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Une représentation en trois dimensions de l'interface entre l'enveloppe nucléaire et la chromatine / A three-dimensional view of the interface between nuclear envelope and chromatinSamson, Camille 04 April 2018 (has links)
Le noyau est un organite caractéristique des cellules eucaryotes et les propriétés mécaniques de ce dernier jouent un rôle essentiel dans le comportement de la cellule, notamment sa motilité, sa polarité et sa survie. Le noyau est entouré par une enveloppe comprenant une membrane interne et une membrane externe, ainsi que de nombreuses protéines. Mes objectifs de thèse étaient de comprendre des mécanismes moléculaires déficients dans deux types de maladies génétiques causées par des mutations dans les lamines: la dystrophie musculaire d’Emery-Dreifuss et les syndromes de type progéroïde.Dans un premier temps, nous avons montré que l’émerine s’auto-associe in vitro et en cellules (Herrada et al. ACS Chem. Biol. 2015). J’ai ensuite étudié la structure des oligomères d’émerine, déterminé le fragment protéique minimal nécessaire à la formation de ces oligomères et décrit l’impact de mutations de l’émerine, causant une dystrophie musculaire d’Emery-Dreifuss, sur son auto-assemblage (Samson et al. Biomol NMR Assign. 2016 ; Samson et al. FEBS J. 2016). Puis, j’ai montré que seule cette forme auto-assemblée de l’émerine est capable d’interagir avec la lamine A et que la phosphorylation de l’émerine par la kinase Src, observée suite à un stress mécanique, régule cette interaction entre l’enveloppe nucléaire et le nucléosquelette.Pour finir, j’ai montré que la forme monomérique de l’émerine est capable de former un complexe ternaire avec BAF et la lamine A. Après avoir mesuré les affinités protéine-protéine au sein de ce complexe, identifié les fragments minimaux des différentes protéines permettant de former ce complexe et mis au point un protocole robuste de purification de ce complexe, j’ai pu obtenir des cristaux de ce complexe dans plusieurs conditions. Par la suite, nous avons pu résoudre la structure de ce complexe par remplacement moléculaire avec une résolution de 2 Å. Enfin, j'ai montré que les mutations dans les lamines de type A provoquant des syndromes de type progéroïde pouvaient altérer l'interaction avec BAF in vitro, et nos collaborateurs, l'équipe du Dr B. Buendia (Paris Diderot), ont montré que ces mêmes mutations induisaient une diminution significative de la proximité entre la lamine A et BAF dans les cellules HeLa. Un article, où je suis premier auteur, vient d’être soumis au journal NSMB. / The nucleus is an organelle characteristic of eukaryotic cells and its mechanical properties play an essential role in the behavior of the cell, in particular its motility, polarity and survival. It is surrounded by an envelope comprising an inner membrane and an outer membrane, as well as a large number of proteins. These proteins are either anchored at the nuclear membrane, as emerin, or form a filament meshwork lining the inner nuclear membrane, as lamins. My thesis objectives were to understand molecular mechanisms deficient in two types of genetic diseases caused by mutations in inner nuclear envelope proteins: Emery-Dreifuss muscular dystrophy, associated to mutations in emerin and A-type lamins, and progeroid syndromes caused by mutations in A-type lamins.First, we showed that the emerin protein self-assembles in vitro and in cells (Herrada, Samson et al., ACS Chem. Biol., 2015). I then studied the structure of emerin oligomers, determined the minimal protein fragment necessary for the formation of these oligomers, identify residues forming the structural core of these oligomers by solid-state NMR in collaboration with the group of Prof A. Lange (FMP Berlin), and described the impact of emerin mutations causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy on emerin self-assembly (Samson et al., Biomol. NMR Assign. 2016, Samson et al., FEBS J. 2017). Then, I observed, mainly using solution-state NMR, that only the self-assembled form of emerin is able to interact with A-type lamin tail, and that mutants causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy and unable to self-assemble are also defective in A-type lamin binding. I also obtained preliminary data showing that phosphorylation of emerin by the Src kinase, observed after a mechanical stress in purified nuclei, regulates the interaction between self-assembled emerin and A-type lamins.Finally, I showed that the monomeric form of emerin is able to form a ternary complex with A-type lamin tail through the chromatin-associated protein Barrier-to-Autointegration Factor (BAF). After having measured the protein-protein affinities within this complex, identified the minimal protein fragments involved in the complex and developed a robust protocol for purification of this complex, I was able to obtain crystals under several conditions. Subsequently, I solved the 3D structure of this complex by molecular replacement at a resolution of 2 Å. Finally, I showed that mutations in A-type lamins causing autosomal recessive progeroid syndromes impair interaction with BAF in vitro, and our collaborators at Univ. Paris Diderot, the team of Dr B. Buendia, showed that these same mutations induce a significant decrease in the proximity between lamin A and BAF in HeLa cells. An article with me as a first author is in preparation that reports all these new data.
