Microsporum canis é um dermatófito zoofílico e o fungo mais frequentemente isolado de cães e gatos, de crianças com tinea capitis e de adultos com tinea corporis. Ainda não se conhece as possíveis variáveis envolvidas no estabelecimento de infecções clínicas ou subclínicas em cães e gatos, assim como os fatores envolvidos na transmissão de M. canis para os seres humanos. Diversas técnicas de biologia molecular falharam em demonstrar variabilidade genética entre diferentes linhagens de M. canis, porém, estudos recentes indicam que a utilização de primers mais discriminatórios, como os marcadores microsatélites, possibilite a detecção de diferentes genótipos de M. canis. Os objetivos deste trabalho de pesquisa foram: identificar e comparar o genótipo de M. canis isolados de cães e gatos sintomáticos e assintomáticos e de seres humanos utilizando marcadores microssatélites e investigar uma possível correlação entre as características genotípicas e dados epidemiológicos de M. canis isolados de cães, gatos e seres humanos. Foram incluídos no estudo isolados de 102 cães e gatos sintomáticos e assintomáticos e de pacientes humanos com tinea nos quais se isolou o M. canis durante os anos de 2006 a 2010. Essas amostras foram provenientes de Curitiba, Porto Alegre, Florianópolis e Cuiabá. Dentre elas, 37 eram de gatos sintomáticos, 35 de gatos assintomáticos, 19 de pacientes humanos sintomáticos, 9 de cães assintomáticos e 2 de cães sintomáticos. A amplificação da região de microsatélites do DNA foi realizada utilizando dois primers, McGT13 e McGT17, a qual possibilitou a formação de grupos de acordo com o grau de similaridade genética baseada no número de repetições nessas duas regiões do DNA do M. canis. Os loci Mc(GT)13 e Mc(GT)17 revelaram 3 e 6 alelos, variando de 2 e 5 repetições de dinucleotídeos dentro de cada locus, respectivamente. Dos 14 genótipos e 5 grandes grupos formados após análise da árvore filogenética gerada pelo método Dc, 1 foi compartilhado por 26 isolados, outro por 21, um por 12 isolados e outros dois com 11 isolados cada um. Outros dois pequenos grupos foram formados com 7 e 5 isolados cada. Os marcadores microssatélites possibilitaram a identificação, o estudo filogenético e a comparação dos isolados de M. canis oriundos de gatos, cães e pacientes humanos incluídos no estudo. Apesar da formação de grupos geneticamente relacionados, não houve correlação entre as linhagens e os dados epidemiológicos analisados entre as isolados, incluindo fonte, sintomatologia, quadro clínico, raça, idade, sexo, moradia e localização geográfica. / Microsporum canis is a zoophilic dermatophyte and the most commonly isolated fungi from dogs, cats, children with tinea capitis and adults with tinea corporis. There are unknown variables in establishment of clinical or subclinical infection in dogs and cats and also in M. canis transmission to humans. Several molecular techniques failed to show genetic variability between different strains of M. canis, but recent studies indicate that the use of more discriminatories primers, as microsatellite markers, may detect different genotypes of this dermatophyte. This study has as objectives to identify and compare M. canis strains genotype isolated from symptomatic and asymptomatic dogs and cats and from people with dermatophytosis using microsatellite technique and to investigate a possible correlation between epidemiologic data and genotypic characteristics of M. canis isolated from dogs, cats and people. One hundred and two strains of M. canis isolated from symptomatic and asymptomatic dogs and cats and people with tinea between 2006 and 2010 were included in this study. These strains were from Curitiba, Porto Alegre, Florianópolis and Cuiaba. Among them, 37 were from symptomatic cats, 35 from asymptomatic cats, 19 from people with tinea, 9 from asymptomatic dogs and 2 from symptomatic dogs. Amplification of microsatellite DNA region was performed using two primers, McGT13 e McGT17, which allowed the formation of groups according to the degree of genetic similarity based on the amount of repetition in these two regions of M. canis DNA. Loci Mc(GT)13 e Mc(GT)17 revealed 3 and 6 alleles, varying between 2 and 5 dinucleotide repeats within each locus, respectively. Of the 14 genotypes and 5 major groups formed after phylogenetic tree analysis generated by DC method, 1 was shared by 26 strains, the other by 21, one by 12 strains and another two with 11 strains each. Microsatellite markers allowed identification, phylogenetic analysis and comparison of M. canis strains isolated from cats, dogs and people included in this study. Despite the formation of genetically related groups, there was no correlation between the lineage and epidemiologic characteristics, including source, symptoms, clinical picture, breed, age, sex, housing and geographical location.

Microsporum canis é um dermatófito zoofílico e o fungo mais frequentemente isolado de cães e gatos, de crianças com tinea capitis e de adultos com tinea corporis. Ainda não se conhece as possíveis variáveis envolvidas no estabelecimento de infecções clínicas ou subclínicas em cães e gatos, assim como os fatores envolvidos na transmissão de M. canis para os seres humanos. Diversas técnicas de biologia molecular falharam em demonstrar variabilidade genética entre diferentes linhagens de M. canis, porém, estudos recentes indicam que a utilização de primers mais discriminatórios, como os marcadores microsatélites, possibilite a detecção de diferentes genótipos de M. canis. Os objetivos deste trabalho de pesquisa foram: identificar e comparar o genótipo de M. canis isolados de cães e gatos sintomáticos e assintomáticos e de seres humanos utilizando marcadores microssatélites e investigar uma possível correlação entre as características genotípicas e dados epidemiológicos de M. canis isolados de cães, gatos e seres humanos. Foram incluídos no estudo isolados de 102 cães e gatos sintomáticos e assintomáticos e de pacientes humanos com tinea nos quais se isolou o M. canis durante os anos de 2006 a 2010. Essas amostras foram provenientes de Curitiba, Porto Alegre, Florianópolis e Cuiabá. Dentre elas, 37 eram de gatos sintomáticos, 35 de gatos assintomáticos, 19 de pacientes humanos sintomáticos, 9 de cães assintomáticos e 2 de cães sintomáticos. A amplificação da região de microsatélites do DNA foi realizada utilizando dois primers, McGT13 e McGT17, a qual possibilitou a formação de grupos de acordo com o grau de similaridade genética baseada no número de repetições nessas duas regiões do DNA do M. canis. Os loci Mc(GT)13 e Mc(GT)17 revelaram 3 e 6 alelos, variando de 2 e 5 repetições de dinucleotídeos dentro de cada locus, respectivamente. Dos 14 genótipos e 5 grandes grupos formados após análise da árvore filogenética gerada pelo método Dc, 1 foi compartilhado por 26 isolados, outro por 21, um por 12 isolados e outros dois com 11 isolados cada um. Outros dois pequenos grupos foram formados com 7 e 5 isolados cada. Os marcadores microssatélites possibilitaram a identificação, o estudo filogenético e a comparação dos isolados de M. canis oriundos de gatos, cães e pacientes humanos incluídos no estudo. Apesar da formação de grupos geneticamente relacionados, não houve correlação entre as linhagens e os dados epidemiológicos analisados entre as isolados, incluindo fonte, sintomatologia, quadro clínico, raça, idade, sexo, moradia e localização geográfica. / Microsporum canis is a zoophilic dermatophyte and the most commonly isolated fungi from dogs, cats, children with tinea capitis and adults with tinea corporis. There are unknown variables in establishment of clinical or subclinical infection in dogs and cats and also in M. canis transmission to humans. Several molecular techniques failed to show genetic variability between different strains of M. canis, but recent studies indicate that the use of more discriminatories primers, as microsatellite markers, may detect different genotypes of this dermatophyte. This study has as objectives to identify and compare M. canis strains genotype isolated from symptomatic and asymptomatic dogs and cats and from people with dermatophytosis using microsatellite technique and to investigate a possible correlation between epidemiologic data and genotypic characteristics of M. canis isolated from dogs, cats and people. One hundred and two strains of M. canis isolated from symptomatic and asymptomatic dogs and cats and people with tinea between 2006 and 2010 were included in this study. These strains were from Curitiba, Porto Alegre, Florianópolis and Cuiaba. Among them, 37 were from symptomatic cats, 35 from asymptomatic cats, 19 from people with tinea, 9 from asymptomatic dogs and 2 from symptomatic dogs. Amplification of microsatellite DNA region was performed using two primers, McGT13 e McGT17, which allowed the formation of groups according to the degree of genetic similarity based on the amount of repetition in these two regions of M. canis DNA. Loci Mc(GT)13 e Mc(GT)17 revealed 3 and 6 alleles, varying between 2 and 5 dinucleotide repeats within each locus, respectively. Of the 14 genotypes and 5 major groups formed after phylogenetic tree analysis generated by DC method, 1 was shared by 26 strains, the other by 21, one by 12 strains and another two with 11 strains each. Microsatellite markers allowed identification, phylogenetic analysis and comparison of M. canis strains isolated from cats, dogs and people included in this study. Despite the formation of genetically related groups, there was no correlation between the lineage and epidemiologic characteristics, including source, symptoms, clinical picture, breed, age, sex, housing and geographical location.

