Tripsinas e quimotripsinas, enzimas pertencentes à classe das serina proteinases, são as principais enzimas proteolíticas digestivas presentes no intestino médio de insetos de diversas ordens. Entretanto, enzimas de diferentes insetos possuem propriedades cinéticas distintas, sendo os motivos dessas diferenças especulados. Precipitações por sulfato de amônio das tripsinas de Tenebrio molitor, Diatraea saccharalis e Spodoptera frugiperda mostram que insetos Lepidópteros possuem serina proteinases mais hidrofóbicas, que foi confirmado através de cromatografias de interação hidrofóbica e da análise de acesso do solvente às superfícies protéicas em modelagens tridimensionais de seqüências. Tal fato está relacionado à formação de oligômeros e resistência a defesas de plantas. Inativações por TPCK mostram que quimotripsinas digestivas de S. frugiperda, inseto polífago, reagem duas ordens de grandeza mais lentamente e possui um deslocamento do pH ótimo de modificação em mais de uma unidade quando comparada com dos outros dois organismos, fato relacionado à resistência a cetonas presentes em diversas plantas. A tripsina digestiva de Periplaneta americana foi purificada e microsseqüenciada, resultando na seqüência VSPAFSYGTG e associada a um alérgeno (denominado PaTry), expresso nos cecos e na região anterior do ventrículo. O anticorpo anti-tripsina de M. domestica reconheceu apenas uma banda no intestino de P. americana e foi utilizado para imunocitolocalizar tripsinas nos tecidos epiteliais, demonstrando que esta é secretada por exocitose nos cecos e na região anterior do ventrículo, como esperado. Por último, a atividade majoritária de quimotripsina se localiza surpreendentemente na região posterior do ventrículo de M. domestica. Apesar disso, apenas 28% dessa atividade é perdida através das fezes, pois 31% da atividade enzimática se encontra firmemente aderida à membrana, e 41% na fração celular solúvel (associada ao glicocálice), sendo a atividade solúvel luminal correspondente a apenas 12%, indicando a existência de pelo menos duas espécies moleculares distintas, uma solúvel e uma aderida à membrana, comprovado inativações térmicas das duas atividades (solúvel e aderida à membrana) na presença e na ausência de Triton X-100, sendo que a atividade aderida à membrana apresentou uma maior meia vida com uma cinética de primeira ordem nos dois casos. Ensaio em gel demonstrou que o homogeneizado possui apenas uma banda de atividade quimotríptica de 30 kDa. A atividade solúvel majoritária foi purificada até a homogeneidade, apresentando uma banda de 30 kDa em SDS-PAGE, pH ótimo de 7,4 e é 90% inativada por TPCK 0,1 mM em pH 8,5 em 15 min. Ela prefere substratos contendo Phe em P1, apesar clivar substratos contendo Tyr e Leu. Uma seqüência contígua similar a quimotripsina foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de M. domestica, formada por 71 ESTs (de 826 seqüências obtidas ao acaso), indicando que esta deve corresponder à atividade majoritária. Essa seqüência, denominada MdChy1, prediz uma proteína madura de 28.639,2 Da e foi clonada e expressa de maneira recombinante em E. coli BL21 (DE-3) Star, sendo utilizada para produção de anticorpos policlonais em coelhos, que reconheceram uma banda de 30 kDa no ventrículo anterior e posterior, mas não no médio. Esses anticorpos foram utilizados para imunomarcações e reconheceram proteínas no lúmem, nas microvilosidades e em pequenas vesículas do epitélio, demonstrando que a quimotripsina é secretada ao lúmem por exocitose e indicando que o MdChy1 corresponde à atividade majoritária de quimotripsina. Análises de expressão em M. domestica indicam a existência de dois conjuntos de serina proteinases digestivas, um expresso na região anterior e um segundo na região posterior do ventrículo. O MdChy1 é expresso na região posterior, local em que se encontra a atividade majoritária de quimotripsina. Uma reconstrução filogenética dos genes similares a quimotripsinas de Drosophila melanogaster e de M. domestica demonstram que a MdChy1 se agrupa com genes expressos no intestino médio, portanto, com função digestiva. / Trypsins