Thèse de Doctorat en Sciences Vétérinaires Résumé Orientation: Médecine Vétérinaire Titre de la thèse en français: Contribution à létude fonctionnelle des dipeptidyl peptidases et de la métalloprotéase MEP3 sécrétées par Microsporum canis » Titre de la thèse en anglais: Contribution to the functional study of dipeptidyl peptidases and MEP3 metalloprotease secreted by Microsporum canis Candidat: Sandy Vermout Promoteur: Dr Bernard Mignon Co-promoteur: Prof. Bertrand Losson Département et Service: Département des Maladies Infectieuses et Parasitaires, service de Parasitologie et de Pathologie des Maladies Parasitaires Date de la défense publique: Composition du Jury: Description du sujet de recherche abordé: Les dermatophytes sont des champignons filamenteux responsables de mycoses superficielles contagieuses, souvent appelées « teignes », et couramment rencontrées tant en dermatologie humaine que vétérinaire. Parmi eux, Microsporum canis est lagent isolé dans la majorité des cas de dermatophytose chez le chat et le chien. Le chat peut être considéré comme le réservoir de cette infection, quil transmet à différentes espèces animales mais aussi à lhomme. La relation hôte-parasite caractérisant les dermatophytoses est particulière. Les dermatophytes se nourrissent aux dépens même de la barrière kératinisée destinée à la protection de lorganisme contre les agressions extérieures. Ils y restent confinés et sont généralement incapables de provoquer des infections profondes. Les dermatophytes sont des parasites obligatoires, qui affectent des hôtes immunocompétents. Par ailleurs, lexpression clinique des dermatophytoses est très variable selon lhôte et lespèce fongique impliqués : linfection peut être aiguë et rapidement éliminée, ou au contraire persistante et accompagnée de symptômes ténus. Par exemple, les lésions causées par M. canis sont généralement plus inflammatoires chez lhomme que chez le chat, son hôte naturel, et certains chats développent des teignes chroniques peu apparentes, jouant un rôle important dans la transmission de linfection. Les mécanismes qui président à ces divers aspects de la pathogenèse des dermatophytoses, et en particulier de linfection par M. canis, restent très mal connus. La majeure partie des recherches effectuées jusquà ce jour concernent les nombreuses protéases sécrétées par les dermatophytes et potentiellement impliquées dans le dégradation de la kératine, si bien quun grand nombre dentre elles ont été caractérisées dun point de vue moléculaire et enzymatique. Chez M. canis, deux familles de gènes, codant respectivement pour des subtilases (SUBs) et des métalloprotéases (MEPs), ont été isolées (Brouta et al., 2002 ; Descamps et al., 2002 ; Jousson et al., 2004). Parmi leurs membres, SUB3 et MEP3 sont considérées comme de probables facteurs de virulence ; en effet, elles sont induites sur un milieu à base de poils de chats, exprimées in vivo, fortement kératinolytiques, et également immunogènes (Descamps et al., 2003a ; Brouta et al., 2003). Le premier objectif de ce travail est dévaluer limmunogénicité et le pouvoir protecteur de MEP3 sous forme recombinante, dans le cadre dun essai de vaccination chez le cobaye. Le second est didentifier et de caractériser chez M. canis une autre classe de protéases, les dipeptidyl peptidases (DPPs). Les gènes correspondants seront isolés et séquencés, ce qui permettra létude de leur expression in vivo et sur différents milieux in vitro. Les protéines encodées seront produites sous forme recombinante, afin de pouvoir entamer lanalyse de leurs propriétés enzymatiques et immunologiques. Enfin, étant donné que chaque facteur étudié ne peut être formellement impliqué dans la virulence du champignon quen passant par la construction de souches déficientes, le troisième but de ce doctorat est de mettre au point chez M. canis une technique dinactivation génique par lintermédiaire dARNs en épingle à cheveux, en utilisant comme cibles des gènes codant