Submitted by Rodnei Dennis Rossoni (rodnei.rossoni@fosjc.unesp.br) on 2017-12-11T11:19:52Z No. of bitstreams: 1 Tese_Pronta.pdf: 4361864 bytes, checksum: 4e8e22ae0f0744e73ce578cec2fbcce4 (MD5) / Submitted by Rodnei Dennis Rossoni (rodnei.rossoni@fosjc.unesp.br) on 2017-12-11T18:47:11Z No. of bitstreams: 1 Tese_Pronta.pdf: 4361864 bytes, checksum: 4e8e22ae0f0744e73ce578cec2fbcce4 (MD5) / Submitted by Rodnei Dennis Rossoni (rodnei.rossoni@fosjc.unesp.br) on 2017-12-14T11:25:03Z No. of bitstreams: 1 Tese_Pronta.pdf: 4361864 bytes, checksum: 4e8e22ae0f0744e73ce578cec2fbcce4 (MD5) / Submitted by Rodnei Dennis Rossoni (rodnei.rossoni@fosjc.unesp.br) on 2017-12-14T13:50:32Z No. of bitstreams: 1 Tese_Pronta.pdf: 4361864 bytes, checksum: 4e8e22ae0f0744e73ce578cec2fbcce4 (MD5) / Approved for entry into archive by Silvana Alvarez null (silvana@ict.unesp.br) on 2017-12-18T15:12:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rossoni_rd_dr_sjc.pdf: 4361864 bytes, checksum: 4e8e22ae0f0744e73ce578cec2fbcce4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-18T15:12:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rossoni_rd_dr_sjc.pdf: 4361864 bytes, checksum: 4e8e22ae0f0744e73ce578cec2fbcce4 (MD5) Previous issue date: 2017-12-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O estudo da atividade inibitória de Lactobacillus pode contribuir na descoberta de novas estratégias terapêuticas nas infecções por Candida. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi isolar e identificar Lactobacillus da cavidade bucal de indivíduos livres de cárie e avaliar seu potencial de inibição de C. albicans por meio de estudos in vitro e in vivo. Primeiramente, foram avaliados os efeitos de 30 isolados clínicos de Lactobacillus sobre o número de células viáveis (UFC) em biofilme de C. albicans e sobre a formação de hifas. Os isolados que obtiveram os maiores efeitos inibitórios sobre C. albicans foram selecionados para os testes de determinação da biomassa total dos biofilmes pela absorbância do cristal violeta, análise da arquitetura dos biofilmes por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e quantificação da expressão de genes de C. albicans (ALS3, HWP1, EFG1 e CPH1) por qPCR. Esses isolados também foram submetidos a estudos in vivo usando os modelos de Galleria mellonella e Caenorhabditis elegans. Para o estudo em G. mellonella, a infecção experimental foi avaliada pela curva de sobrevivência, quantificação da carga fúngica na hemolinfa, densidade hemocitária, quantificação da expressão gênica de peptídeos antifúngicos (Gallerymicina e Galiomicina) e monitoramento da infecção de C. albicans por análise de bioluminescência. No modelo de C. elegans, a infecção foi avaliada por meio dos ensaios de curva de sobrevivência e estudo da filamentação de C. albicans. Os resultados dos ensaios in vitro demonstraram que L. paracasei 28.4, L. rhamnosus 5.2 e L. fermentum 20.4 foram as cepas com maior atividade antimicrobiana sobre os biofilmes de C. albicans. Nessas cepas, todos os genes analisados foram regulados negativamente na associação com Lactobacillus quando comparados com o grupo controle. No estudo in vivo, a injeção de L. paracasei 28.4 em G. mellonella infectadas com C. albicans aumentou a sobrevida das larvas, o número de hemócitos e a expressão de peptídeos antifúngicos, reduzindo assim a UFC de C. albicans. Em C. elegans, L. paracasei 28.4 também foi capaz de aumentar a sobrevida dos vermes infectados com C. albicans e reduzir a filamentação. Conclui-se que L. fermentum 20.4, L. paracasei 28.4 e L. rhamnosus 5.2 tem potencial para serem usados como probióticos na cavidade bucal devido sua ação anti-biofilme e sua regulação negativa dos genes de virulência de C. albicans. L. paracasei 28.4 foi capaz de prolongar a sobrevida nos dois modelos experimentais infectados com C. albicans por apresentarem ação antifúngica e imunomodulatória. / The study of the antifungal activity of Lactobacillus may contribute to the discovery of new therapeutic strategies for Candida infections. In this context, the objective of this study was to isolate and identify Lactobacillus from the oral cavity of caries-free subjects and to evaluate its effects through in vitro and in vivo studies. First, the effects of 30 clinical isolates of Lactobacillus on the number of viable cells (CFU) in biofilms of C. albicans and on hyphae formation were evaluated. The isolates that obtained the highest inhibitory effects on C. albicans were selected for biofilm biomass determination by violet crystal absorbance, analysis of biofilm architecture by scanning electron microscopy (SEM) and quantification of the expression of C. albicans (ALS3, HWP1, EFG1 and CPH1) by real time PCR. These isolates were also submitted to in vivo studies using the Galleria mellonella and Caenorhabditis elegans models. For the study in the model of Galleria mellonella, the experimental infection was evaluated by the survival