Microsporum canis é um dermatófito zoofílico e o fungo mais frequentemente isolado de cães e gatos, de crianças com tinea capitis e de adultos com tinea corporis. Ainda não se conhece as possíveis variáveis envolvidas no estabelecimento de infecções clínicas ou subclínicas em cães e gatos, assim como os fatores envolvidos na transmissão de M. canis para os seres humanos. Diversas técnicas de biologia molecular falharam em demonstrar variabilidade genética entre diferentes linhagens de M. canis, porém, estudos recentes indicam que a utilização de primers mais discriminatórios, como os marcadores microsatélites, possibilite a detecção de diferentes genótipos de M. canis. Os objetivos deste trabalho de pesquisa foram: identificar e comparar o genótipo de M. canis isolados de cães e gatos sintomáticos e assintomáticos e de seres humanos utilizando marcadores microssatélites e investigar uma possível correlação entre as características genotípicas e dados epidemiológicos de M. canis isolados de cães, gatos e seres humanos. Foram incluídos no estudo isolados de 102 cães e gatos sintomáticos e assintomáticos e de pacientes humanos com tinea nos quais se isolou o M. canis durante os anos de 2006 a 2010. Essas amostras foram provenientes de Curitiba, Porto Alegre, Florianópolis e Cuiabá. Dentre elas, 37 eram de gatos sintomáticos, 35 de gatos assintomáticos, 19 de pacientes humanos sintomáticos, 9 de cães assintomáticos e 2 de cães sintomáticos. A amplificação da região de microsatélites do DNA foi realizada utilizando dois primers, McGT13 e McGT17, a qual possibilitou a formação de grupos de acordo com o grau de similaridade genética baseada no número de repetições nessas duas regiões do DNA do M. canis. Os loci Mc(GT)13 e Mc(GT)17 revelaram 3 e 6 alelos, variando de 2 e 5 repetições de dinucleotídeos dentro de cada locus, respectivamente. Dos 14 genótipos e 5 grandes grupos formados após análise da árvore filogenética gerada pelo método Dc, 1 foi compartilhado por 26 isolados, outro por 21, um por 12 isolados e outros dois com 11 isolados cada um. Outros dois pequenos grupos foram formados com 7 e 5 isolados cada. Os marcadores microssatélites possibilitaram a identificação, o estudo filogenético e a comparação dos isolados de M. canis oriundos de gatos, cães e pacientes humanos incluídos no estudo. Apesar da formação de grupos geneticamente relacionados, não houve correlação entre as linhagens e os dados epidemiológicos analisados entre as isolados, incluindo fonte, sintomatologia, quadro clínico, raça, idade, sexo, moradia e localização geográfica. / Microsporum canis is a zoophilic dermatophyte and the most commonly isolated fungi from dogs, cats, children with tinea capitis and adults with tinea corporis. There are unknown variables in establishment of clinical or subclinical infection in dogs and cats and also in M. canis transmission to humans. Several molecular techniques failed to show genetic variability between different strains of M. canis, but recent studies indicate that the use of more discriminatories primers, as microsatellite markers, may detect different genotypes of this dermatophyte. This study has as objectives to identify and compare M. canis strains genotype isolated from symptomatic and asymptomatic dogs and cats and from people with dermatophytosis using microsatellite technique and to investigate a possible correlation between epidemiologic data and genotypic characteristics of M. canis isolated from dogs, cats and people. One hundred and two strains of M. canis isolated from symptomatic and asymptomatic dogs and cats and people with tinea between 2006 and 2010 were included in this study. These strains were from Curitiba, Porto Alegre, Florianópolis and Cuiaba. Among them, 37 were from symptomatic cats, 35 from asymptomatic cats, 19 from people with tinea, 9 from asymptomatic dogs and 2 from symptomatic dogs. Amplification of microsatellite DNA region was performed using two primers, McGT13 e McGT17, which allowed the formation of groups according to the degree of genetic similarity based on the amount of repetition in these two regions of M. canis DNA. Loci Mc(GT)13 e Mc(GT)17 revealed 3 and 6 alleles, varying between 2 and 5 dinucleotide repeats within each locus, respectively. Of the 14 genotypes and 5 major groups formed after phylogenetic tree analysis generated by DC method, 1 was shared by 26 strains, the other by 21, one by 12 strains and another two with 11 strains each. Microsatellite markers allowed identification, phylogenetic analysis and comparison of M. canis strains isolated from cats, dogs and people included in this study. Despite the formation of genetically related groups, there was no correlation between the lineage and epidemiologic characteristics, including source, symptoms, clinical picture, breed, age, sex, housing and geographical location.

