Würzburg, Univ., Diss., 2009.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Universiẗat, Diss., 2005--Würzburg.

Thesis (Ph.D.) - University of St Andrews, June 2009.

Thesis (Ph.D.)--Brown University, 2005. / Vita. Thesis advisor: Christine A. Biron. Includes bibliographical references (leaves 32-41, 62-65, 90-93, 118-123, 154-159). Also available online.

Köln, University, Diss., 2002.

Techn. Universiẗat, Diss., 2004--Berlin.

University, Diss., 2005--München.

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Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T15:23:18Z No. of bitstreams: 1 Bruno Jorge de Andrade Silva - Dissertação.pdf: 1851059 bytes, checksum: 06d67aad491cb40940d3c20bf2ff6bbd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T15:23:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Jorge de Andrade Silva - Dissertação.pdf: 1851059 bytes, checksum: 06d67aad491cb40940d3c20bf2ff6bbd (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica que pode se manifestar em diferentes formas clínicas e há evidências de que o estabelecimento das diferentes formas clínicas seja direcionado por mecanismos inatos da resposta imune. Os macrófagos de pacientes tuberculóides (BT) e lepromatosos (LL) parecem ter um comportamento diferente em relação à bactéria. Enquanto nos pacientes LL são encontrados macrófagos altamente parasitados, em BT poucos ou raros bacilos são encontrados. O IFNγ é capaz de ativar diversos mecanismos microbicidas nos macrófagos, entre eles a autofagia. Estudos de microscopia eletrônica demonstraram a presença de fagossomos com dupla membrana em macrófagos expostos ao M. leprae, o que sugere um possível envolvimento da autofagia na modulação da resposta. No presente estudo foi avaliado o papel da autofagia na resposta imune ao M. leprae através de estudos utilizando a linhagem monocítica THP- 1, monócitos de indivíduos saudáveis e macrófagos de pacientes LL e BT. A análise ultraestrutural de lesões de pele de pacientes LL e BT mostrou haver um número maior de autofagossomos em células de lesão de paciente BT quando comparado aos de LL e tecido normal. A análise por imunoperoxidase ou Western blotting revelou uma maior expressão tecidual do marcador de autofagossomos LC3 nos pacientes BT, quando comparados aos LL. Adicionalmente, foi observado um aumento na expressão de LC3 em macrófagos obtidos ex vivo de paciente BT, na presença ou não de IFNγ. A estimulação com o M. leprae foi capaz de induzir a autofagia nos macrófagos THP-1, mas não de forma dose dependente. O tratamento com IFNγ em células previamente estimuladas com o M. leprae foi capaz de aumentar a expressão de LC3 em relação aos estímulos sozinhos, ou ao controle, em monócitos e macrófagos THP-1. O pré-tratamento com os inibidores autofágicos wortmanina ou 3-metiladenina foi capaz de reduzir a expressão de LC3 induzida por IFNγ. O IFNγ promoveu a co-localização M. leprae-LC3 nos macrófagos, mas não na presença da wortmanina. Em adição, na presença de ambos IFNγ e M. leprae, houve uma maior expressão de Atg3, a enzima responsável pela lipidação de LC3. A indução de autofagia com IFNγ foi capaz de aumentar a secreção das citocinas próinflamatórias IL-6, IL-12p40 e TNF em macrófagos THP-1. O IFNγ, em células previamente estimuladas com o M. leprae, foi capaz de aumentar a secreção de IL-15 em relação aos estímulos sozinhos ou ao controle, mas não a secreção de IL-10. O bloqueio da autofagia com 3-metiladenina levou à redução dos níveis de IL-15 em resposta ao estímulo com IFNγ e M. leprae, mas também não afetou a produção de IL-10. Adicionalmente, o tratamento com IFNγ foi capaz de reduzir o percentual de associação do M. leprae aos macrófagos THP-1. Em conjunto, esses dados indicam que em macrófagos estimulados com M. leprae, a citocina IFN induz a produção de citocinas pró-inflamatórias, entre elas a IL-15, que contribuem para o aumento da atividade microbicida da célula hospedeira através da indução de autofagia. Tais achados podem contribuir para a maior compreensão dos mecanismos associados à imunopatogênese da hanseníase. / Leprosy is a chronic infectious disease that can present different clinical forms and there is evidence that the establishment of different clinical forms is driven by host innate mechanisms. Macrophages from tuberculoid (BT) and lepromatous (LL) patients seem to have a different behavior in relation to the bacteria. While in LL patients there are highly infected macrophages, in BT rare or few bacilli are found. IFNγ can activate various microbicidal mechanisms in macrophages, including autophagy. Electron microscopy studies showed the presence of phagosomes with double membrane in macrophages exposed to M. leprae, suggesting a possible involvement of autophagy in the immunomodulatory response. In the present study we evaluated the role of autophagy in the immune response to M. leprae through studies using the THP-1 monocytic cell line and monocytes from healthy subjects and LL and BT macrophages. Ultrastructural analysis of skin lesions of LL and BT patients showed a higher number of autophagosomes in cells from skin lesions of BT patient compared to LL patient or normal tissue. Immunoperoxidase or Western blotting analysis revealed a greater tissue expression of the autophagosome marker LC3 in BT patients when compared with LL. Additionally, there was an increase on LC3-punctae expression in ex vivo macrophages from BT patient, in the presence or absence of IFNγ. M. leprae stimulation induced autophagy in THP-1 macrophages but not in a dose dependent manner. IFNγ treatment in M. leprae-stimulated cells increased LC3-punctae expression compared with stimuli alone or non-stimulated monocytes and THP-1 macrophages. The pre-treatment with autophagic inhibitors wortmannin or 3-methyladenine was able to reduce IFNγ-induced LC3 expression. IFNγ treatment promotes M. leprae-LC3 colocalization in THP-1 macrophages, but did not in the presence of wortmannin. In addition, in the presence of both IFNγ and M. leprae, there was a higher expression of Atg3, the enzyme responsible for LC3 lipidation. Autophagy induction with IFNγ increased the secretion of proinflammatory cytokines IL-6, IL-12p40 and TNF in THP-1 macrophages. IFNγ treatment in M. lepraestimulated cells was able to increase IL-15 secretion in relation to non-stimulated cells, but not IL-10. Autophagic blockage by 3-methyladenine led to decreased IL-15 levels in response to stimulation with IFNγ and M. leprae, but did not affect the IL-10 production. In addition, IFNγ treatment led to reduction on macrophage-M. leprae association. Together, these data indicate that in M. leprae-stimulated macrophages, IFNγ induces the production of proinflammatory cytokines including IL-15, which contribute to host cell increase in microbicidal activity by autophagy induction. These findings may contribute to a better understanding of the mechanisms associated with leprosy immunopathogenesis.