curve, quantification of the fungal load in the hemolymph, hemocitary density, the gene expression of antifungal peptides (Gallerymicin and Galiomicin) and monitoring of C. albicans infection by bioluminescence analysis. In the Caenorhabditis elegans model, the infection was evaluated by the survival curve assays and the study of C. albicans filamentation. The results of in vitro tests demonstrated that L. paracasei 28.4, L. rhamnosus 5.2 and L. fermentum 20.4 were the strains with the highest antimicrobial activity on the biofilms of C. albicans. In these strains, all analyzed genes were negatively regulated in association with Lactobacillus when compared to the control group. In the in vivo study, the injection of L. paracasei 28.4 into the G. mellonella increased survival of the larvae, the number of hemocytes and the expression of antifungal peptides, thus reducing the CFU of C. albicans. In C. elegans, L. paracasei 28.4 was also able to increase the survival of worms infected with C. albicans and reduce the filamentation. We conclude that L. fermentum 20.4, L. paracasei 28.4 and L. rhamnosus 5.2 have potential to be used as probiotics in the oral cavity due to their anti-biofilm action and their negative regulation of virulence genes of C. albicans. L. paracasei 28.4 was able to prolong survival of both experimental models infected with C. albicans for having antifungal and immunomodulatory action. / 13/25181-8 / 14/12458-4

Submitted by Morgana Andrade (morgana.andrade@ufes.br) on 2016-04-11T20:49:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação_Jean.pdf: 1797995 bytes, checksum: b603b8c2f1c6e995111923a3d87928d5 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-05-16T14:48:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação_Jean.pdf: 1797995 bytes, checksum: b603b8c2f1c6e995111923a3d87928d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-16T14:48:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação_Jean.pdf: 1797995 bytes, checksum: b603b8c2f1c6e995111923a3d87928d5 (MD5) / Financiadora de Estudos e Projetos - FINEP, CNPq, CAPES, FAPES / A meleira, causada pelo Papaya meleira virus (PMeV), é uma doença importante no Brasil e no México devido as grandes perdas econômicas que ela causa. Estudos para avaliar a interação patógeno-hospedeiro em nível histológico são fundamentais para compreender os mecanismos responsáveis pela resistência natural das plantas. Neste estudo foram coletadas folhas de mamoeiros saudáveis e sintomáticos para meleira e observou-se a topografia e a dureza da parede celular dessas plantas por microscopia de força atômica (AFM). As imagens em duas dimensões obtidas a partir de diferentes áreas da parede celular mostraram que as paredes celulares das plantas saudáveis são mais uniformes do que as paredes de plantas doentes. As plantas saudáveis também apresentaram características constitutivas da parede celular mais elevadas do que as de plantas doentes e a média da força de adesão máxima observada foi maior em plantas saudáveis do que em plantas doentes. Estes resultados indicam que o PMeV promove alterações nas paredes das células, tornando-as mais frágeis e suscetíveis à ruptura. Estas alterações, associadas ao aumento da captação de água e aumento da pressão interna dos laticíferos, provocam o rompimento celular que leva à exsudação espontânea do látex e facilita a disseminação de PMeV para outros laticíferos. Os resultados deste trabalho fornecem novas percepções sobre a interação mamoeiro-PMeV que podem revelar-se úteis no que se refere a entender e controlar a meleira do mamoeiro. / Papaya sticky disease, caused by Papaya meleira virus (PMeV), is an important papaya disease in Brasil and Mexico due the severe economic losses it causes. Studies to assess the pathogen-host interaction at a histological are fundamental in order to understand the mechanisms that underlie natural resistance. In this study we collected leaves of healthy and symptomatic papaya sticky diseased plants and observed the topography and mechanical properties of plant cell walls by atomic force microscopy (AFM). Two-dimensional images obtained from different areas of the cell wall showed that the cell walls of healthy plants are smoother than the walls of sticky diseased plants. Also healthy plants displayed higher constitutive characteristics of the cell wall than diseased plants and the average maximum adhesion force was higher on healthy plants than on diseased plants. PMeV promotes changes on cell walls, making them more fragile and susceptible to breakage. These changes, associated with increased water uptake and internal pressure of laticifers causes cell disruption that leads to spontaneous exudation of latex and facilitates the spread of PMeV to other laticifers. The results of this work provide new insights on the interaction papaya-PMeV which could prove helpful when trying to understand and control the papaya sticky disease.

