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Bloom syndrome is a rare autosomal recessive disorder that is caused by mutations in the BLM gene. BLM associates with TopoIIIα and RMI1 to form a complex that is essential to maintain genome integrity. This complex catalyzes a dissolution reaction that resolves recombination intermediates containing two Holliday junctions without crossing over of genetic material. Dissolution activity is remarkable because it accounts for the in vivo role of BLM-TopoIIIα-RMI1 in suppressing sister chromatid exchanges. To further understand the biochemical roles that each member of the BLM complex plays in dissolution, I generated single-stranded catenanes that resemble the proposed intermediates at the latest steps of dissolution. Using this substrate, I demonstrated that TopoIIIα is a single-stranded DNA decatenase that is specifically stimulated by BLM and RMI1. Interaction between TopoIIIα and RMI1 is essential for the optimal decatenase activity. Furthermore, binding of RPA to single-stranded DNA substrate inhibits TopoIIIα decatenase activity. However, complex formation between BLM, TopoIIIα and RMI enables TopoIIIα to displace RPA and catalyze decatenation. Since the decatenase activity is presumed to be involved in many aspects of DNA metabolism, I investigated the roles of RMI1 and TopoIIIα in DNA replication in vivo. Using the molecular combing technique, I showed that RMI1 functions downstream of BLM to promote normal replication fork progression. In addition, BLM, TopoIIIα and RMI1 colocalize with one another in response to replication stress. Finally, interaction between TopoIIIα and RMI1 is essential for nuclear localization of the complex and for the complex to promote recovery from replication stress. This work defines molecular functions for RMI1 and TopoIIIα in DNA replication and repair, providing insight into their roles as suppressors of genome instability.

Bloom syndrome is a rare autosomal recessive disorder that is caused by mutations in the BLM gene. BLM associates with TopoIIIα and RMI1 to form a complex that is essential to maintain genome integrity. This complex catalyzes a dissolution reaction that resolves recombination intermediates containing two Holliday junctions without crossing over of genetic material. Dissolution activity is remarkable because it accounts for the in vivo role of BLM-TopoIIIα-RMI1 in suppressing sister chromatid exchanges. To further understand the biochemical roles that each member of the BLM complex plays in dissolution, I generated single-stranded catenanes that resemble the proposed intermediates at the latest steps of dissolution. Using this substrate, I demonstrated that TopoIIIα is a single-stranded DNA decatenase that is specifically stimulated by BLM and RMI1. Interaction between TopoIIIα and RMI1 is essential for the optimal decatenase activity. Furthermore, binding of RPA to single-stranded DNA substrate inhibits TopoIIIα decatenase activity. However, complex formation between BLM, TopoIIIα and RMI enables TopoIIIα to displace RPA and catalyze decatenation. Since the decatenase activity is presumed to be involved in many aspects of DNA metabolism, I investigated the roles of RMI1 and TopoIIIα in DNA replication in vivo. Using the molecular combing technique, I showed that RMI1 functions downstream of BLM to promote normal replication fork progression. In addition, BLM, TopoIIIα and RMI1 colocalize with one another in response to replication stress. Finally, interaction between TopoIIIα and RMI1 is essential for nuclear localization of the complex and for the complex to promote recovery from replication stress. This work defines molecular functions for RMI1 and TopoIIIα in DNA replication and repair, providing insight into their roles as suppressors of genome instability.