As dermatofitoses causadas por um grupo de fungos filamentosos e queratinofílicos, na maioria cosmopolita, acometem um grande número de mamíferos. Os cães e gatos são os principais reservatórios e fontes de infecções de Microsporum canis aos humanos e a outros animais domésticos. Dados epidemiológicos sobre as infecções fúngicas são importantes para diagnóstico, tratamento e prevenção. Os objetivos do trabalho foram analisar a frequência, os fatores de risco e a tendência secular da dermatofitose em cães e gatos no período de 1979 a 2009 em Porto Alegre, RS, Brasil. Foi realizado um estudo epidemiológico observacional retrospectivo, com os dados de 6695 amostras de animais com suspeita clínica de dermatofitose (5584 (83,4%) cães e 1111 (16,6%) gatos). A frequência encontrada foi de 16,6%, sendo o fungo Microsporum canis o mais isolado em cães (78,4%) e gatos (97%). Observou-se uma maior frequência de amostras positivas provenientes de gatos. A frequência também foi maior em cães e gatos com raça definida. Nos cães foi observada maior chance de dermatofitose em animais com idade entre 1 e 24 meses e com pelagem média a longa. Já nos gatos a chance foi maior em animais jovens, onde a probabilidade de isolamento diminui aproximadamente 2,3% a cada incremento de um mês na idade. Também uma maior chance de dermatofitose em gatos com pelagem média a longa. As análises mostraram um aumento médio da positividade com o aumento da umidade relativa do ar e período de tempo. O exame microscópico dos pelos apresentou 48% de sensibilidade e 97,4% de especificidade, enquanto o teste da lâmpada de Wood 64,52% de sensibilidade e 89,22% de especificidade quando comparados com o cultivo fúngico. A espécie fúngica com maior frequência de isolamentos nesta população foi o Microsporum canis, além disso, os gatos apresentaram maior risco de contrair dermatofitose por este agente do que os cães. Os fatores de risco encontrados nessa população estavam relacionados com idade (animais jovens), pelagem (média a longa) e umidade relativa do ar (maiores índices). A frequência de isolamentos aumentou ao longo do período (1979 – 2009) e o cultivo fúngico foi considerado como padrão-ouro para diagnosticar a dermatofitose. / Dermatophytoses are caused by a group of fungi with keratinophilic and keratinolytic properties. A wide variety of dermatophytes have been isolated from a large number of mammals. Dogs and cats are the main carriers and sources of infections of Microsporum canis to human as well as to other domestic animals. Epidemiological data about fungal infections are important for diagnosis, treatment and prevention. The objectives of the present study were to analyze the frequency, the risk factors, and the secular tendency of dermatophytoses in dogs and cats from 1979 to 2009 in Porto Alegre, RS, Brazil. A retrospective observational epidemiological study was performed based on data obtained from 6695 samples of animals with clinical suspicion of dermatophytoses [5584 (83.4%) dogs and 1111 (16.6%) cats]. The frequency found was 16.6%, being Microsporum canis the most isolated fungus in dogs (78.4%) and cats (97%). It was observed a higher frequency of positive samples originated from cats. The frequency was also higher in dogs and cats with a defined breed. In dogs, the probabilitie of dermatophytoses was greater in animals between 1 and 24 months, with medium to long coat. On the other hand, the chance observed in cats was higher in young animals, where the probability of isolation decreases around 2.3% for each additional month of age. There is a greater chance of dermatophytosis in cats with medium to long coats as well. The analyses had demonstrated a medium raise in positivity with the increasing of the relative air humidity and period of time. The microscopic examination of the coat revealed 48% of sensitivity and 97% of specificity, while with Wood’s lamp test, it was achieved 64.52% of sensitivity and 89.22% of specificity when compared to fungal culture. The fungal species with higher frequency of isolation in this population was Microsporum canis and cats were more likely to be infected by this agent than dogs. The risk factors found in this population were related to age (young animals), coat (medium to long), and relative air humidity (higher rates). The frequency of isolation increased throughout the period (1979 - 2009) and fungal culture was considered as the “gold standard” for diagnosing dermatophytoses.

A dermatofitose é a zoonose micótica mais difundida mundialmente e os animais domésticos são os principais reservatórios dos dermatófitos zoofílicos que, em alguns países, são causadores mais frequentes da doença em humanos do que as espécies antropofílicas. Especificamente em relação ao Microsporum canis, principal espécie zoofílica nas zonas urbanas, pouco sucesso foi obtido com a produção de vacinas para seu controle. Os objetivos dessa pesquisa foram verificar a ocorrência gatos clinicamente sadios portadores de dermatófitos na região metropolitana de Porto Alegre e, também, analisar estatisticamente a influência de fatores como idade, sexo, raça e acesso à rua. Amostras foram obtidas do pelame de 191 gatos sem sinais clínicos de dermatoses após fricção dos pelos (face, região pré-auricular, dorso, cauda e membros) que foram semeadas em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e ciclohexamida e incubadas a 27°C por até 21 dias. A possibilidade da associação entre as variáveis preditoras e a variável resposta foi avaliada através de um modelo de regressão logística univariado. Somente espécies de Microsporum (8,4%) foram isoladas de amostras positivas: M. canis (5,8%) e M. gypseum (2,6%). Em 15 (7,8%) das amostras não ocorreu crescimento fúngico. Nos restantes 160 (83,8%) cultivos foram isolados diversos fungos saprotróficos: filamentosos hialinos (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. e Scopulariopsis sp.); filamentosos dematiáceos ( Cladosporium sp., Alternaria sp. e Curvularia sp.); zigomicetos (Rhizopus sp. e Mucor sp.) e leveduras (Malassezia sp. e Candida sp.). Foi observado um maior risco relativo para o isolamento de dermatófito quando o animal era do sexo masculino e teve acesso à rua em uma magnitude de 3,43 e 3,52, respectivamente. Não foi identificado nenhum fator protetivo na análise multivariada. O modelo final teve poder discriminatório de 72%. Ainda são poucas as informações sobre o complexo mecanismo de infecção e a susceptibilidade dos animais, mas o isolamento fúngico de gatos sadios aliado a dados epidemiológicos são importantes ferramentas para o diagnóstico e tratamento desta micose. Os resultados obtidos corroboram estudos similares realizados em regiões metropolitanas de outros países. É enfatizada a possibilidade de contágio humano a partir de gatos assintomáticos e a necessidade da adoção de medidas profiláticas para reduzir a disseminação dos dermatófitos. / Dermatophytoses are in the list of the most frequent skin diseases of pets and livestock all over the world. Contagiousness among animal communities, difficulty in implementing control measures, and the eventual transmition of animal ringworm to people explain its great importance. A wide variety of dermatophytes have been isolated from animals, but a few zoophilic species are responsible for the majority of the cases. Microsporum canis is one of these and in some countries seems to cause a high proportion of human infections, outnumbering classical ringworm anthropophilic dermatophytes. So far, a safe and efficient vaccine is not available for protecting cats and dogs exposed to M. canis. The objective of this study is to survey dermatophytes in clinically normal cats in the metropolitan area of Porto Alegre, south of Brazil, and weight the possible influence of age, sex, breed and living conditions in the presence of these fungi. Samples were obtained from 191 cats with no skin disease after brushing the body (head, neck, dorsum, limbs and tail) and incubated on Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol and cyclohexamide at 27°C for up to 21 days. The possibility of association between predictors variables and a variable answer was evaluated by an univariate logistic regression model. Only Microsporum species, (8,4%) were isolated from positive specimens: M. canis (5,8%) and M. gypseum (2,6%). On 15 samples (7,8%) there was no fungal growth. Of the remaining 160 samples (83,8%), several saprotrophic fungi were isolated: hyaline filamentous fungi (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. and Scopulariopsis sp.); dematiaceous filamentous fungi (Cladosporium sp., Alternaria sp. and Curvularia sp.); Zygomycetes (Rhizopus sp. and Mucor sp.) and yeasts (Malassezia sp. and Candida sp.). It was observed an higher relative risk for the isolation of dermatophyte when the cat was male and was allowed to walk outdoors in a magnitude of 3.43 and 3.52, respectively. The multivariate analysis did not identify any protective factor against dermatophytosis. The final model had a discriminatory power of 72%. There are few informations about the complex mechanisms of infection and susceptibility of the animals, but fungal isolation from healthy cats associated with epidemiological features are important tools in the diagnosis and management of the problem. Results of this research are similar to others conducted around urban areas of different countries across the world. It is emphasized that human beings can be contaminated from apparently healthy cats and the author stresses the necessity of prophylactic measures in order to reduce the spread of dermatophytosis.

