Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 752482 bytes, checksum: a4ec60bad1c1315d52f2a91132509d98 (MD5) Previous issue date: 2014-03-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) naturally infects sweet pepper and tomato plants, leading to severe losses since its first report in Brazil (Brasília, DF, 2002). Molecular and serological methods can be used to detect the pathogen. Serological methods for viral detection require the use of a high quality antiserum, offering good sensitivity and specificity. Traditionally, purified viral particles are used as immunogens. However, the purification process is very laborious and the final preparation may have unsatisfactory purity and/or concentration. Thus, the aim of this work was to produce a polyclonal antiserum against the recombinant capsid protein (CP) of PepYMV to allow its use both for diagnosis and for studies of the interaction of the PepYMV CP with other viral proteins and host factors. The coding sequence of the capsid protein gene of PepYMV was cloned into an expression vector (pRSET-A) and transformed into Escherichia coli strain BL21::DE3 for in vitro expression. The recombinant protein, fused to a histidine tag, was purified under denaturing conditions by affinity chromatography using a Ni-NTA column. The purified recombinant protein was dialyzed under renaturing conditions. Its integrity and identity were confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometer analyses. New Zealand rabbits were immunized with increasing amounts of the recombinant protein. The sensitivity and specificity of the antisera were analyzed by Western blot and indirect ELISA assays. The antisera raised against the recombinant CP showed good specificity and sensibility, proving to be a reliable tool for the detection of PepYMV. / O Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), agente causal do mosaico amarelo do pimentão e do tomateiro, desde seu primeiro relato no Brasil no ano de 2002 em Brasília, DF, vem se disseminando em regiões produtoras de pimentão e tomate causando perdas substanciais ao produtores dessas culturas. Para identificação dessa enfermidade algumas ferramentas são utilizadas, dentre elas, podemos destacar os métodos moleculares e sorológicos, sendo estes últimos mais utilizados por apresentarem alta especificidade e sensibilidade, além de possuir um custo relativamente baixo. Para a produção de anti-soro, tradicionalmente, utilizam-se partículas virais concentradas como imunógenos. No entanto, o processo de purificação é muito trabalhoso e pode apresentar pureza e concentrações insatisfatórias. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi produzir um anti-soro policlonal, a partir da proteína capsidial recombinante do PepYMV, que permita sua utilização tanto para diagnose quanto para estudos de interação da proteína capsidial do PepYMV com outras proteínas virais e fatores do hospedeiro. A sequência do gene da proteína capsidial do PepYMV foi clonada em vetor de expressão (pRSET-A) e transformada em Escherichia coli, linhagem BL21::DE3, para expressão in vitro. A proteína expressa fusionada a uma cauda de histidina foi purificada sob condições desnaturantes por cromatografia de afinidade em coluna de resina Ni-NTA. Em seguida a proteína purificada foi dialisada sob condições renaturantes e sua integridade e identidade foram confirmadas por gel de poliacrilamida a 12% e análise de espectrometria de massa. Dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com quantidades crescentes da proteína recombinante dialisada adicionados do adjuvante de Freud incompleto na proporção 1:1. A sensibilidade e a especificidade do anti-soro foram testados por Western blot e ELISA indireto. O anti-soro produzido apresentou boa especificidade e sensibilidade, provando ser uma ferramenta confiável para a diagnose do PepYMV.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo .pdf: 1092167 bytes, checksum: 8586b9a4bcc728e0319bbbdb012ca136 (MD5) Previous issue date: 2012-07-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Viruses are organisms with small genomes of simple organization, which coding about 3 to encode 10 viral proteins. The success of the infection depends on the manipulation of the cell by the virus, by means of complex interactions occurring between viral factors and host factors. The induced changes by virus infection include cell morphology changes, cell cycle changes and alterations in gene expression, among others. Understanding the processes that favor viral infection necessarily involves the study of virus-host interactions. In order to better understand the processes related to infection by