pour des protéases sécrétées. Résultats: Un vaccin expérimental anti-M. canis a été préparé en associant MEP3, obtenue sous forme recombinante dans la levure Pichia pastoris (rMEP3), à ladjuvant de Freund. Le vaccin a été administré à des cobayes, par voie sous-cutanée, trois fois à 15 jours dintervalle. La vaccination a induit une forte réponse en anticorps spécifiques, ainsi quune réponse lymphoproliférative envers MEP3. Toutefois, cette dernière est apparue comme transitoire, puisquelle nétait plus significative au moment de lépreuve dinfection. Celle-ci a eu lieu 7 semaines après la dernière vaccination. Lévolution clinique de linfection, ainsi que la persistance du champignon, ont été suivies de façon régulière et exprimées sous forme de scores clinique et mycologique attribués à chaque animal. Aucune différence significative na pu être mise en évidence entre les scores des animaux vaccinés et non vaccinés. La réponse en anticorps induite par linfection chez les animaux non vaccinés sest révélée nettement plus faible que celle induite par la vaccination ; la réponse lymphoproliférative observée après linfection était dintensité comparable entre animaux vaccinés et non vaccinés. Le vaccin à base de rMEP3 na donc pas été protecteur, malgré linduction dune importante réponse humorale et le recrutement de cellules T spécifiques. Dans le but didentifier de nouveaux immunogènes potentiels, et de compléter dans le même temps les connaissances relatives aux protéases sécrétées par M. canis, les gènes codant pour des dipeptidyl peptidases ont été isolés. Il sagit dexoprotéases libérant des dipeptides au niveau de lextrémité N-terminale des protéines et réparties en différentes classes suivant la nature de ce dipeptide et suivant leur localisation cellulaire. Deux gènes uniques, codant respectivement pour une DPPIV et une DPPV, ont pu être isolés, séquencés et caractérisés. Ils encodent des protéases de la famille S9 de protéases à sérine, possédant un peptide signal de sécrétion mais pas de séquence pro-, et possédant des sites de glycosylation. Les deux protéases sont à 90% identiques à leurs paralogues isolés chez Trichophyton rubrum (Monod et al., 2005), un dermatophyte fréquemment isolé lors de dermatophytose humaine. Elles sont également homologues aux DPPs dAspergillus fumigatus, qui ont été proposées comme facteurs de virulence potentiels (Beauvais et al., 1997a,b). La DPPIV de M. canis présente également un degré dhomologie élevé avec la DPPIV de la bactérie pathogène Porphyromonas gingivalis, qui est un facteur de virulence avéré (Kumagai et al., 2003), ainsi quavec le marqueur mammalien CD26, qui est une molécule multifonctionnelle participant à de nombreux processus biologiques et immunologiques (Boonacker et Van Noorden, 2003). Grâce à une technique de RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) en temps réel, une importante augmentation de lexpression des deux DPPs de M. canis a été mise en évidence lorsque le champignon est cultivé sur des milieux constitués de protéines de matrice extracellulaire, parmi lesquelles la kératine. Lexpression des DPPs a également été détectée in vivo, chez le chat et le cobaye, par RT-PCR nichée. Les deux protéases ont été produites sous forme recombinante dans la levure P. pastoris, et y sont enzymatiquement actives. Les DPPs recombinantes apparaissent sous forme dune bande à 83 kDa (DPPV) et dun doublet à 95 et 98 kDa (DPPIV), dont respectivement 5 kDa et 9 ou 12 kDa de glycosylation. Elles clivent les substrats préférentiels de leurs sous-familles enzymatiques, ce qui correspond dans le cas de la DPPIV aux liens de type Proline-X ; cette spécificité est très rarement rencontrée parmi les protéases. Alors quaucune des deux DPPs de M. canis nest à elle seule kératinolytique, limplication de la DPPIV dans la digestion du réseau de kératine a été testée en utilisant le substrat Keratin Azure (Sigma) et des surnageants de cultures de M. canis montrant une