As dermatofitoses causadas por um grupo de fungos filamentosos e queratinofílicos, na maioria cosmopolita, acometem um grande número de mamíferos. Os cães e gatos são os principais reservatórios e fontes de infecções de Microsporum canis aos humanos e a outros animais domésticos. Dados epidemiológicos sobre as infecções fúngicas são importantes para diagnóstico, tratamento e prevenção. Os objetivos do trabalho foram analisar a frequência, os fatores de risco e a tendência secular da dermatofitose em cães e gatos no período de 1979 a 2009 em Porto Alegre, RS, Brasil. Foi realizado um estudo epidemiológico observacional retrospectivo, com os dados de 6695 amostras de animais com suspeita clínica de dermatofitose (5584 (83,4%) cães e 1111 (16,6%) gatos). A frequência encontrada foi de 16,6%, sendo o fungo Microsporum canis o mais isolado em cães (78,4%) e gatos (97%). Observou-se uma maior frequência de amostras positivas provenientes de gatos. A frequência também foi maior em cães e gatos com raça definida. Nos cães foi observada maior chance de dermatofitose em animais com idade entre 1 e 24 meses e com pelagem média a longa. Já nos gatos a chance foi maior em animais jovens, onde a probabilidade de isolamento diminui aproximadamente 2,3% a cada incremento de um mês na idade. Também uma maior chance de dermatofitose em gatos com pelagem média a longa. As análises mostraram um aumento médio da positividade com o aumento da umidade relativa do ar e período de tempo. O exame microscópico dos pelos apresentou 48% de sensibilidade e 97,4% de especificidade, enquanto o teste da lâmpada de Wood 64,52% de sensibilidade e 89,22% de especificidade quando comparados com o cultivo fúngico. A espécie fúngica com maior frequência de isolamentos nesta população foi o Microsporum canis, além disso, os gatos apresentaram maior risco de contrair dermatofitose por este agente do que os cães. Os fatores de risco encontrados nessa população estavam relacionados com idade (animais jovens), pelagem (média a longa) e umidade relativa do ar (maiores índices). A frequência de isolamentos aumentou ao longo do período (1979 – 2009) e o cultivo fúngico foi considerado como padrão-ouro para diagnosticar a dermatofitose. / Dermatophytoses are caused by a group of fungi with keratinophilic and keratinolytic properties. A wide variety of dermatophytes have been isolated from a large number of mammals. Dogs and cats are the main carriers and sources of infections of Microsporum canis to human as well as to other domestic animals. Epidemiological data about fungal infections are important for diagnosis, treatment and prevention. The objectives of the present study were to analyze the frequency, the risk factors, and the secular tendency of dermatophytoses in dogs and cats from 1979 to 2009 in Porto Alegre, RS, Brazil. A retrospective observational epidemiological study was performed based on data obtained from 6695 samples of animals with clinical suspicion of dermatophytoses [5584 (83.4%) dogs and 1111 (16.6%) cats]. The frequency found was 16.6%, being Microsporum canis the most isolated fungus in dogs (78.4%) and cats (97%). It was observed a higher frequency of positive samples originated from cats. The frequency was also higher in dogs and cats with a defined breed. In dogs, the probabilitie of dermatophytoses was greater in animals between 1 and 24 months, with medium to long coat. On the other hand, the chance observed in cats was higher in young animals, where the probability of isolation decreases around 2.3% for each additional month of age. There is a greater chance of dermatophytosis in cats with medium to long coats as well. The analyses had demonstrated a medium raise in positivity with the increasing of the relative air humidity and period of time. The microscopic examination of the coat revealed 48% of sensitivity and 97% of specificity, while with Wood’s lamp test, it was achieved 64.52% of sensitivity and 89.22% of specificity when compared to fungal culture. The fungal species with higher frequency of isolation in this population was Microsporum canis and cats were more likely to be infected by this agent than dogs. The risk factors found in this population were related to age (young animals), coat (medium to long), and relative air humidity (higher rates). The frequency of isolation increased throughout the period (1979 - 2009) and fungal culture was considered as the “gold standard” for diagnosing dermatophytoses.

A dermatofitose é a zoonose micótica mais difundida mundialmente e os animais domésticos são os principais reservatórios dos dermatófitos zoofílicos que, em alguns países, são causadores mais frequentes da doença em humanos do que as espécies antropofílicas. Especificamente em relação ao Microsporum canis, principal espécie zoofílica nas zonas urbanas, pouco sucesso foi obtido com a produção de vacinas para seu controle. Os objetivos dessa pesquisa foram verificar a ocorrência gatos clinicamente sadios portadores de dermatófitos na região metropolitana de Porto Alegre e, também, analisar estatisticamente a influência de fatores como idade, sexo, raça e acesso à rua. Amostras foram obtidas do pelame de 191 gatos sem sinais clínicos de dermatoses após fricção dos pelos (face, região pré-auricular, dorso, cauda e membros) que foram semeadas em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e ciclohexamida e incubadas a 27°C por até 21 dias. A possibilidade da associação entre as variáveis preditoras e a variável resposta foi avaliada através de um modelo de regressão logística univariado. Somente espécies de Microsporum (8,4%) foram isoladas de amostras positivas: M. canis (5,8%) e M. gypseum (2,6%). Em 15 (7,8%) das amostras não ocorreu crescimento fúngico. Nos restantes 160 (83,8%) cultivos foram isolados diversos fungos saprotróficos: filamentosos hialinos (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. e Scopulariopsis sp.); filamentosos dematiáceos ( Cladosporium sp., Alternaria sp. e Curvularia sp.); zigomicetos (Rhizopus sp. e Mucor sp.) e leveduras (Malassezia sp. e Candida sp.). Foi observado um maior risco relativo para o isolamento de dermatófito quando o animal era do sexo masculino e teve acesso à rua em uma magnitude de 3,43 e 3,52, respectivamente. Não foi identificado nenhum fator protetivo na análise multivariada. O modelo final teve poder discriminatório de 72%. Ainda são poucas as informações sobre o complexo mecanismo de infecção e a susceptibilidade dos animais, mas o isolamento fúngico de gatos sadios aliado a dados epidemiológicos são importantes ferramentas para o diagnóstico e tratamento desta micose. Os resultados obtidos corroboram estudos similares realizados em regiões metropolitanas de outros países. É enfatizada a possibilidade de contágio humano a partir de gatos assintomáticos e a necessidade da adoção de medidas profiláticas para reduzir a disseminação dos dermatófitos. / Dermatophytoses are in the list of the most frequent skin diseases of pets and livestock all over the world. Contagiousness among animal communities, difficulty in implementing control measures, and the eventual transmition of animal ringworm to people explain its great importance. A wide variety of dermatophytes have been isolated from animals, but a few zoophilic species are responsible for the majority of the cases. Microsporum canis is one of these and in some countries seems to cause a high proportion of human infections, outnumbering classical ringworm anthropophilic dermatophytes. So far, a safe and efficient vaccine is not available for protecting cats and dogs exposed to M. canis. The objective of this study is to survey dermatophytes in clinically normal cats in the metropolitan area of Porto Alegre, south of Brazil, and weight the possible influence of age, sex, breed and living conditions in the presence of these fungi. Samples were obtained from 191 cats with no skin disease after brushing the body (head, neck, dorsum, limbs and tail) and incubated on Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol and cyclohexamide at 27°C for up to 21 days. The possibility of association between predictors variables and a variable answer was evaluated by an univariate logistic regression model. Only Microsporum species, (8,4%) were isolated from positive specimens: M. canis (5,8%) and M. gypseum (2,6%). On 15 samples (7,8%) there was no fungal growth. Of the remaining 160 samples (83,8%), several saprotrophic fungi were isolated: hyaline filamentous fungi (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. and Scopulariopsis sp.); dematiaceous filamentous fungi (Cladosporium sp., Alternaria sp. and Curvularia sp.); Zygomycetes (Rhizopus sp. and Mucor sp.) and yeasts (Malassezia sp. and Candida sp.). It was observed an higher relative risk for the isolation of dermatophyte when the cat was male and was allowed to walk outdoors in a magnitude of 3.43 and 3.52, respectively. The multivariate analysis did not identify any protective factor against dermatophytosis. The final model had a discriminatory power of 72%. There are few informations about the complex mechanisms of infection and susceptibility of the animals, but fungal isolation from healthy cats associated with epidemiological features are important tools in the diagnosis and management of the problem. Results of this research are similar to others conducted around urban areas of different countries across the world. It is emphasized that human beings can be contaminated from apparently healthy cats and the author stresses the necessity of prophylactic measures in order to reduce the spread of dermatophytosis.