As Escherichia coli produtoras da toxina Shiga (STEC) são importantes patógenos humanos, causando desde diarréias até a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Há diversos sorotipos associados a SHU, tais como O157:H7 e O113:H21. No Brasil o sorotipo O113:H21 ainda não aparece associado a SHU, embora seja frequentemente isolado de carcaças e fezes bovinas. Nosso grupo já investigou comparativamente as redes de coexpressão gênica (RCG) de STEC EH41 (associado à SHU) e Ec472/01 (isolado de fezes bovinas). A análise comparativa do perfil transcricional de EH41 e Ec472/01 revelou que somente EH41 expressa um conjunto de genes que inclui o regulador transcricional dicA. A maioria destes genes está situada em um único módulo transcricional e podem estar associados a fatores de virulência. Assim, este trabalho centrou-se numa abordagem de biologia de sistemas, integrando análises genômica e fenotípica da resposta de enterócitos Caco-2 à EH41 e Ec472/01. A análise genômica baseou-se no estudo temporal de RCG para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade desses dois isolados. As alterações fenotípicas ocorridas nas células Caco-2 ao longo da exposição a cada um dos isolados de STEC foram visualizadas através de MEV. A análise genômica mostrou que o mecanismo molecular da resposta de Caco-2 durante a interação com EH41 ou Ec472/01 é claramente distinto. Nas redes do grupo Caco-2/EH41 as alterações topológicas incluíram a perda do status scale free e a sua recuperação, com o estabelecimento de uma nova hierarquia de genes na rede. Esses resultados se enquadram no modelo de redes para transição saúde-doença: a nova rede representa a resposta adaptativa da célula ao patógeno, o que não significa um retorno à normalidade. Já no grupo Caco-2/Ec472 as redes, após a perda do status scale free, não recuperam esse status até o final do período estudado, o que sugere um estado de transição mais prolongado para reorganização da hierarquia da rede. Mais ainda, através da caracterização dos módulos transcricionais, foi possível compreender dinamicamente os mecanismos moleculares envolvidos na resposta diferencial de Caco-2 aos dois isolados aqui estudados. STEC EH41 induz rapidamente a resposta inflamatória e apoptótica a partir da primeira hora de interação enterócito-bactéria. Por outro lado, células Caco-2 em contato com Ec472/01 ativam, a partir de uma hora, a fagocitose e, a partir da segunda hora, expressam moduladores da homeostase imune. A análise fenotípica das células Caco-2 mostrou, de forma nítida, uma maior destruição dos microvilos dos enterócitos em contato com EH41 do que com Ec472/01. Integrando os resultados genômicos e fenotípicos pode-se concluir que EH41 induz em Caco-2 - em comparação com Ec472/01 - maiores e mais rápidas alterações na expressão gênica global, além de uma resposta inflamatória e apoptótica excessiva, levando assim a alterações morfológicas mais pronunciadas nas células Caco-2. Em seu conjunto, esses resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das STECs associadas à SHU. Assim, as perspectivas de desenvolvimento deste trabalho deverão incluir a investigação de fatores de virulência e vias moleculares envolvidas na indução das respostas imunes que podem conduzir à SHU / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O113:H21 strains are associated with human diarrhea and some of these strains may cause hemolytic uremic syndrome (HUS). In Brazil O113:H21 strains are commonly found in cattle but, so far, were not isolated from HUS patients. Previously, our group conducted comparative gene co-expression network (GCN) analyses of two O113:H21 STEC strains: EH41, isolated from a HUS patient in Australia, and Ec472/01, isolated from bovine feces in Brazil. Differential transcriptome profiles for EH41 and Ec472/01 revealed a gene set exclusively expressed in EH41, which includes the dicA putative virulence factor regulator. GCN analysis showed that this set of genes constitutes an EH41 specific transcriptional module which may be associated to virulence factors. Therefore, in the present work a system biology approach was conducted to investigate the differential Caco-2 response - genomic and phenotypic - to EH41 (Caco-2/EH41) or to Ec472/01 (Caco- 2/Ec472) along enterocyte-bacteria interaction. The genomic analysis was based on temporal GCN data in order to gain a better understanding on the molecular mechanisms underlying the capacity to cause HUS. The phenotypic alterations in Caco-2 