tomato potyvirus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) a subtractive library was built 72 hours after infection. Several genes were identified as induced or repressed by viral infection. Among the induced genes, is the gene encoding the Translationally controlled tumor protein (TCTP). TCTP protein is highly conserved in all eukaryotes. Its functions are related to growth control and cell cycle, anti-apoptotic activity, and response to different biotic and abiotic stresses. The involvement of this protein in infection PepYMV has not been established, but studies in a strain of transgenic tomato plants silenced for TCTP showed that the silenced plants have a lower accumulation of PepYMV, indicating that TCTP promotes viral infection. In this study, we sought to advance the understanding of mechanisms involving TCTP in the process of infection by PepYMV. N. benthamiana plants silenced by VIGS TCTP were used to study the effect of silencing in viral infection, and the silenced plants accumulate fewer viruses in early stages of virus infection. Individual expression of viral proteins in N. benthamiana identified P3 and CP as capable of inducing TCTP expression at similar levels to those induced during PepYMV infection, and expression of NIb reduced expression of TCTP. The verification of direct interactions occurrence between viral proteins and TCTP by double-hybrid assay showed that TCTP not interact separately with any of the proteins of viral origin. Purification of proteins of health and infected N. benthamiana plants by affinity with TCTP identified several proteins that putativaly interacts with TCTP. As in two hybrid assay, interactions involving PepYMV proteins were not detected. These results sugests that TCTP actuation must involve the formation of protein complexes involving viral and plant proteins or contribute indirectly to PepYMV infection, without involving direct interactions between TCTP and viral proteins. / Os vírus são organismos com genomas pequenos, de organização simples, que codificam em média 3 a 10 proteínas. O sucesso da infecção depende da manipulação da célula pelo vírus, por meio de interações complexas que ocorrem entre fatores virais e fatores do hospedeiro. As modificações induzidas na célula incluem alterações morfológicas, alteração do ciclo celular e na expressão gênica, entre outras. A compreensão dos processos que favorecem a infecção viral passa necessariamente pelo estudo de interações vírus-hospedeiro. No intuito de compreender melhor os processos relacionados à infecção de tomateiros pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) uma biblioteca subtrativa foi construída 72 horas após a infecção. Diversos genes cuja expressão foi alterada pela infecção foram identificados. Dentre os genes induzidos, se encontra o gene que codifica a Translationally controlled tumor protein (TCTP). A proteína TCTP é altamente conservada em todos os eucariotos. Suas funções estão relacionadas a controle do crescimento e ciclo celular, atividade anti-apoptótica, e resposta a diferentes tipos de estresses abióticos e bióticos. O envolvimento desta proteína na infecção pelo PepYMV ainda não foi estabelecido, porém estudos em uma linhagem de tomateiro transgênica silenciadas para a TCTP, mostraram que as plantas silenciadas apresentam um menor acúmulo de PepYMV, indicando que a TCTP favorece a infecção por este vírus. Neste trabalho, buscou-se avançar na compreensão dos mecanismos que envolvem a TCTP no processo de infecção pelo PepYMV. Plantas de Nicotiana benthamiana silenciadas para TCTP por VIGS (Virus Induced Gene Silence) foram utilizadas para estudar o efeito do silenciamento na infecção viral, sendo que as plantas silenciadas acumularam menos vírus no início da infecção. A expressão individual das proteínas de origem viral em N. benthamiana identificou a P3 e a CP como capazes de induzir a expressão de TCTP em níveis semelhantes aos observados durante a infecção pelo PepYMV, sendo que a expressão da proteína NIb reduziu a expressão de TCTP. A verificação da ocorrência de interações diretas entre a TCTP e as proteínas virais, por ensaio de duplo híbrido, mostrou que a TCTP não interage separadamente com as proteínas de origem viral. A purificação de proteínas de plantas de N. benthamiana, sadias e infectadas, por afinidade com a TCTP identificou diversas proteínas que possivelmente 7 interagem com a TCTP. Assim como no ensaio de duplo híbrido, a interação com proteínas virais não foi detectada. Estes resultados sugerem que o papel da TCTP deve envolver a formação de complexos proteicos entre proteínas virais e da planta, ou favorecer a infecção de forma indireta.