As dermatofitoses causadas por um grupo de fungos filamentosos e queratinofílicos, na maioria cosmopolita, acometem um grande número de mamíferos. Os cães e gatos são os principais reservatórios e fontes de infecções de Microsporum canis aos humanos e a outros animais domésticos. Dados epidemiológicos sobre as infecções fúngicas são importantes para diagnóstico, tratamento e prevenção. Os objetivos do trabalho foram analisar a frequência, os fatores de risco e a tendência secular da dermatofitose em cães e gatos no período de 1979 a 2009 em Porto Alegre, RS, Brasil. Foi realizado um estudo epidemiológico observacional retrospectivo, com os dados de 6695 amostras de animais com suspeita clínica de dermatofitose (5584 (83,4%) cães e 1111 (16,6%) gatos). A frequência encontrada foi de 16,6%, sendo o fungo Microsporum canis o mais isolado em cães (78,4%) e gatos (97%). Observou-se uma maior frequência de amostras positivas provenientes de gatos. A frequência também foi maior em cães e gatos com raça definida. Nos cães foi observada maior chance de dermatofitose em animais com idade entre 1 e 24 meses e com pelagem média a longa. Já nos gatos a chance foi maior em animais jovens, onde a probabilidade de isolamento diminui aproximadamente 2,3% a cada incremento de um mês na idade. Também uma maior chance de dermatofitose em gatos com pelagem média a longa. As análises mostraram um aumento médio da positividade com o aumento da umidade relativa do ar e período de tempo. O exame microscópico dos pelos apresentou 48% de sensibilidade e 97,4% de especificidade, enquanto o teste da lâmpada de Wood 64,52% de sensibilidade e 89,22% de especificidade quando comparados com o cultivo fúngico. A espécie fúngica com maior frequência de isolamentos nesta população foi o Microsporum canis, além disso, os gatos apresentaram maior risco de contrair dermatofitose por este agente do que os cães. Os fatores de risco encontrados nessa população estavam relacionados com idade (animais jovens), pelagem (média a longa) e umidade relativa do ar (maiores índices). A frequência de isolamentos aumentou ao longo do período (1979 – 2009) e o cultivo fúngico foi considerado como padrão-ouro para diagnosticar a dermatofitose. / Dermatophytoses are caused by a group of fungi with keratinophilic and keratinolytic properties. A wide variety of dermatophytes have been isolated from a large number of mammals. Dogs and cats are the main carriers and sources of infections of Microsporum canis to human as well as to other domestic animals. Epidemiological data about fungal infections are important for diagnosis, treatment and prevention. The objectives of the present study were to analyze the frequency, the risk factors, and the secular tendency of dermatophytoses in dogs and cats from 1979 to 2009 in Porto Alegre, RS, Brazil. A retrospective observational epidemiological study was performed based on data obtained from 6695 samples of animals with clinical suspicion of dermatophytoses [5584 (83.4%) dogs and 1111 (16.6%) cats]. The frequency found was 16.6%, being Microsporum canis the most isolated fungus in dogs (78.4%) and cats (97%). It was observed a higher frequency of positive samples originated from cats. The frequency was also higher in dogs and cats with a defined breed. In dogs, the probabilitie of dermatophytoses was greater in animals between 1 and 24 months, with medium to long coat. On the other hand, the chance observed in cats was higher in young animals, where the probability of isolation decreases around 2.3% for each additional month of age. There is a greater chance of dermatophytosis in cats with medium to long coats as well. The analyses had demonstrated a medium raise in positivity with the increasing of the relative air humidity and period of time. The microscopic examination of the coat revealed 48% of sensitivity and 97% of specificity, while with Wood’s lamp test, it was achieved 64.52% of sensitivity and 89.22% of specificity when compared to fungal culture. The fungal species with higher frequency of isolation in this population was Microsporum canis and cats were more likely to be infected by this agent than dogs. The risk factors found in this population were related to age (young animals), coat (medium to long), and relative air humidity (higher rates). The frequency of isolation increased throughout the period (1979 - 2009) and fungal culture was considered as the “gold standard” for diagnosing dermatophytoses.

A dermatofitose é a zoonose micótica mais difundida mundialmente e os animais domésticos são os principais reservatórios dos dermatófitos zoofílicos que, em alguns países, são causadores mais frequentes da doença em humanos do que as espécies antropofílicas. Especificamente em relação ao Microsporum canis, principal espécie zoofílica nas zonas urbanas, pouco sucesso foi obtido com a produção de vacinas para seu controle. Os objetivos dessa pesquisa foram verificar a ocorrência gatos clinicamente sadios portadores de dermatófitos na região metropolitana de Porto Alegre e, também, analisar estatisticamente a influência de fatores como idade, sexo, raça e acesso à rua. Amostras foram obtidas do pelame de 191 gatos sem sinais clínicos de dermatoses após fricção dos pelos (face, região pré-auricular, dorso, cauda e membros) que foram semeadas em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e ciclohexamida e incubadas a 27°C por até 21 dias. A possibilidade da associação entre as variáveis preditoras e a variável resposta foi avaliada através de um modelo de regressão logística univariado. Somente espécies de Microsporum (8,4%) foram isoladas de amostras positivas: M. canis (5,8%) e M. gypseum (2,6%). Em 15 (7,8%) das amostras não ocorreu crescimento fúngico. Nos restantes 160 (83,8%) cultivos foram isolados diversos fungos saprotróficos: filamentosos hialinos (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. e Scopulariopsis sp.); filamentosos dematiáceos ( Cladosporium sp., Alternaria sp. e Curvularia sp.); zigomicetos (Rhizopus sp. e Mucor sp.) e leveduras (Malassezia sp. e Candida sp.). Foi observado um maior risco relativo para o isolamento de dermatófito quando o animal era do sexo masculino e teve acesso à rua em uma magnitude de 3,43 e 3,52, respectivamente. Não foi identificado nenhum fator protetivo na análise multivariada. O modelo final teve poder discriminatório de 72%. Ainda são poucas as informações sobre o complexo mecanismo de infecção e a susceptibilidade dos animais, mas o isolamento fúngico de gatos sadios aliado a dados epidemiológicos são importantes ferramentas para o diagnóstico e tratamento desta micose. Os resultados obtidos corroboram estudos similares realizados em regiões metropolitanas de outros países. É enfatizada a possibilidade de contágio humano a partir de gatos assintomáticos e a necessidade da adoção de medidas profiláticas para reduzir a disseminação dos dermatófitos. / Dermatophytoses are in the list of the most frequent skin diseases of pets and livestock all over the world. Contagiousness among animal communities, difficulty in implementing control measures, and the eventual transmition of animal ringworm to people explain its great importance. A wide variety of dermatophytes have been isolated from animals, but a few zoophilic species are responsible for the majority of the cases. Microsporum canis is one of these and in some countries seems to cause a high proportion of human infections, outnumbering classical ringworm anthropophilic dermatophytes. So far, a safe and efficient vaccine is not available for protecting cats and dogs exposed to M. canis. The objective of this study is to survey dermatophytes in clinically normal cats in the metropolitan area of Porto Alegre, south of Brazil, and weight the possible influence of age, sex, breed and living conditions in the presence of these fungi. Samples were obtained from 191 cats with no skin disease after brushing the body (head, neck, dorsum, limbs and tail) and incubated on Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol and cyclohexamide at 27°C for up to 21 days. The possibility of association between predictors variables and a variable answer was evaluated by an univariate logistic regression model. Only Microsporum species, (8,4%) were isolated from positive specimens: M. canis (5,8%) and M. gypseum (2,6%). On 15 samples (7,8%) there was no fungal growth. Of the remaining 160 samples (83,8%), several saprotrophic fungi were isolated: hyaline filamentous fungi (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. and Scopulariopsis sp.); dematiaceous filamentous fungi (Cladosporium sp., Alternaria sp. and Curvularia sp.); Zygomycetes (Rhizopus sp. and Mucor sp.) and yeasts (Malassezia sp. and Candida sp.). It was observed an higher relative risk for the isolation of dermatophyte when the cat was male and was allowed to walk outdoors in a magnitude of 3.43 and 3.52, respectively. The multivariate analysis did not identify any protective factor against dermatophytosis. The final model had a discriminatory power of 72%. There are few informations about the complex mechanisms of infection and susceptibility of the animals, but fungal isolation from healthy cats associated with epidemiological features are important tools in the diagnosis and management of the problem. Results of this research are similar to others conducted around urban areas of different countries across the world. It is emphasized that human beings can be contaminated from apparently healthy cats and the author stresses the necessity of prophylactic measures in order to reduce the spread of dermatophytosis.