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Le nucléole est le site de biogenèse des ribosomes, qui commence par la transcription des gènes d’ARN ribosomique (ARNr). Cependant, le nucléole est également impliqué dans d'autres processus cellulaires, comme l’organisation 3D du génome. Ainsi, des régions génomiques appelées NADs pour Nucleolus-Associated chromatin Domains, ont été identifiées dans des cellules animales et végétales. Ces régions sont surtout hétérochromatiques et les gènes associés ont tendance a être peu ou pas transcrits. Un des objectifs de ma thèse a été d’étudier l’implication du nucléole dans l’organisation de la chromatine au sein du noyau et la régulation transcriptionnelle de gènes transcrits par l’ARN Polymérase II chez Arabidopsis thaliana. Par ailleurs, parmi les centaines de copies de gènes d’ARNr, uniquement une fraction participe au processus de biogenèse des ribosomes. Dans un second temps, j’ai donc étudié le rôle de ces copies inactives. On a pu démontrer que l’absence des gènes d’ARNr inactifs n’engendre pas de changements majeurs dans la fonction nucléolaire. Par contre, ces copies participent à la stabilité du génome. En effet, en leur absence, des duplications génomiques allant jusqu’à plusieurs centaines de kilobases s’accumulent, entraînant des duplications de gènes et des différences du niveau d’expression de ces derniers. Finalement, les effets de ces changements structuraux sur la biologie de la plante sont discutés. / The nucleolus is the site of ribosome biogenesis, which begins with the transcription of ribosomal RNA (rRNA) genes. However, the nucleolus is also involved in other cellular processes, such as the 3D genome organization. Thus, genomic regions called NADs for Nucleolus-Associated chromatin Domains, have been identified in animal and plant cells. These regions are mostly heterochromatic and the associated genes tend to be poorly transcribed. One of the objectives of my thesis was to study the involvement of the nucleolus in the 3D genome organization and the transcriptional regulation of genes transcribed by RNA Polymerase II in Arabidopsis thaliana. In addition, only a fraction of rRNA gene copies participates in the process of ribosome biogenesis. In a second time, I studied the role of the inactive rRNA gene copies. We show that in their absence, there is no major changes in the nucleolus function. However, these copies contribute to genome stability. Indeed, in their absence, up to several hundred of kilobases long duplication events accumulate, resulting in the duplication and the differential expression of hundreds of genes. Finally, the impact of these structural changes on the plant biology are discussed.

Pour préserver l’intégrité de leur génome, les virus multipartite à ARN nécessitent une forte multiplicité d’infection qui représente un coût biologique inapproprié en terme de réplication virale. Dans cette étude, un réseau d’interaction entre ARN génomiques (ARNg), constitué d’au moins un type de chaque ARNg est proposé. Un tel réseau permet de réduire les coûts biologiques liés à la réplication en assurant une reconnaissance intermoléculaire et une mobilisation d’un complexe RNP modulaire maintenant l’intégrité du génome. Un tel complexe est considéré comme l’unité infectieuse mobile assurant la dissémination du virus dans la plante entière. Le but de cette thèse a été de démontrer l’existence d’interactions entre les ARNg du beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) et de déterminer l’incidence de ces interactions sur le cycle viral. Une formule génomique a été déterminée pour différentes plantes et tissus. Les ARNg ont tous été co-détectés dans des cellules isolées issues de tissus infectés. Un domaine d’interaction entre l’ARN1 et 2 a été identifié in vitro et in silico puis évaluée in vivo par des approches de mutagenèse et de complémentation. / Multipartite RNA virus condition to provide a complete set of genomic segments in each infected cell implies a high level of MOI that results in an unsustainable biological cost in terms of viral replication. In the proposed model, to minimize the cost of the genome integrity preservation, a network of RNA/RNA interactions determines the recognition and the mobilization of at least one of each genomic RNAs in a modular RNP complex. Such complex must be considered as the mobile infectious unit of the segmented genome during viral spread in the plant. The Aim of this thesis was to experimentally determine the existence of RNA/RNA interactions between BNYVV RNAs and their implication in the viral cycle. BNYVV genomic segments have been co-detected within isolated single cells from systemic tissues where they accumulate to reach set point genome formulas. In the model where vRNAs interact each other to form the minimal mobile infective unit, RNA1 and RNA2 interaction domain has been identified in silico and in vitro. The rationale of such an interaction has been provided in vivo using BNYVV and Beet soil-borne mosaic virus chimeras.