and chymotrypsins, serine proteinases enzymes, are the major proteolytic activities present in the midgut of insects. However, enzymes obtained from different insects present different kinetic properties, and the reason for the differences are speculated. Trypsin precipitation of Tenebrio molitor, Diatraea saccharalis and Spodoptera frugiperda with ammonium sulfate showed that Lepidopteran insects possess serine proteinases with a higher superficial hydrophobicity than insects belonging to other orders, which may be associated to oligomerization of enzymes and resistance to inhibitors present in the food. This was confirmed by hydrophobic interaction chromatography and analysis of solvent access to serine proteinases surface. Moreover, inactivations of chymotrypsins by TPCK showed that S. frugiperda chymotrypsins react one order slower and has an optimum pH of modification more than 1 unit higher than chymotrypsins of D. saccharalis and T. molitor, which was related with the resistance of the enzyme to the presence of plant ketones, since S. frugiperda is a polyphagous organism. The digestive trypsin from Periplaneta americana midgut was purified microssequenced, resulting in the sequence VSPAFSYGTG, coincident to the MPA3 allergen (named PaTry), which is expressed in the caeca and anterior ventriculus. Western blot using M. domestica trypsin antisera recognized a single band, and immunohistochemical assays using this antisera showed that the P. americana trypsin is secreted by exocitosys in caeca and anterior ventriculus, which is coincident to the expression data. Although the major M. domestica chymotrypsin activity is present in the posterior ventriculus, only 28% of the activity is lost in feces, because 31% of activity is membrane-bound, and 41% is in the cellular soluble fraction (glycocalix-associated), and only 12% of total activity is soluble in the lumen, indicating the existence of at least two molecular species of chymotrypsins. Thermal inactivations of both activities (soluble and membrane-bound) showed that they may represent two different molecular enzymes, since the membrane-bound activity has a higher half-life than the soluble both in the presence and in the absence of Triton X-100. Both activities presented a linear first-order inactivation kinetic. In gel assays showed the presence of only one activity band in the midgut of 30 kDa. The major soluble activity was purified through one affinitychromatography, and active fractions presented a single 30 kDa band, a optimum pH of 7.4 and was 90% modified by TPCK 0.1 mM at pH 8.5 during 15 min. This enzyme preferentially cleaves substrates containing Phe residues in P1, although it cleaves substrates containing Tyr and Leu. A contig of a chymotrypsin-like sequence was randomly obtained from a cDNA library of M. domestica midguts from 71 ESTs (a total of 826 sequences), indicating that this sequence corresponds to the major activity present in the lumen. This sequence, named MdChy1, predicted a protein with 28639.2 Da which was cloned, recombinantly expressed in E. coli BL21 (DE-3) Star, this recombinant MdChy1 was used to raise polyclonal antibodies in rabbit. A western blot using this antisera recognised a single band in the anterior and posterior ventriculus, but not in the middle. Imunno-gold labeling of epithelium marked proteins in the lumen, at the microvilli and inside small vesicles, demonstrating that chymotrypsin is secreted through exocytosis in M. domestica and reinforcing that MdChy1 corresponds to the major chymotryptic activity found in the midgut. A semi-quantitative RT-PCR of M. domestica serine proteinase-like genes demonstrated that there are two set of genes, one expressed in the anterior and another in the posterior ventriculus, as visualized in western blot. MdChy1 is expressed in the posterior ventriculus, where the major chymotryptic activity is found. A phylogenetic reconstruction of Drosophila melanogaster chymotrypsin-like sequences and M. domestica chymotrypsins showed that MdChy1 branched with sequences expressed in midgut, thus coding proteins involved in digestion.