Thèse de Doctorat en Sciences Vétérinaires Résumé Orientation: Médecine Vétérinaire Titre de la thèse en français: Contribution à létude fonctionnelle des dipeptidyl peptidases et de la métalloprotéase MEP3 sécrétées par Microsporum canis » Titre de la thèse en anglais: Contribution to the functional study of dipeptidyl peptidases and MEP3 metalloprotease secreted by Microsporum canis Candidat: Sandy Vermout Promoteur: Dr Bernard Mignon Co-promoteur: Prof. Bertrand Losson Département et Service: Département des Maladies Infectieuses et Parasitaires, service de Parasitologie et de Pathologie des Maladies Parasitaires Date de la défense publique: Composition du Jury: Description du sujet de recherche abordé: Les dermatophytes sont des champignons filamenteux responsables de mycoses superficielles contagieuses, souvent appelées « teignes », et couramment rencontrées tant en dermatologie humaine que vétérinaire. Parmi eux, Microsporum canis est lagent isolé dans la majorité des cas de dermatophytose chez le chat et le chien. Le chat peut être considéré comme le réservoir de cette infection, quil transmet à différentes espèces animales mais aussi à lhomme. La relation hôte-parasite caractérisant les dermatophytoses est particulière. Les dermatophytes se nourrissent aux dépens même de la barrière kératinisée destinée à la protection de lorganisme contre les agressions extérieures. Ils y restent confinés et sont généralement incapables de provoquer des infections profondes. Les dermatophytes sont des parasites obligatoires, qui affectent des hôtes immunocompétents. Par ailleurs, lexpression clinique des dermatophytoses est très variable selon lhôte et lespèce fongique impliqués : linfection peut être aiguë et rapidement éliminée, ou au contraire persistante et accompagnée de symptômes ténus. Par exemple, les lésions causées par M. canis sont généralement plus inflammatoires chez lhomme que chez le chat, son hôte naturel, et certains chats développent des teignes chroniques peu apparentes, jouant un rôle important dans la transmission de linfection. Les mécanismes qui président à ces divers aspects de la pathogenèse des dermatophytoses, et en particulier de linfection par M. canis, restent très mal connus. La majeure partie des recherches effectuées jusquà ce jour concernent les nombreuses protéases sécrétées par les dermatophytes et potentiellement impliquées dans le dégradation de la kératine, si bien quun grand nombre dentre elles ont été caractérisées dun point de vue moléculaire et enzymatique. Chez M. canis, deux familles de gènes, codant respectivement pour des subtilases (SUBs) et des métalloprotéases (MEPs), ont été isolées (Brouta et al., 2002 ; Descamps et al., 2002 ; Jousson et al., 2004). Parmi leurs membres, SUB3 et MEP3 sont considérées comme de probables facteurs de virulence ; en effet, elles sont induites sur un milieu à base de poils de chats, exprimées in vivo, fortement kératinolytiques, et également immunogènes (Descamps et al., 2003a ; Brouta et al., 2003). Le premier objectif de ce travail est dévaluer limmunogénicité et le pouvoir protecteur de MEP3 sous forme recombinante, dans le cadre dun essai de vaccination chez le cobaye. Le second est didentifier et de caractériser chez M. canis une autre classe de protéases, les dipeptidyl peptidases (DPPs). Les gènes correspondants seront isolés et séquencés, ce qui permettra létude de leur expression in vivo et sur différents milieux in vitro. Les protéines encodées seront produites sous forme recombinante, afin de pouvoir entamer lanalyse de leurs propriétés enzymatiques et immunologiques. Enfin, étant donné que chaque facteur étudié ne peut être formellement impliqué dans la virulence du champignon quen passant par la construction de souches déficientes, le troisième but de ce doctorat est de mettre au point chez M. canis une technique dinactivation génique par lintermédiaire dARNs en épingle à cheveux, en utilisant comme cibles des gènes codant pour des protéases sécrétées. Résultats: Un vaccin expérimental anti-M. canis a été préparé en associant MEP3, obtenue sous forme recombinante dans la levure Pichia pastoris (rMEP3), à ladjuvant de Freund. Le vaccin a été administré à des cobayes, par voie sous-cutanée, trois fois à 15 jours dintervalle. La vaccination a induit une forte réponse en anticorps spécifiques, ainsi quune réponse lymphoproliférative envers MEP3. Toutefois, cette dernière est apparue comme transitoire, puisquelle nétait plus significative au moment de lépreuve dinfection. Celle-ci a eu lieu 7 semaines après la dernière vaccination. Lévolution clinique de linfection, ainsi que la persistance du champignon, ont été suivies de façon régulière et exprimées sous forme de scores clinique et mycologique attribués à chaque animal. Aucune différence significative na pu être mise en évidence entre les scores des animaux vaccinés et non vaccinés. La réponse en anticorps induite par linfection chez les animaux non vaccinés sest révélée nettement plus faible que celle induite par la vaccination ; la réponse lymphoproliférative observée après linfection était dintensité comparable entre animaux vaccinés et non vaccinés. Le vaccin à base de rMEP3 na donc pas été protecteur, malgré linduction dune importante réponse humorale et le recrutement de cellules T spécifiques. Dans le but didentifier de nouveaux immunogènes potentiels, et de compléter dans le même temps les connaissances relatives aux protéases sécrétées par M. canis, les gènes codant pour des dipeptidyl peptidases ont été isolés. Il sagit dexoprotéases libérant des dipeptides au niveau de lextrémité N-terminale des protéines et réparties en différentes classes suivant la nature de ce dipeptide et suivant leur localisation cellulaire. Deux gènes uniques, codant respectivement pour une DPPIV et une DPPV, ont pu être isolés, séquencés et caractérisés. Ils encodent des protéases de la famille S9 de protéases à sérine, possédant un peptide signal de sécrétion mais pas de séquence pro-, et possédant des sites de glycosylation. Les deux protéases sont à 90% identiques à leurs paralogues isolés chez Trichophyton rubrum (Monod et al., 2005), un dermatophyte fréquemment isolé lors de dermatophytose humaine. Elles sont également homologues aux DPPs dAspergillus fumigatus, qui ont été proposées comme facteurs de virulence potentiels (Beauvais et al., 1997a,b). La DPPIV de M. canis présente également un degré dhomologie élevé avec la DPPIV de la bactérie pathogène Porphyromonas gingivalis, qui est un facteur de virulence avéré (Kumagai et al., 2003), ainsi quavec le marqueur mammalien CD26, qui est une molécule multifonctionnelle participant à de nombreux processus biologiques et immunologiques (Boonacker et Van Noorden, 2003). Grâce à une technique de RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) en temps réel, une importante augmentation de lexpression des deux DPPs de M. canis a été mise en évidence lorsque le champignon est cultivé sur des milieux