMV). A pesar de las diferencias observadas entre los tres modelos, las MPs
representativas de cada uno de ellos pertenecen a la misma familia 30K y son
funcionalmente intercambiables (MPs de TMV, CMV, CPMV, Virus del mosaico del
Bromo -BMV- o Virus de los anillos necróticos de los prunus -PNRSV-) por la MP del Virus
del mosaico de la alfalfa (AMV), para el transporte a corta distancia. Con el objeto de
comprender la versatilidad que presentan las MPs en cuanto al movimiento viral,
hemos analizado la capacidad de estas MPs heterólogas de transportar sistémicamente
el genoma quimérico del AMV. El estudio ha revelado que todas las MPs analizadas
permiten el transporte del genoma quimera a las partes distales de la planta,
independientemente del modelo descrito para el transporte a corta distancia, aunque
requieren la extensión de los 44 aminoácidos C-terminales de la MP del AMV. Además,
para todas las ellas, excepto para la MP del TMV, se ha establecido una relación entre la
capacidad de movimiento local y la presencia del virus en las hojas no inoculadas de la
planta, indicando la existencia de un umbral de transporte célula a célula, por debajo
del cual, el virus es incapaz de invadir sistémicamente la planta.
Durante el proceso de infección viral, las MPs interaccionan tanto con otras
proteínas de origen viral como de la planta huésped. La interacción entre las MPs y
dichos factores de la planta afectan a la patogénesis viral, facilitando u obstaculizando
el movimiento intra- o intercelular del virus. En el Capítulo 3 del presente trabajo hemos
demostrado la interacción entre la MP del AMV y dos miembros de la familia de
Patellinas de arabidopsis, Patellin 3 (atPATL3) y Patellin 6 (atPATL6), mediante el
sistema de los dos híbridos de levadura y ensayos de reconstitución bimolecular de la
fluorescencia. Nuestros resultados, en general, demuestran que la interacción entre la
MP-PATLs obstaculizaría un correcto direccionamiento de la MP al PD, dando lugar a un
movimiento intracelular menos eficiente de los complejos virales, que forma la MP, y
disminuyendo el movimiento célula a célula del virus. Podríamos estar hablando de un
posible mecanismo de defensa de la planta, dirigido a evitar la invasión sistémica del
huésped. En este sentido, las MPs virales pueden ser buenos candidatos para el
desarrollo de estrategias antivirales dado que cualquier respuesta de defensa de la
planta que, a priori, reduzca el transporte célula a célula del virus, puede representar la
diferencia entre una infección local o sistémica, como hemos observado en el Capítulo 2
del presente trabajo. Los virus, a su vez, también son capaces de evolucionar hacia
variantes más eficaces, que permitan superar las diferentes barreras defensivas de la
planta huésped. En este contexto hemos identificado a la MP del Virus del bronceado
del tomate (TSWV) como determinante de avirulencia en la resistencia mediada por el
gen Sw-5. Del mismo modo, comprobamos que el cambio de 1-2 residuos de amino
ácidos de la MP de TSWV fue suficiente para superar la resistencia pero que a la vez, y
posiblemente debido a las altas restricciones que conlleva el reducido genoma de un
virus, afectaron a la eficiencia de la MP. / Peiró Morell, A. (2014). Proteínas de movimiento de la familia 30K:interacción con membranas biológicas y factores proteicos y su implicación en el transporte viral [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48471 / TESIS
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