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Chez les plantes, les méristèmes ont la capacité de se diviser tout au long de la vie de la plante, qui peut dépasser 1000 ans pour certaines espèces. De plus, la lignée germinale n'est pas définie dès l'embryogenèse mais provient des cellules méristématiques et s’individualise relativement tard au cours du développement. Il est donc crucial que le cycle cellulaire soit finement régulé afin d'éviter une accumulation de mutations au cours de la croissance végétative et de la reproduction. Chez tous les eucaryotes, les protéines CDT1 sont impliquées dans l’initiation de la réplication de l'ADN en permettant la formation du complexe de pré-réplication et l'ouverture de la fourche de réplication avant le recrutement des ADN polymérases. Leur activité est strictement régulée afin que chaque partie du génome soit répliquée une fois et une seule au cours de la phase S. Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour deux protéines homologues du facteur d’initiation de la réplication CDT1 (CDC10 Target1) : AtCDT1a et AtCDT1b. La sur-expression de CDT1a stimule la réplication de l’ADN et, chez Arabidopsis, cette protéine aurait une double fonction dans la régulation du cycle cellulaire et dans la division des plastes. Nous avons étudié ici les fonctions respectives de AtCDT1a et AtCDT1b. En utilisant des approches génétiques, nous avons montré que ces deux protéines jouent des rôles partiellement redondants pour maintenir l’intégrité du génome et permettre le développement des gamétophytes. De plus, en réalisant une approche de TAP (Tandem Affinity Purification), nous avons montré qu’elles interagissent avec l’ADN polymérase ε, une ADN polymérase réplicative, ouvrant de nouvelles perspectives de recherche concernant le rôle des protéines CDT1de plantes lors de la réplication de l'ADN. En parallèle, nous avons essayé d'élucider les spécificités de CDT1a et plus précisément de son extension N-terminale qui est absente de CDT1b. Nous avons constaté que ce domaine de CDT1a est requis pour son interaction avec l'ADN pol ε, et que les mutants cdt1a complémentés par une version tronquée de la protéine présentent une croissance considérablement réduite, un arrêt prématuré du méristème racinaire, et un stress de l'ADN constitutif, ce qui suggère que l’interaction CDT1a/pol ε est indispensable à la progression normale de la phase S. L’ensemble de nos résultats ont révélé de nouvelles fonctions pour les homologues de CDT1 de plantes. Une question importante sera de déterminer si celles-ci sont caractéristiques du cycle cellulaire chez les plantes, ou si nous avons identifié de nouveaux mécanismes qui sont conservés chez tous les eucaryotes. / In plants, meristems retain the ability to divide throughout the life cycle of plants, which can last for over 1000 years in some species. Furthermore, the germline is not laid down early during embryogenesis but originates from the meristematic cells relatively late during development. Thus, accurate cell cycle regulation is of utmost importance to avoid the accumulation of mutations during vegetative growth and reproduction. In all eukaryotes, CDT1 proteins are involved in the onset of DNA replication by allowing the formation of the pre-replication complex and subsequent opening of the replication fork. Their activity is strictly regulated to ensure faithful duplication of the genome during S-phase. The Arabidopsis thaliana genome encodes two homologs of the replication licensing factor CDT1 (CDC10 Target 1): AtCDT1a and AtCDT1b. Overexpression of CDT1a stimulates DNA replication, and this protein would have a function both in cell cycle regulation and plastid division.Here, we have investigated the respective roles of Arabidopsis CDT1a and CDT1b. Using genetic approaches, we have shown that the two proteins function partially redundantly to maintain genome integrity and allow gametophyte development. In addition, using Tandem Affinity Purification, we have shown that they interact with DNA pol ε, a replicative DNA polymerase, opening further research prospects regarding the role of plant CDT1 proteins during DNA replication. In parallel, we have tried to elucidate the specificities of CDT1a and more precisely of its N-terminal extension that is absent from CDT1b. We have found that this domain of CDT1a is required for its interaction with DNA pol ε, and that cdt1a mutants complemented with a truncated version of the protein show drastically reduced growth, premature meristem arrest, and constitutive DNA stress, suggesting that the CDT1a/pol ε interaction is indispensible to the normal progression of S-phase. Together, our results have unraveled new functions for plant CDT1 homologues, and one important aspect of future research will be to determine whether these are features of the plant cell cycle, or if we have identified new mechanisms that are conserved in all eukaryotes.

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