constitués de protéines de matrice extracellulaire, parmi lesquelles la kératine. Lexpression des DPPs a également été détectée in vivo, chez le chat et le cobaye, par RT-PCR nichée. Les deux protéases ont été produites sous forme recombinante dans la levure P. pastoris, et y sont enzymatiquement actives. Les DPPs recombinantes apparaissent sous forme dune bande à 83 kDa (DPPV) et dun doublet à 95 et 98 kDa (DPPIV), dont respectivement 5 kDa et 9 ou 12 kDa de glycosylation. Elles clivent les substrats préférentiels de leurs sous-familles enzymatiques, ce qui correspond dans le cas de la DPPIV aux liens de type Proline-X ; cette spécificité est très rarement rencontrée parmi les protéases. Alors quaucune des deux DPPs de M. canis nest à elle seule kératinolytique, limplication de la DPPIV dans la digestion du réseau de kératine a été testée en utilisant le substrat Keratin Azure (Sigma) et des surnageants de cultures de M. canis montrant une forte activité kératinolytique. La préincubation de ces surnageants avec un inhibiteur spécifique de DPPIV na eu aucun effet sur le niveau de solubilisation du substrat kératinisé. Ce résultat indique que lintervention potentielle de la DPPIV dans cette digestion a lieu uniquement en aval de la digestion par les endoprotéases. Ensuite, dans le but dévaluer la capacité de la DPPV dinduire une réponse cutanée de type DTH (Delayed Type Hypersensitivity), sa forme recombinante a été utilisée dans le cadre de tests dintradermoréaction chez des cobayes précédemment infectés par M. canis. La réaction sest avérée négative, contrairement à ce qui a été observé dans le cas de la DPPV de Trichophyton tonsurans chez lhomme. Toutefois, cette dernière a été utilisée sous sa forme native. Enfin, une technique dinactivation génique via lARN a été mise au point chez M. canis, en utilisant comme cibles les gènes codant pour SUB3 et DPPIV. Il sagit de la première mise en uvre de cette méthodologie chez les dermatophytes. La technique employée dérive du phénomène d « interférence à lARN » (RNA interference, RNAi), qui a lieu à proprement parler dans les cellules animales, mais équivaut à des voies similaires chez les autres types dorganismes, y compris les champignons (Nakayashiki, 2005). Linterférence à lARN a pour élément déclencheur un ARN double brin, qui entraîne la destruction enzymatique des ARN messagers de séquence identique. Chez les champignons filamenteux, cette voie est activée efficacement par un ARN en épingle à cheveux dune taille de 500 à 1000 bp. Nous avons donc conçu deux constructions codant pour de telles épingles à cheveux, dont les séquences correspondent respectivement à un fragment des gènes SUB3 et DPPIV. M. canis a ensuite été transformé, séparément, par chacune de ces constructions. Pour chaque gène cible, les souches fongiques générées ont présenté des degrés dinhibition variables, évalués par RT-PCR en temps réel et par mesure de lactivité enzymatique des protéines cibles dans les surnageants de culture des transformants. Les taux dactivité enzymatique résiduelle et dARN messager obtenus étaient respectivement de 3,3% et 2% pour SUB3, et de 45,6% et 1,5% pour DPPIV. La distribution des taux dinhibition génique entre 0% et plus de 95% est compatible avec les résultats détudes similaires chez dautres champignons filamenteux. En outre, dans le cas de latténuation de lexpression de SUB3, une analyse par électrophorèse SDS-PAGE du surnageant de culture dune souche fortement inhibée montre la disparition de la bande correspondant à SUB3, mais aussi de celle correspondant à SUB4, ce qui indique que le seul fragment interférant utilisé est potentiellement capable dinhiber plusieurs gènes de la même famille. Conclusions et perspectives: Aucune atténuation des symptômes de linfection par M. canis, ni de linvasion par le champignon, nest obtenue en vaccinant des cobayes avec rMEP3 associée à ladjuvant de Freund selon le protocole utilisé. Des résultats similaires ont été obtenus avec deux autres protéases recombinantes, SUB3 chez M. canis (Descamps et al., 2003b) et la hsp60 de T. rubrum (Raska et al., 2004). Or, le succès dun vaccin résulte à la fois des propriétés intrinsèques du ou des immunogènes quil contient, et de la stimulation sélective par son adjuvant des acteurs efficaces de la réponse immune. Deux options sont donc offertes pour de nouvelles recherches dans le domaine de la vaccination anti-M. canis et anti-dermatophytes. La première consiste à poursuivre la dissection de la réponse immune spécifique en étudiant les propriétés immunogènes de composants particuliers. Même si lélimination naturelle dune infection fongique relève généralement dune réponse effectrice cellulaire de type Th1, cette perspective va bien au-delà de la recherche dun facteur activant des lymphocytes Th1, ou rappelant une réponse de type DTH au niveau cutané. En effet, il est actuellement démontré que des anticorps de spécificité bien choisie peuvent être totalement protecteurs contre une infection fongique (Casadevall et al., 2002 ; Cassone, 2007). En outre, il ne faut pas perdre de vue que lélément fongique de base déterminant une réponse immune adéquate est lépitope (Woodfolk et al., 2000). Le répertoire dépitopes générés à partir dune protéase recombinante peut dailleurs être modifié par rapport à son homologue native (Engelhard et al., 2006), comme cela est suspecté pour rDPPV chez M. canis. Ce phénomène peut engendrer une altération des propriétés immunogènes natives, mais a contrario, une protéase recombinante ainsi modifiée peut devenir un outil pour identifier des motifs antigéniques dintérêt. La seconde voie possible vers lélaboration dun vaccin sûr et pleinement efficace est lutilisation de nouveaux adjuvants orientant la réponse immune de la même façon quune infection naturelle protectrice. Chez A. fumigatus, des oligonucléotides CpG associés à une protéine recombinante ont permis de protéger des souris contre une aspergillose invasive, en stimulant plusieurs composants de la réponse cellulaire de type Th1 (Bozza et al., 2002). La vaccination à base de cellules dendritiques polarisées par un contact avec A. fumigatus sest également montrée prometteuse dans un modèle murin daspergillose invasive (Bozza et al., 2004), cette technique pouvant être assimilée à lemploi dun adjuvant de nouvelle génération. Il est bien entendu que ces deux voies de recherche ne sexcluent pas mutuellement, et quun travail mené dans les deux directions sera sans doute nécessaire pour atteindre le but recherché. Les DPPIV et V de M. canis ont été caractérisées au niveau moléculaire, et exprimées sous forme recombinante active. Leurs propriétés ainsi que celles de différentes protéases homologues laissent supposer quelles jouent un rôle universel dans la digestion de substrats protéiques complexes, y compris les structures kératinisées, mais quelles pourraient en plus avoir acquis une ou plusieurs fonctions spécialisées dans le cadre de la relation hôte-parasite. Lune de ces