during enterocyte-bacteria interaction were assessed by scanning electronic microscopy (SEM). The genomic analysis showed that the molecular mechanism of Caco-2 response to EH41 or to Ec472/01 during enterocyte-bacteria interaction is clearly different. The GCN topological analyses for Caco-2/EH41 group revealed loss of the scale-free status after one hour of interaction, persistence of this condition along the second hour and establishment of a new gene hierarchy thereafter. These events resemble the network mechanism of health-disease transition. The new established network represents an adaptive cell response to the pathogen and not the return to a \"normal\" state. Conversely, the networks for Caco-2/Ec472 group showed a slow and progressive loss of the scale-free status without its restoration at the end of the time interval here studied. Through transcriptional module characterization it was possible to reveal the dynamic of the molecular mechanism involved in the Caco-2 differential responses to the STEC isolates. EH41 induces a rapid inflammatory and apoptotic response just after the first hour of enterocyte-bacteria interaction. Instead, the Caco-2 response to Ec472/01 is characterized by phagocytosis activation at the first hour, followed by the expression of immune response modulators after the second hour. SEM phenotypic analysis of Caco-2 cells along enterocyte-bacteria interaction showed more intense microvilli destruction in cells exposed to EH41, when compared to cells exposed to Ec472/01. The integration of genomic and phenotypic data allowed us to conclude that EH41, comparatively to Ec472/01, induces greater and precocious global gene expression alterations in Caco-2, what is related to excessive inflammatory and apoptotic responses. These responses are associated with the pronounced morphological alterations observed by SEM in Caco-2 cells exposed to EH41. Altogether, these results contribute for a better understanding of the molecular mechanism involved in STEC pathogenicity associated to HUS. Therefore, the future perspectives for the development of the present work should include the investigation of virulence factors and molecular pathways involved in the induction of immune responses leading to HUS

As Escherichia coli produtoras da toxina Shiga (STEC) são importantes patógenos humanos, causando desde diarréias até a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Há diversos sorotipos associados a SHU, tais como O157:H7 e O113:H21. No Brasil o sorotipo O113:H21 ainda não aparece associado a SHU, embora seja frequentemente isolado de carcaças e fezes bovinas. Nosso grupo já investigou comparativamente as redes de coexpressão gênica (RCG) de STEC EH41 (associado à SHU) e Ec472/01 (isolado de fezes bovinas). A análise comparativa do perfil transcricional de EH41 e Ec472/01 revelou que somente EH41 expressa um conjunto de genes que inclui o regulador transcricional dicA. A maioria destes genes está situada em um único módulo transcricional e podem estar associados a fatores de virulência. Assim, este trabalho centrou-se numa abordagem de biologia de sistemas, integrando análises genômica e fenotípica da resposta de enterócitos Caco-2 à EH41 e Ec472/01. A análise genômica baseou-se no estudo temporal de RCG para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade desses dois isolados. As alterações fenotípicas ocorridas nas células Caco-2 ao longo da exposição a cada um dos isolados de STEC foram visualizadas através de MEV. A análise genômica mostrou que o mecanismo molecular da resposta de Caco-2 durante a interação com EH41 ou Ec472/01 é claramente distinto. Nas redes do grupo Caco-2/EH41 as alterações topológicas incluíram a perda do status scale free e a sua recuperação, com o estabelecimento de uma nova hierarquia de genes na rede. Esses resultados se enquadram no modelo de redes para transição saúde-doença: a nova rede representa a resposta adaptativa da célula ao patógeno, o que não significa um retorno à normalidade. Já no grupo Caco-2/Ec472 as redes, após a perda do status scale free, não recuperam esse status até o final do período estudado, o que sugere um estado de transição mais prolongado para reorganização da hierarquia da rede. Mais ainda, através da caracterização dos módulos transcricionais, foi possível compreender dinamicamente os mecanismos moleculares envolvidos na resposta diferencial de Caco-2 aos dois isolados aqui estudados. STEC EH41 induz rapidamente a resposta inflamatória e apoptótica