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Imagerie quantitative de l'assemblage de la NADPH oxydase des phagocytes en cellules vivantes par des approches FRET-FLIM / Imaging the assembly of the phagocyte NADPH oxidase in live cells - a quantitative FRET-FLIM approachZiegler, Cornelia 14 March 2016 (has links)
La NADPH oxydase des phagocytes (NOX2) est responsable de la production d’anions superoxydes qui sont les précurseurs des autres formes réactives de l’oxygène. NOX2 est une enzyme majeure de la réponse immunitaire. Les dysfonctionnements de NOX2 sont associés à de nombreuses pathologies et donc il convient d’en comprendre les détails de la régulation. Cette oxydase est composée de cinq sous-unités : deux protéines membranaires, gp91phox et p22phox et 3 protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. D’après les études in vitro avec des protéines purifiées, les protéines cytosoliques sont supposées former un complexe ternaire qui se déplace à la membrane avec une petite protéine G, Rac, au moment l’activation.L’objectif de ce projet est de caractériser les interactions spécifiques entre les sous-unités cytosoliques de NOX2 en cellules vivantes en utilisant le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) entre deux fluorophores, un donneur et un accepteur. Ici les fluorophores seront des protéines fluorescentes de la famille de la GFP. Elles sont fusionnées à deux sous-unités. L’efficacité du FRET dépend de la distance entre les fluorophores et permet ainsi de caractériser les interactions entre les protéines d’intérêt. Une méthode rapide d’identification des situations où le FRET est positif a été mise au point par cytométrie en flux. Des études détaillées et quantitatives ont ensuite été réalisées en utilisant l’imagerie de durée de fluorescence (FLIM) du donneur. Le FLIM, combiné à l’utilisation de donneurs présentant une durée de vie mono-exponentielle, permet de déterminer directement des efficacités de FRET apparentes et moléculaires, qui contiennent, toutes les deux, des informations qualitatives et quantitatives sur l’interaction et la structure des protéines impliquées. De ces données, il est possible d’extraire la fraction des donneurs interagissant avec un accepteur. Les informations obtenues à partir des données de FRET-FLIM permettent une meilleure compréhension de l’organisation et de la régulation de NOX2 tout en permettant une estimation des constantes de dissociation (Kd). Afin de confirmer ces résultats, des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence à deux couleurs (FCCS) ont été réalisées. Cette méthode complétement indépendante n’est pas basée sur la distance entre fluorophores comme le FRET mais sur leur co-diffusion à travers un petit volume d’observation dans le cytoplasme cellulaire.L’approche FRET-FLIM nous a tout d’abord permis d’observer les interactions entre hétéro-dimères formés de deux sous-unites différentes en cellules vivantes et d’exclure la formation d’homo-dimères entre deux sous-unités identiques. Etant donné la bonne précision des mesures de FLIM, nous avons pu comparer les informations structurales obtenues en cellules avec les données structurales issues d’études sur les protéines purifiées in vitro et nous avons constaté qu’elles sont en bon accord. Nous avons ensuite aligné les structures disponibles pour proposer un premier modèle 3D du complexe cytosolique de la NADPH oxydase au repos dans le cytosol cellulaire.Les fractions de protéines en interaction sont pour tous les hétéro-dimères autour de 20% ce qui n’est pas en accord avec l’hypothèse courante qui propose que toutes les sous-unités cytosoliques soient sous forme de complexe. Toutefois nos premiers résultats de FCCS confirment ce résultat extrait des données de FRET-FLIM. Nous proposons donc que la complexation des sous-unités cytosolique pourrait être impliquée dans la régulation de la NADPH oxydase. Des études complémentaires seront nécessaires pour valider cette nouvelle hypothèse. Les constantes de dissociation Kd estimées à partir de nos résultats sont micromolaires et donc un ordre de grandeur plus élevé que les valeurs nanomolaires déterminées in vitro. Des mesures plus détaillées de FCCS pourront compléter et valider ces résultats. / The phagocyte NADPH oxidase (NOX2) is a key enzyme of the immune system generating superoxide anions, which are precursors for other reactive oxygen species. Any dysfunctions of NOX2 are associated with a plethora of diseases and thus detailed knowledge about its regulation is needed. This oxidase is composed of five subunits, the membrane-bound gp91phox and p22phox and the cytosolic p47phox, p67phox, and p40phox. The latter are assumed to be in a ternary complex that translocates together with the small GTPase Rac to the membranous subunits during activation.Our aim was to discover and to characterize specific interactions of the cytosolic subunits of NOX2 in live cells using a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based approach: Since FRET depends on the distance between two fluorophores, it can be used to reveal protein-protein interactions non-invasively by studying fluorescent protein tagged subunits. To have a rapid method on hand to reveal specific interactions, a flow cytometer based FRET approach was developed. For more detailed studies, FRET was measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), because it allows a direct determination of the apparent and molecular FRET efficiency, which contains both qualitative and quantitative information about the interaction and the structure of the interacting proteins. Furthermore, the FRET-FLIM approach enables an estimation of the fraction of bound donor. This information itself is important for a better understanding of the organisation and regulation of the NOX2, but it is also necessary for the calculation of the dissociation constant Kd from the FRET-FLIM data. To confirm the findings obtained by FRET-FLIM fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) experiments were performed. This completely independent method is not based on distances like FRET but on the observation of the co diffusion of the fluorescently labelled samples when they move across a small observation volume inside the cells.The FRET-FLIM approach allowed us in a first step to discover heterodimeric interactions between all cytosolic subunits in live cells. Due to the good precision of the results, we were able to extract structural information about the interactions and to compare them with available structural data obtained from in vitro studies. The information from FRET-FLIM was coherent with in vitro data. We then aligned the available structures leading to the first 3D model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase in the resting state in live cells.Additionally, the bound fraction for all heterodimeric interactions derived by FRET-FLIM is around 20 %, which is in contrast to the general belief that all cytosolic subunits are bound in complex. The first FCCS results support our findings. Therefore, we believe that the complexation of the cytosolic subunits could be involved in the regulation of the NADPH oxidase and should be investigated further. The estimated Kd derived from the FRET-FLIM approach is in the low micomolar range, which is an order of a magnitude higher than the nanomolar range of in vitro studies.In conclusion, we showed that our quantitative FRET-FLIM approach is not only able to distinguish between specific and unspecific protein-protein interactions, but gives also information about the structural organisation of the interacting proteins. The high precision of the FRET-FLIM data allow the determination of the bound fraction and an estimation of the Kd in live cells. FCCS is a complementary method, which can verify these quantitative findings. However, it cannot replace FRET-FLIM completely as it does not give any structural information.With respect to the biological outcome of this project, we can propose for the first time a 3D-model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase covering the in vitro as well as the live cell situation. Additionally, the small bound fraction found here may raise new ideas on the regulation of this vital enzyme.
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Functional study of oil assembly pathway in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) fruits / Etude de l’assemblage des acides gras en huile chez le palmier à huile (Elaeis guineensis Jacq.)Yuan, Yijun 21 December 2016 (has links)
Le palmier à huile est la première culture oléagineuse, avec environ 40% de la production mondiale, et son fruit accumule deux huiles de composition très différente dans le mésocarpe et l’amande. Chez les plantes, les acides gras sont assemblés en huile dans le réticulum endoplasmique, ceci par la voie dite de Kennedy à laquelle s’ajoutent des mécanismes d’édition impliquant le métabolisme de la phosphatidylcholine. Nous avons utilisé les outils de la lipidomique pour analyser la variabilité au sein de différentes populations de palmier ainsi que pour caractériser l’accumulation d’huile durant le développement du mésocarpe et de l’amande. Puis, nous avons entrepris de tester, dans le système du double hybride de levure, les interactions entre toutes les enzymes de la voie de Kennedy et celles responsables des mécanismes d’édition, et mis en évidence 241 interactions, dont 132 sont fortes, 73 moyennes et 36 faibles. Ces résultats suggèrent que ces enzymes pourraient s’assembler en complexes supra-moléculaires susceptibles de former des métabolons. Certaines isoformes d’une même enzyme ont des profils d’interaction distincts, ce qui ouvre des perspectives pour de futures recherches. De plus, nous avons caractérisé, par expression fonctionnelle dans un mutant de levure dépourvu de TAG, une acyltransférase présumée (EgWSD1-like) ainsi que les trois formes majeures de diacylglycérol acyltransférases du mésocarpe. EgWSD1-like ne restaure que l’activité de synthèse d’esters de cire dans le mutant, tandis que les trois DGAT complémentent toutes la déficience en TAG du mutant, avec d’apparentes spécificités distinctes vis-à-vis des acides gras. / Oil palm is the highest oil-yielding crop-plant, accounting for approximately 40% of the total world vegetable oil production. The fruit accumulates oil, made of triacylglycerol (TAG) molecules, in both mesocarp and kernel with totally different fatty acid profiles. Fatty acids are assembled into oil through Kennedy pathway in the endoplasmic reticulum, which is complicated by editing processes involving phosphatidylcholine metabolism. To investigate oil assembly in oil palm, we use lipidomics as a tool to analyze different populations of palm to search for TAG structural diversity, and to further characterize changes in lipid content and composition in mesocarp and kernel during fruit ripening. We used yeast two-hybrid system (split ubiquitin) to test protein-protein interactions for almost all the enzymes (32) involved in oil assembly pathway, and we demonstrated 241 interactions, including 132 strong interactions, 73 medium interactions and 36 weak interactions. Our results suggest that all enzymes might assemble into one or several complexes that may form metabolons. In addition, different isoforms of enzymes showed distinct interaction profiles, providing hints for future studies. Moreover, we also characterized the in vivo function of a putative acyltransferase (designated EgWSD1-like) possibly involved in oil assembly and the three major diacylglycerol acyltransferase (DGAT) isoforms of palm mesocarp in the mutant yeast H1246, which is devoid of neutral lipid synthesis. EgWSD1-like only shows wax ester synthase activity in yeast, while three EgDGATs all can restore TAG biosynthesis in yeast with different substrate specificities.
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