fonctions pourrait être la modulation de la réponse immune, par exemple via le clivage de cytokines ou de chémokines, étant donné notamment sa similitude avec la DPPIV mammalienne ou CD26. Parallèlement, les DPPs sont peut-être aussi des immunogènes importants. Enfin, la DPPIV sécrétée par M. canis pourrait intervenir dans ladhérence aux protéines de matrice extracellulaire, ou encore dans la dégradation des tissus via lactivation de protéases de lhôte, comme cela a été démontré chez P. gingivalis (Kumagai et al., 2005). Plusieurs perspectives sont donc ouvertes quant à linvestigation de la fonction des DPPs des dermatophytes, et certaines pourront êtres rencontrées grâce aux formes recombinantes de ces protéines. Cependant, pour elles comme pour tous les autres facteurs fongiques susceptibles de contribuer à la pathogenèse des dermatophytoses, la construction de souches déficientes est un passage obligé vers la démonstration formelle de cette contribution. Ceci est maintenant réalisable rapidement, au moyen de constructions exprimant des ARN double brin interférants, même si de nombreuses améliorations peuvent sans doute être apportées à cette technique. Les souches déficientes au niveau de SUB3 et potentiellement des autres SUBs, ainsi que celles déficientes au niveau de DPPIV, seront prochainement évaluées quant à leur comportement dans un modèle dépiderme félin reconstitué mis au point dans notre laboratoire (Tabart et al., sous presse). Références: BEAUVAIS A., MONOD M., DEBEAUPUIS J.-P., DIAQUIN M., KOBAYASHI H., LATGE J.-P. Biochemical and antigenic characterization of a new dipeptidyl-peptidase isolated from Aspergillus fumigatus. J. Biol. Chem., 1997a, 272, 6238-44. BEAUVAIS A., MONOD M., WYNIGER J., DEBEAUPUIS J.-P., GROUZMANN E., BRAKCH N., SVAB J., HOVANESSIAN A.G., LATGE J.-P. Dipeptidyl-peptidase IV secreted by Aspergillus fumigatus, a fungus pathogenic to humans. Infect. Immun., 1997b, 65, 3042-7. BOONACKER E., VAN NOORDEN C.J. The multifunctional or moonlighting protein CD26/DPPIV. Eur. J. Cell Biol., 2003, 82, 53-73. BOZZA S., GAZIANO R., LIPFORD G.B., MONTAGNOLI C., BACCI A., DI FRANCESCO P., KURUP V.P., WAGNER H., ROMANI L. Vaccination of mice against invasive aspergillosis with recombinant Aspergillus proteins and CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants. Microbes Infect., 2002, 4, 1281-90. BOZZA S., MONTAGNOLI C., GAZIANO R., ROSSI G., NKWANYUO G., BELLOCCHIO S., ROMANI L. Dendritic cell-based vaccination against opportunistic fungi. Vaccine, 2004, 22, 857-64. BROUTA F., DESCAMPS F., MONOD M., VERMOUT S., LOSSON B., MIGNON B. Secreted metalloprotease gene family of Microsporum canis. Infect. Immun., 2002, 70, 5676-83. BROUTA F., DESCAMPS F., VERMOUT S., MONOD M., LOSSON B., MIGNON B. Humoral and cellular immune response to a Microsporum canis recombinant keratinolytic metalloprotease (r-MEP3) in experimentally infected guinea pigs. Med. Mycol., 2003, 41, 495-501. CASADEVALL A., FELDMESSER M., PIROFSKI L.A. Induced humoral immunity and vaccination against major human fungal pathogens. Curr. Opin. Microbiol., 2002, 5, 386-91. CASSONE A. Fungal vaccines and vaccination : problems and perspectives. In : Brown G.D., Netea M.G. (Eds), Immunology of fungal infections. Springer: Heidelberg, 2007, 465-485. DESCAMPS F., BROUTA F., MONOD M., ZAUGG C., BAAR D., LOSSON B., MIGNON B. Isolation of a Microsporum canis gene family encoding three subtilisin-like proteases expressed in vivo. J. Invest. Dermatol., 2002, 119, 830-5. DESCAMPS F., BROUTA F., VERMOUT S., MONOD M., LOSSON B., MIGNON B. Recombinant expression and antigenic properties of a 31.5-kDa keratinolytic subtilisin-like serine protease from Microsporum canis. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2003a, 38, 29-34. DESCAMPS F.F., BROUTA F., VERMOUT S.M., WILLAME C., LOSSON B.J., MIGNON B.R. A recombinant 31.5 kDa keratinase and a crude exo-antigen from Microsporum canis fail to protect against a homologous experimental infection in guinea pigs. Vet. Dermatol., 2003b, 14, 305-12. ENGELHARD V.H., ALTRICH-VANLITH M., OSTANKOVITCH M., ZARLING A.L. Post-translational modifications of naturally processed MHC-binding epitopes. Curr. Opin. Immunol., 2006, 18, 92-7. JOUSSON O., LÉCHENNE B., BONTEMS O., CAPOCCIA S., MIGNON B., BARBLAN J., QUADRONI M., MONOD M. Multiplication of an ancestral gene encoding secreted fungalysin preceded species differentiation in the dermatophytes Trichophyton and Microsporum. Microbiology, 2004, 150, 301-10. KUMAGAI Y., YAJIMA A., KONISHI K. Peptidase activity of dipeptidyl aminopeptidase IV produced by Porphyromonas gingivalis is important but not sufficient for virulence. Microbiol. Immunol., 2003, 47, 735-43. KUMAGAI Y., YAGISHITA H., YAJIMA A., OKAMOTO T., KONISHI K. Molecular mechanism for connective tissue destruction by dipeptidyl aminopeptidase IV produced by the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun., 2005, 73, 2655-64. MONOD M., LÉCHENNE B., JOUSSON O., GRAND D., ZAUGG C., STÖCKLIN R., GROUZMANN E. Aminopeptidases and dipeptidyl-peptidases secreted by the dermatophyte Trichophyton rubrum. Microbiology, 2005, 151, 145-55. NAKAYASHIKI H. RNA silencing in fungi: mechanisms and applications. FEBS Lett., 2005, 579, 5950-7. RASKA M., RYBNIKAR A., CHUMELA J., BELAKOVA J., WEIGL E. Recombinant protein and DNA vaccines derived from hsp60 Trichophyton mentagrophytes control the clinical course of trichophytosis in bovine species and guinea-pigs. Mycoses, 2004, 47, 407-417. TABART J., BALDO A., VERMOUT S., NUSGENS B., LAPIERE C., LOSSON B., MIGNON B. Reconstructed interfollicular feline epidermis as a model for Microsporum canis dermatophytosis. J. Med. Microbiol., sous presse. WOODFOLK J.A., SUNG S.S., BENJAMIN D.C., LEE J.K., PLATTS-MILLS T.A.. Distinct human T cell repertoires mediate immediate and delayed-type hypersensitivity to the Trichophyton antigen, Tri r 2. J. Immunol., 2000, 165, 4379-87. Publications issues du travail de thèse: VERMOUT S., DENIS M., LOSSON B., MIGNON B. Choix d'un adjuvant lors d'essais de vaccination. Ann. Med. Vet., 2003, 147, 393- 40. VERMOUT S.M., BROUTA F.D., DESCAMPS F.F., LOSSON B.J., MIGNON B.R. Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of a Microsporum canis metalloprotease subunit vaccine in guinea pigs. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2004, 40, 75-80. VERMOUT S., TABART J., BALDO A., MONOD M., LOSSON B., MIGNON B. RNA silencing in the dermatophyte Microsporum canis. FEMS Microbiol. Lett., sous presse. VERMOUT S., TABART J., BALDO A., LOSSON B., MIGNON B. Pathogenesis of dermatophytoses. Mycopathologia, soumis pour publication. VERMOUT S., BALDO A., TABART J., LOSSON B., MIGNON B. Secreted dipeptidyl peptidases as potential virulence factors for Microsporum canis. Soumis pour publication. Remerciements: Fonds pour la formation à la Recherche dans lIndustrie et lAgriculture (F.R.I.A.) Fonds pour la Recherche Scientifique et Médicale (F.R.S.M.) Patrimoine de lUniversité de Liège