forte activité kératinolytique. La préincubation de ces surnageants avec un inhibiteur spécifique de DPPIV na eu aucun effet sur le niveau de solubilisation du substrat kératinisé. Ce résultat indique que lintervention potentielle de la DPPIV dans cette digestion a lieu uniquement en aval de la digestion par les endoprotéases. Ensuite, dans le but dévaluer la capacité de la DPPV dinduire une réponse cutanée de type DTH (Delayed Type Hypersensitivity), sa forme recombinante a été utilisée dans le cadre de tests dintradermoréaction chez des cobayes précédemment infectés par M. canis. La réaction sest avérée négative, contrairement à ce qui a été observé dans le cas de la DPPV de Trichophyton tonsurans chez lhomme. Toutefois, cette dernière a été utilisée sous sa forme native. Enfin, une technique dinactivation génique via lARN a été mise au point chez M. canis, en utilisant comme cibles les gènes codant pour SUB3 et DPPIV. Il sagit de la première mise en uvre de cette méthodologie chez les dermatophytes. La technique employée dérive du phénomène d « interférence à lARN » (RNA interference, RNAi), qui a lieu à proprement parler dans les cellules animales, mais équivaut à des voies similaires chez les autres types dorganismes, y compris les champignons (Nakayashiki, 2005). Linterférence à lARN a pour élément déclencheur un ARN double brin, qui entraîne la destruction enzymatique des ARN messagers de séquence identique. Chez les champignons filamenteux, cette voie est activée efficacement par un ARN en épingle à cheveux dune taille de 500 à 1000 bp. Nous avons donc conçu deux constructions codant pour de telles épingles à cheveux, dont les séquences correspondent respectivement à un fragment des gènes SUB3 et DPPIV. M. canis a ensuite été transformé, séparément, par chacune de ces constructions. Pour chaque gène cible, les souches fongiques générées ont présenté des degrés dinhibition variables, évalués par RT-PCR en temps réel et par mesure de lactivité enzymatique des protéines cibles dans les surnageants de culture des transformants. Les taux dactivité enzymatique résiduelle et dARN messager obtenus étaient respectivement de 3,3% et 2% pour SUB3, et de 45,6% et 1,5% pour DPPIV. La distribution des taux dinhibition génique entre 0% et plus de 95% est compatible avec les résultats détudes similaires chez dautres champignons filamenteux. En outre, dans le cas de latténuation de lexpression de SUB3, une analyse par électrophorèse SDS-PAGE du surnageant de culture dune souche fortement inhibée montre la disparition de la bande correspondant à SUB3, mais aussi de celle correspondant à SUB4, ce qui indique que le seul fragment interférant utilisé est potentiellement capable dinhiber plusieurs gènes de la même famille. Conclusions et perspectives: Aucune atténuation des symptômes de linfection par M. canis, ni de linvasion par le champignon, nest obtenue en vaccinant des cobayes avec rMEP3 associée à ladjuvant de Freund selon le protocole utilisé. Des résultats similaires ont été obtenus avec deux autres protéases recombinantes, SUB3 chez M. canis (Descamps et al., 2003b) et la hsp60 de T. rubrum (Raska et al., 2004). Or, le succès dun vaccin résulte à la fois des propriétés intrinsèques du ou des immunogènes quil contient, et de la stimulation sélective par son adjuvant des acteurs efficaces de la réponse immune. Deux options sont donc offertes pour de nouvelles recherches dans le domaine de la vaccination anti-M. canis et anti-dermatophytes. La première consiste à poursuivre la dissection de la réponse immune spécifique en étudiant les propriétés immunogènes de composants particuliers. Même si lélimination naturelle dune infection fongique relève généralement dune réponse effectrice cellulaire de type Th1, cette perspective va bien au-delà de la recherche dun facteur activant des lymphocytes Th1, ou rappelant une réponse de type DTH au niveau cutané. En effet, il est actuellement démontré que des anticorps de spécificité