Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-24T18:20:21Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 484015 bytes, checksum: fda75b7a7bc67b7a6301406613010fcd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:20:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 484015 bytes, checksum: fda75b7a7bc67b7a6301406613010fcd (MD5) Previous issue date: 2017-07-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Os vírus são as formas de vida mais abundantes e geneticamente diversas conhecidas em nossa biosfera. Para infectar hospedeiros com sucesso, os vírus manipulam componentes celulares do hospedeiro, recrutando fatores do hospedeiro necessários para replicação, infeção e transmissão. Além disso, os vírus precisam suplantar diversas estratégias de defesa do hospedeiro levando a um complexo mecanismo de coevolução que envolve diversas interações. Diferentes vírus podem interagir com componentes celulares do hospedeiro de forma semelhante. Foi demonstrado que a presença da proteína translationally controlled tumor protein (TCTP) é necessária para o estabelecimento de uma infecção eficiente por potyvírus. TCTP é uma proteína multifuncional encontrada em quase todos os eucariotos envolvida no crescimento celular, homeostase de íons, reparo de danos no DNA e possuí atividade anti-apoptótica. Apesar de inúmeros estudos com TCTP, o envolvimento desta proteína na infecção viral ainda não é totalmente compreendido. Devido a sua diversidade funcional, é possível imaginar que TCTP possa ser um fator do hospedeiro envolvido em infeções causadas por vírus de diferentes grupos. Desta forma, neste trabalho, foi avaliado o efeito de TCTP na infecção por begomovírus. Para isso, plantas de Nicotiana benthamiana com TCTP silenciada por VIGS foram utilizados para estudar o efeito da TCTP na infecção pelo begomovírus Tomato yellow spot virus (ToYSV). O silenciamento de TCTP levou a um maior acúmulo de vírus, sugerindo que TCTP é um fator do hospedeiro envolvido no processo de defesa á infecção viral. Além disso, o mRNA de TCTP é altamente estruturado em mamíferos e está relacionado com a indução de resposta a infecções por diferentes vírus. Por ser um mRNA altamente estruturado é razoável supor que o mRNA de TCTP pode ser alvo do processo de silenciamento pós transcrisional da planta levando à produção de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) através da clivagem por proteínas Dicer e os siRNAs gerados podem regular a expressão de genes endógenos do hospedeiro. Desta forma, foi realizada uma análise in silico para avaliar os possíveis siRNAs gerados a partir do silenciamento do mRNA de TCTP e os possíveis alvos desses siRNAs. Genes que podem estar envolvidos em infecção viral, como aqueles que codificam proteína kinases, proteínas envolvidas na via de ubiquitinação, fatores de transcrição e tradução e proteínas de ligação ao cálcio foram alguns dos genes identificados como possíveis alvos destes siRNAs. / Viruses are the most abundant and genetically diverse life forms known in our biosphere. To successfully infect hosts, viruses manipulate host cellular components, recruiting host factors necessary for replication, infection, and transmission. In addition, viruses need to supplant various host defense strategies, leading to a complex coevolution mechanism involving virus-host interactions. Different viruses can interact with host cell components similarly or even antagonistic. The presence of the protein translationally controlled tumor protein (TCTP) has been shown to be necessary for the establishment of an efficient potyvirus infection. TCTP is a multifunctional protein found in almost all eukaryotes and is involved in cell growth; ions homeostasis; DNA damage repair and anti-apoptotic activity. Despite numerous studies with TCTP, the involvement of this protein in viral infection is not yet fully understood. Due to its functional diversity, it is possible to imagine that TCTP may be a host factor involved in infections caused by viruses of different groups. Thus, in this work, the effect of TCTP on begomovirus infection was evaluated. Nicotiana benthamiana plants silenced for TCTP by VIGS experiments were used to study the effect of TCTP expression on infection by the begomovirus Tomato yellow spot virus (ToYSV). TCTP silencing led to higher accumulation of the virus, suggesting that TCTP is a host factor involved in viral infection defense process. Furthermore, TCTP mRNA is highly structured in mammals and is related to the induction of defense response to different viruses. Because it is a highly structured mRNA, it is reasonable to assume that TCTP mRNA may be the target of the plant post transcription gene silencing mechanism, leading to the production of small interfering RNAs (siRNAs) by the cleavage of Dicer proteins and the siRNAs generated might regulate the expression of host endogenous genes involves in virus infection. In silico analysis was performed to evaluate the possible siRNAs generated from the silencing of TCTP mRNA, and the respective targets of this siRNAs. Genes involved in viral infection, such as those encoding protein kinases, proteins involved in the ubiquitination pathway, transcription and translation factors, and calcium binding proteins were some of the genes identified as possible targets of these predicted siRNAs.