a partir da primeira hora de interação enterócito-bactéria. Por outro lado, células Caco-2 em contato com Ec472/01 ativam, a partir de uma hora, a fagocitose e, a partir da segunda hora, expressam moduladores da homeostase imune. A análise fenotípica das células Caco-2 mostrou, de forma nítida, uma maior destruição dos microvilos dos enterócitos em contato com EH41 do que com Ec472/01. Integrando os resultados genômicos e fenotípicos pode-se concluir que EH41 induz em Caco-2 - em comparação com Ec472/01 - maiores e mais rápidas alterações na expressão gênica global, além de uma resposta inflamatória e apoptótica excessiva, levando assim a alterações morfológicas mais pronunciadas nas células Caco-2. Em seu conjunto, esses resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das STECs associadas à SHU. Assim, as perspectivas de desenvolvimento deste trabalho deverão incluir a investigação de fatores de virulência e vias moleculares envolvidas na indução das respostas imunes que podem conduzir à SHU / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O113:H21 strains are associated with human diarrhea and some of these strains may cause hemolytic uremic syndrome (HUS). In Brazil O113:H21 strains are commonly found in cattle but, so far, were not isolated from HUS patients. Previously, our group conducted comparative gene co-expression network (GCN) analyses of two O113:H21 STEC strains: EH41, isolated from a HUS patient in Australia, and Ec472/01, isolated from bovine feces in Brazil. Differential transcriptome profiles for EH41 and Ec472/01 revealed a gene set exclusively expressed in EH41, which includes the dicA putative virulence factor regulator. GCN analysis showed that this set of genes constitutes an EH41 specific transcriptional module which may be associated to virulence factors. Therefore, in the present work a system biology approach was conducted to investigate the differential Caco-2 response - genomic and phenotypic - to EH41 (Caco-2/EH41) or to Ec472/01 (Caco- 2/Ec472) along enterocyte-bacteria interaction. The genomic analysis was based on temporal GCN data in order to gain a better understanding on the molecular mechanisms underlying the capacity to cause HUS. The phenotypic alterations in Caco-2 during enterocyte-bacteria interaction were assessed by scanning electronic microscopy (SEM). The genomic analysis showed that the molecular mechanism of Caco-2 response to EH41 or to Ec472/01 during enterocyte-bacteria interaction is clearly different. The GCN topological analyses for Caco-2/EH41 group revealed loss of the scale-free status after one hour of interaction, persistence of this condition along the second hour and establishment of a new gene hierarchy thereafter. These events resemble the network mechanism of health-disease transition. The new established network represents an adaptive cell response to the pathogen and not the return to a \"normal\" state. Conversely, the networks for Caco-2/Ec472 group showed a slow and progressive loss of the scale-free status without its restoration at the end of the time interval here studied. Through transcriptional module characterization it was possible to reveal the dynamic of the molecular mechanism involved in the Caco-2 differential responses to the STEC isolates. EH41 induces a rapid inflammatory and apoptotic response just after the first hour of enterocyte-bacteria interaction. Instead, the Caco-2 response to Ec472/01 is characterized by phagocytosis activation at the first hour, followed by the expression of immune response modulators after the second hour. SEM phenotypic analysis of Caco-2 cells along enterocyte-bacteria interaction showed more intense microvilli destruction in cells exposed to EH41, when compared to cells exposed to Ec472/01. The integration of genomic and phenotypic data allowed us to conclude that EH41, comparatively to Ec472/01, induces greater and precocious global gene expression alterations in Caco-2, what is related to excessive inflammatory and apoptotic responses. These responses are associated with the pronounced morphological alterations observed by SEM in Caco-2 cells exposed to EH41. Altogether, these results contribute for a better understanding of the molecular mechanism involved in STEC pathogenicity associated to HUS. Therefore, the future perspectives for the development of the present work should include the investigation of virulence factors and molecular pathways involved in the induction of immune responses leading to HUS