bien choisie peuvent être totalement protecteurs contre une infection fongique (Casadevall et al., 2002 ; Cassone, 2007). En outre, il ne faut pas perdre de vue que lélément fongique de base déterminant une réponse immune adéquate est lépitope (Woodfolk et al., 2000). Le répertoire dépitopes générés à partir dune protéase recombinante peut dailleurs être modifié par rapport à son homologue native (Engelhard et al., 2006), comme cela est suspecté pour rDPPV chez M. canis. Ce phénomène peut engendrer une altération des propriétés immunogènes natives, mais a contrario, une protéase recombinante ainsi modifiée peut devenir un outil pour identifier des motifs antigéniques dintérêt. La seconde voie possible vers lélaboration dun vaccin sûr et pleinement efficace est lutilisation de nouveaux adjuvants orientant la réponse immune de la même façon quune infection naturelle protectrice. Chez A. fumigatus, des oligonucléotides CpG associés à une protéine recombinante ont permis de protéger des souris contre une aspergillose invasive, en stimulant plusieurs composants de la réponse cellulaire de type Th1 (Bozza et al., 2002). La vaccination à base de cellules dendritiques polarisées par un contact avec A. fumigatus sest également montrée prometteuse dans un modèle murin daspergillose invasive (Bozza et al., 2004), cette technique pouvant être assimilée à lemploi dun adjuvant de nouvelle génération. Il est bien entendu que ces deux voies de recherche ne sexcluent pas mutuellement, et quun travail mené dans les deux directions sera sans doute nécessaire pour atteindre le but recherché. Les DPPIV et V de M. canis ont été caractérisées au niveau moléculaire, et exprimées sous forme recombinante active. Leurs propriétés ainsi que celles de différentes protéases homologues laissent supposer quelles jouent un rôle universel dans la digestion de substrats protéiques complexes, y compris les structures kératinisées, mais quelles pourraient en plus avoir acquis une ou plusieurs fonctions spécialisées dans le cadre de la relation hôte-parasite. Lune de ces fonctions pourrait être la modulation de la réponse immune, par exemple via le clivage de cytokines ou de chémokines, étant donné notamment sa similitude avec la DPPIV mammalienne ou CD26. Parallèlement, les DPPs sont peut-être aussi des immunogènes importants. Enfin, la DPPIV sécrétée par M. canis pourrait intervenir dans ladhérence aux protéines de matrice extracellulaire, ou encore dans la dégradation des tissus via lactivation de protéases de lhôte, comme cela a été démontré chez P. gingivalis (Kumagai et al., 2005). Plusieurs perspectives sont donc ouvertes quant à linvestigation de la fonction des DPPs des dermatophytes, et certaines pourront êtres rencontrées grâce aux formes recombinantes de ces protéines. Cependant, pour elles comme pour tous les autres facteurs fongiques susceptibles de contribuer à la pathogenèse des dermatophytoses, la construction de souches déficientes est un passage obligé vers la démonstration formelle de cette contribution. Ceci est maintenant réalisable rapidement, au moyen de constructions exprimant des ARN double brin interférants, même si de nombreuses améliorations peuvent sans doute être apportées à cette technique. Les souches déficientes au niveau de SUB3 et potentiellement des autres SUBs, ainsi que celles déficientes au niveau de DPPIV, seront prochainement évaluées quant à leur comportement dans un modèle dépiderme félin reconstitué mis au point dans notre laboratoire (Tabart et al., sous presse). Références: BEAUVAIS A., MONOD M., DEBEAUPUIS J.-P., DIAQUIN M., KOBAYASHI H., LATGE J.-P. Biochemical and antigenic characterization of a new dipeptidyl-peptidase isolated from Aspergillus fumigatus. J. Biol. Chem., 1997a, 272, 6238-44. BEAUVAIS A., MONOD M., WYNIGER J., DEBEAUPUIS J.-P., GROUZMANN E., BRAKCH N., SVAB J., HOVANESSIAN A.G., LATGE J.