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo .pdf: 1092167 bytes, checksum: 8586b9a4bcc728e0319bbbdb012ca136 (MD5) Previous issue date: 2012-07-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Viruses are organisms with small genomes of simple organization, which coding about 3 to encode 10 viral proteins. The success of the infection depends on the manipulation of the cell by the virus, by means of complex interactions occurring between viral factors and host factors. The induced changes by virus infection include cell morphology changes, cell cycle changes and alterations in gene expression, among others. Understanding the processes that favor viral infection necessarily involves the study of virus-host interactions. In order to better understand the processes related to infection by tomato potyvirus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) a subtractive library was built 72 hours after infection. Several genes were identified as induced or repressed by viral infection. Among the induced genes, is the gene encoding the Translationally controlled tumor protein (TCTP). TCTP protein is highly conserved in all eukaryotes. Its functions are related to growth control and cell cycle, anti-apoptotic activity, and response to different biotic and abiotic stresses. The involvement of this protein in infection PepYMV has not been established, but studies in a strain of transgenic tomato plants silenced for TCTP showed that the silenced plants have a lower accumulation of PepYMV, indicating that TCTP promotes viral infection. In this study, we sought to advance the understanding of mechanisms involving TCTP in the process of infection by PepYMV. N. benthamiana plants silenced by VIGS TCTP were used to study the effect of silencing in viral infection, and the silenced plants accumulate fewer viruses in early stages of virus infection. Individual expression of viral proteins in N. benthamiana identified P3 and CP as capable of inducing TCTP expression at similar levels to those induced during PepYMV infection, and expression of NIb reduced expression of TCTP. The verification of direct interactions occurrence between viral proteins and TCTP by double-hybrid assay showed that TCTP not interact separately with any of the proteins of viral origin. Purification of proteins of health and infected N. benthamiana plants by affinity with TCTP identified several proteins that putativaly interacts with TCTP. As in two hybrid assay, interactions involving PepYMV proteins were not detected. These results sugests that TCTP actuation must involve the formation of protein complexes involving viral and plant proteins or contribute indirectly to PepYMV infection, without involving direct interactions between TCTP and viral proteins. / Os vírus são organismos com genomas pequenos, de organização simples, que codificam em média 3 a 10 proteínas. O sucesso da infecção depende da manipulação da célula pelo vírus, por meio de interações complexas que ocorrem entre fatores virais e fatores do hospedeiro. As modificações induzidas na célula incluem alterações morfológicas, alteração do ciclo celular e na expressão gênica, entre outras. A compreensão dos processos que favorecem a infecção viral passa necessariamente pelo estudo de interações vírus-hospedeiro. No intuito de compreender melhor os processos relacionados à infecção de tomateiros pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) uma biblioteca subtrativa foi construída 72 horas após a infecção. Diversos genes cuja expressão foi alterada pela infecção foram identificados. Dentre os genes induzidos, se encontra o gene que codifica a Translationally controlled tumor protein (TCTP). A proteína TCTP é altamente conservada em todos os eucariotos. Suas funções estão relacionadas a controle do crescimento e ciclo celular, atividade anti-apoptótica, e resposta a diferentes tipos de estresses abióticos e bióticos. O envolvimento desta proteína na infecção pelo PepYMV ainda não foi estabelecido, porém estudos em uma linhagem de tomateiro transgênica silenciadas para a TCTP, mostraram que as plantas silenciadas apresentam um menor acúmulo de PepYMV, indicando que a TCTP favorece a infecção por este vírus. Neste trabalho, buscou-se avançar na compreensão dos mecanismos que envolvem a TCTP no processo de infecção pelo PepYMV. Plantas de Nicotiana benthamiana silenciadas para TCTP por VIGS (Virus Induced Gene Silence) foram utilizadas para estudar o efeito do silenciamento na infecção viral, sendo que as plantas silenciadas acumularam menos vírus no início da infecção. A expressão individual das proteínas de origem viral em N. benthamiana identificou a P3 e a CP como capazes de induzir a expressão de TCTP em níveis semelhantes aos observados durante a infecção pelo PepYMV, sendo que a expressão da proteína NIb reduziu a expressão de TCTP. A verificação da ocorrência de interações diretas entre a TCTP e as proteínas virais, por ensaio de duplo híbrido, mostrou que a TCTP não interage separadamente com as proteínas de origem viral. A purificação de proteínas de plantas de N. benthamiana, sadias e infectadas, por afinidade com a TCTP identificou diversas proteínas que possivelmente 7 interagem com a TCTP. Assim como no ensaio de duplo híbrido, a interação com proteínas virais não foi detectada. Estes resultados sugerem que o papel da TCTP deve envolver a formação de complexos proteicos entre proteínas virais e da planta, ou favorecer a infecção de forma indireta.