-P. Dipeptidyl-peptidase IV secreted by Aspergillus fumigatus, a fungus pathogenic to humans. Infect. Immun., 1997b, 65, 3042-7. BOONACKER E., VAN NOORDEN C.J. The multifunctional or moonlighting protein CD26/DPPIV. Eur. J. Cell Biol., 2003, 82, 53-73. BOZZA S., GAZIANO R., LIPFORD G.B., MONTAGNOLI C., BACCI A., DI FRANCESCO P., KURUP V.P., WAGNER H., ROMANI L. Vaccination of mice against invasive aspergillosis with recombinant Aspergillus proteins and CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants. Microbes Infect., 2002, 4, 1281-90. BOZZA S., MONTAGNOLI C., GAZIANO R., ROSSI G., NKWANYUO G., BELLOCCHIO S., ROMANI L. Dendritic cell-based vaccination against opportunistic fungi. Vaccine, 2004, 22, 857-64. BROUTA F., DESCAMPS F., MONOD M., VERMOUT S., LOSSON B., MIGNON B. Secreted metalloprotease gene family of Microsporum canis. Infect. Immun., 2002, 70, 5676-83. BROUTA F., DESCAMPS F., VERMOUT S., MONOD M., LOSSON B., MIGNON B. Humoral and cellular immune response to a Microsporum canis recombinant keratinolytic metalloprotease (r-MEP3) in experimentally infected guinea pigs. Med. Mycol., 2003, 41, 495-501. CASADEVALL A., FELDMESSER M., PIROFSKI L.A. Induced humoral immunity and vaccination against major human fungal pathogens. Curr. Opin. Microbiol., 2002, 5, 386-91. CASSONE A. Fungal vaccines and vaccination : problems and perspectives. In : Brown G.D., Netea M.G. (Eds), Immunology of fungal infections. Springer: Heidelberg, 2007, 465-485. DESCAMPS F., BROUTA F., MONOD M., ZAUGG C., BAAR D., LOSSON B., MIGNON B. Isolation of a Microsporum canis gene family encoding three subtilisin-like proteases expressed in vivo. J. Invest. Dermatol., 2002, 119, 830-5. DESCAMPS F., BROUTA F., VERMOUT S., MONOD M., LOSSON B., MIGNON B. Recombinant expression and antigenic properties of a 31.5-kDa keratinolytic subtilisin-like serine protease from Microsporum canis. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2003a, 38, 29-34. DESCAMPS F.F., BROUTA F., VERMOUT S.M., WILLAME C., LOSSON B.J., MIGNON B.R. A recombinant 31.5 kDa keratinase and a crude exo-antigen from Microsporum canis fail to protect against a homologous experimental infection in guinea pigs. Vet. Dermatol., 2003b, 14, 305-12. ENGELHARD V.H., ALTRICH-VANLITH M., OSTANKOVITCH M., ZARLING A.L. Post-translational modifications of naturally processed MHC-binding epitopes. Curr. Opin. Immunol., 2006, 18, 92-7. JOUSSON O., LÉCHENNE B., BONTEMS O., CAPOCCIA S., MIGNON B., BARBLAN J., QUADRONI M., MONOD M. Multiplication of an ancestral gene encoding secreted fungalysin preceded species differentiation in the dermatophytes Trichophyton and Microsporum. Microbiology, 2004, 150, 301-10. KUMAGAI Y., YAJIMA A., KONISHI K. Peptidase activity of dipeptidyl aminopeptidase IV produced by Porphyromonas gingivalis is important but not sufficient for virulence. Microbiol. Immunol., 2003, 47, 735-43. KUMAGAI Y., YAGISHITA H., YAJIMA A., OKAMOTO T., KONISHI K. Molecular mechanism for connective tissue destruction by dipeptidyl aminopeptidase IV produced by the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun., 2005, 73, 2655-64. MONOD M., LÉCHENNE B., JOUSSON O., GRAND D., ZAUGG C., STÖCKLIN R., GROUZMANN E. Aminopeptidases and dipeptidyl-peptidases secreted by the dermatophyte Trichophyton rubrum. Microbiology, 2005, 151, 145-55. NAKAYASHIKI H. RNA silencing in fungi: mechanisms and applications. FEBS Lett., 2005, 579, 5950-7. RASKA M., RYBNIKAR A., CHUMELA J., BELAKOVA J., WEIGL E. Recombinant protein and DNA vaccines derived from hsp60 Trichophyton mentagrophytes control the clinical course of trichophytosis in bovine species and guinea-pigs. Mycoses, 2004, 47, 407-417. TABART J., BALDO A., VERMOUT S., NUSGENS B., LAPIERE C., LOSSON B., MIGNON B. Reconstructed interfollicular feline epidermis as a model for Microsporum canis dermatophytosis. J. Med. Microbiol., sous presse. WOODFOLK J.A., SUNG S.S., BENJAMIN D.C., LEE J.K., PLATTS-MILLS T.A.. Distinct human T cell repertoires mediate immediate and delayed-type hypersensitivity to the Trichophyton antigen, Tri r 2. J. Immunol., 2000, 165, 4379-87. Publications issues du travail de thèse: VERMOUT S., DENIS M., LOSSON B., MIGNON B. Choix d'un adjuvant lors d'essais de vaccination. Ann. Med. Vet., 2003, 147, 393- 40. VERMOUT S.M., BROUTA F.D., DESCAMPS F.F., LOSSON B.J., MIGNON B.R. Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of a Microsporum canis metalloprotease subunit vaccine in guinea pigs. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2004, 40, 75-80. VERMOUT S., TABART J., BALDO A., MONOD M., LOSSON B., MIGNON B. RNA silencing in the dermatophyte Microsporum canis. FEMS Microbiol. Lett., sous presse. VERMOUT S., TABART J., BALDO A., LOSSON B., MIGNON B. Pathogenesis of dermatophytoses. Mycopathologia, soumis pour publication. VERMOUT S., BALDO A., TABART J., LOSSON B., MIGNON B. Secreted dipeptidyl peptidases as potential virulence factors for Microsporum canis. Soumis pour publication. Remerciements: Fonds pour la formation à la Recherche dans lIndustrie et lAgriculture (F.R.I.A.) Fonds pour la Recherche Scientifique et Médicale (F.R.S.M.) Patrimoine de lUniversité de Liège

L’incidence du cancer du rein et sa mortalité associée se sont accrues au cours des dernières années. Le type de cancer rénal le plus fréquent est celui nommé Cancer Rénal à Cellules Claires (CRCC) où le plus souvent, le gène suppresseur de tumeur Von Hippel Lindau (VHL) est inactivé. Malgré une détection plus précoce, l’évolution de la pathologie demeure incertaine, en particulier quand les patients développent des métastases ou acquièrent une résistance au traitement (25-30% des patients). De nouvelles thérapies ciblant des kinases (Sunitinib, Sorafenib ou Temsirolimus) bien que très prometteuses conduisent très souvent à l’acquisition de résistance. Dans ce contexte, il est urgent de développer de nouveaux modèles prédictifs de la réponse des patients aux traitements et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.Ma thèse de science visait trois objectifs complémentaires : 1) Identifier par criblage chimio-génomique des kinases comme cibles thérapeutiques combinées. 2) Etablir deux modèles de culture 3D de cancer du rein qui intègrent le microenvironnement d’une tumeur: les sphéroïdes et la culture organotypique de coupe de tissus. 3) Etudier la chimio-sensibilité de ces modèles à une combinaison de molécules identifiées dans le criblage.Un criblage cellulaire a été réalisé sur la plateforme de Criblage de Molécules BioActives (CEA- Grenoble). Il a consisté à tester 80 molécules inhibitrices de protéine-kinases en combinaison avec l’extinction génique par interférence ARN (shRNAs lentiviraux) de 36 cibles potentielles connues pour leur implication dans divers cancers. La lignée cellulaire choisie (786-O) est dérivée d’une tumeur rénale à cellules claires radio et chimio-résistante et dépourvue de VHL. Parmi les touches qui compromettent la viabilité des cellules 786-O, la combinaison choisie pour son efficacité cible deux kinases importantes dans le contrôle de la survie cellulaire et de la réparation de l’ADN CK2 et ATM. Le statut VHL des cellules module de façon dramatique leur sensibilité à cette combinaison, l’association de ces deux inhibiteurs étant plus efficace sur les cellules 786-O (VHL -) que sur les mêmes cellules dans lesquelles VHL a été réintroduit (VHL+). Au sein d’une tumeur, les différents niveaux d’oxygénation constituent une variation environnementale supplémentaire créant des susceptibilités ou des résistances aux traitements thérapeutiques. Pour déterminer l’impact de nos molécules dans ce contexte, nous avons testé la viabilité des cellules 786-O VHL+ et VHL- dans des conditions normoxiques (21% O2) ou hypoxiques (1,5% O2), en présence des molécules seules ou en combinaison. En normoxie, une diminution synergique de la viabilité des cellules 786-O VHL- est observée en présence de la combinaison, alors que cet effet n’a pas lieu sur les cellules 786-O VHL+. Cette synergie est potentialisée en condition hypoxique. Au niveau mécanistique, les voies de signalisation de stress cellulaires sont d’avantage activées dans les cellules VHL- en présence de la combinaison de molécules comparé au traitement avec chacune des molécules seules. Dans les sphéroïdes tumoraux multicellulaires reproduisant l’organisation d’une micro-tumeur, nos résultats montrent que notre combinaison de molécules induit d’avantage l’apoptose des cellules VHL- que les molécules seules, alors que les cellules VHL+ ne sont sensibles à aucun des traitements.Ces résultats montrent que l’action de nos molécules combinées est clairement plus efficace dans un modèle 3-D. Ils démontrent également qu’il est possible d’objectiver une pharmaco-modulation de la viabilité de cultures organotypiques de tumeur du rein par des combinaisons d’inhibiteurs chimiques de protéine-kinases. Les perspectives de ce travail sont la validation de cette combinaison sur des tumeurs humaines et l’exploitation des cultures organotypiques comme test personnalisé de réponse aux traitements. / Renal cell carcinoma accounts for 3% of all malignant diseases in adults making it the 10th most common cancer in France. The most frequent type of Kidney cancer is Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CCRCC). Almost all CCRCC show an inactivation of the Von Hippel Lindau tumour suppressor gene (VHL). Between 25-30% of the patients will develop metastatic renal cell carcinoma (mRCC) by the time they are diagnose or become unresponsive to all treatments and in these cases, the disease has a rapid progression. Over the past years, kinase-targeted therapies (Sunitinib, Sorafenib, Temsirolimus) have become the mainstay of treatment for mRCC, however, most, if not all, patients acquire resistance to these approaches over time.In this context my PhD had 3 goals: a) to find a new combinatory targeted therapy through a High Throughput Screening; b) to establish 3D models mimicking the real environment of the tumours (spheroids, Tissue Slice Culture); c) to validate the Hits through different molecular and cellular biology studies.We conducted a synthetic lethal screen on the CMBA platform (CEA-Grenoble), choosing 36 potential genes targets and 80 kinases inhibitors drugs. Each of the target gene was silenced by a transduction with shRNA Lentivirus into the 786-O cell line derived from ccRCC that lacks the tumour suppressor VHL, is radio- and chemo-therapy resistant, has increased mobility and is highly metastatic. Among the hit combinations that affect cell viability, one of them was chosen because it targets two important kinases involved in cell survival and DNA repair: CK2 and ATM. Moreover, this combination is specifically more active in the 786-O VHL- cells than in 786-O VHL+ cell line. We evaluated the effect of our drugs on the viability of our 786-O VHL+ and VHL- cells in normoxic (21% O2) or hypoxic (1.5% O2) conditions that reflect different environments that are present in a tumour. Surprisingly, in normoxia, we found a synergetic effect of the drug mix only on the 786-O VHL- cells but not on 786-O VHL+ cells. Furthermore, this effect was even stronger in conditions of Hypoxia (up to 20% of synergism).Mechanistically, an up-regulation of the stress pathways was much stronger in the VHL- cells in the presence of the combination than with the drugs alone. No apoptosis was detected in this 2D models. In Multi-Cellular Tumour Spheroid (MCTS) where the organization of a micro-tumour is reproduced, our drugs are even more effective in inducing cell apoptosis than in 2D monolayers of 786-O VHL- cells. These results also demonstrate that pharmaco-modulation of viability of renal tumour organotypic culture by chemical combination targeting protein kinases can be studied. Perspectives of this work are the validation of this drug combination on human renal tumours and the use of organotypic culture as a test for personalized treatment response.