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder, Clovis Andrade Neves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T19:24:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cruz_LilianCota_M.pdf: 6744301 bytes, checksum: 728821086751ef70a46cd6df9152a7a4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As abelhas são insetos holometábolos, pois apresentam metamorfose completa. Na metamorfose destes insetos, o trato gastrointestinal é completamente remodelado. Poucos estudos enfatizam os aspectos que envolvem a reconstituição do epitélio do intestino médio de abelhas durante a metamorfose. Os trabalhos que destacam a proliferação das células digestivas durante a metamorfose carecem de documentação das figuras de mitose. O presente trabalho contribui para o conhecimento da biologia dos Hymenoptera, gerando dados que possam esclarecer aspectos da fisiologia digestiva durante a metamorfose dos insetos sociais. Comprovamos a necessidade de aumento do número de células digestivas do intestino médio de Melipona quadrifasciata anthidioides ao final da metamorfose sem, contudo, observar figuras de mitose que comprovassem a proliferação destas células, como notado em Nasutitermes rotundatus (Holmgren) (Isoptera). É possível que as células regenerativas tenham origem externa ao intestino médio e migrem através da membrana basal para se estabelecerem no epitélio. Além disso, nesse trabalho descrevemos a morfologia do epitélio do intestino médio com auxílio da microscopia eletrônica de varredura, demonstrando que somente a membrana peritrófica diferiu entre as castas / Abstract: Bees are holometabolus insects, since they present complete metamorphosis. During the metamorphosis of the insects the gut is completely remodeled. Few studies emphasize aspects of the renewal of the epithelium of bee¿s midgut during metamorphosis. Studies that describe digestive cell proliferation are lacking in images of mitosis. This research is a contribution to the understanding of Hymenoptera biology in relation to some aspects of digestive physiology during metamorphosis of social insects. We have established the necessity of increasing the number of cells in the median intestine of Melipona quadrifasciata anthidioides at the end of metamorfosis without having, however, observed mitosis, as was found for Nasutitermes rotundatus (Holmgren) (Isoptera). Possibly the regenerative cells arisen outside the midgut migrated through the basal membrane, to establish themselves in the epithelium. Also, in this study we describe the morphology of the median intestine epithelium, using scanning electron microscopy, showing that only the peritrophic membrane presented differences in the casts studied. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Tripsinas e quimotripsinas, enzimas pertencentes à classe das serina proteinases, são as principais enzimas proteolíticas digestivas presentes no intestino médio de insetos de diversas ordens. Entretanto, enzimas de diferentes insetos possuem propriedades cinéticas distintas, sendo os motivos dessas diferenças especulados. Precipitações por sulfato de amônio das tripsinas de Tenebrio molitor, Diatraea saccharalis e Spodoptera frugiperda mostram que insetos Lepidópteros possuem serina proteinases mais hidrofóbicas, que foi confirmado através de cromatografias de interação hidrofóbica e da análise de acesso do solvente às superfícies protéicas em modelagens tridimensionais de seqüências. Tal fato está relacionado à formação de oligômeros e resistência a defesas de plantas. Inativações por TPCK mostram que quimotripsinas digestivas de S. frugiperda, inseto polífago, reagem duas ordens de grandeza mais lentamente e possui um deslocamento do pH ótimo de modificação em mais de uma unidade quando comparada com dos outros dois organismos, fato relacionado à resistência a cetonas presentes em diversas plantas. A tripsina digestiva de Periplaneta americana foi purificada e microsseqüenciada, resultando na seqüência VSPAFSYGTG e associada a um alérgeno (denominado PaTry), expresso nos cecos e na região anterior do ventrículo. O anticorpo anti-tripsina de M. domestica reconheceu apenas uma banda no intestino de P. americana e foi utilizado para imunocitolocalizar tripsinas nos tecidos epiteliais, demonstrando que esta é secretada por exocitose nos cecos e na região anterior do ventrículo, como esperado. Por último, a atividade majoritária de quimotripsina se localiza surpreendentemente na região posterior do ventrículo de M. domestica. Apesar disso, apenas 28% dessa atividade é perdida através das fezes, pois 31% da atividade enzimática se encontra firmemente aderida à membrana, e 41% na fração celular solúvel (associada ao glicocálice), sendo a atividade solúvel luminal correspondente a apenas 12%, indicando a existência de pelo menos duas espécies moleculares distintas, uma solúvel e uma aderida à membrana, comprovado inativações térmicas das duas atividades (solúvel e aderida à membrana) na presença e na ausência de Triton X-100, sendo que a atividade aderida à membrana apresentou uma maior meia vida com uma cinética de primeira ordem nos dois casos. Ensaio em gel demonstrou que o homogeneizado possui apenas uma banda de atividade quimotríptica de 30 kDa. A atividade solúvel majoritária foi purificada até a homogeneidade, apresentando uma banda de 30 kDa em SDS-PAGE, pH ótimo de 7,4 e é 90% inativada por TPCK 0,1 mM em pH 8,5 em 15 min. Ela prefere substratos contendo Phe em P1, apesar clivar substratos contendo Tyr e Leu. Uma seqüência contígua similar a quimotripsina foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de M. domestica, formada por 71 ESTs (de 826 seqüências obtidas ao acaso), indicando que esta deve corresponder à atividade majoritária. Essa seqüência, denominada MdChy1, prediz uma proteína madura de 28.639,2 Da e foi clonada e expressa de maneira recombinante em E. coli BL21 (DE-3) Star, sendo utilizada para produção de anticorpos policlonais em coelhos, que reconheceram uma banda de 30 kDa no ventrículo anterior e posterior, mas não no médio. Esses anticorpos foram utilizados para imunomarcações e reconheceram proteínas no lúmem, nas microvilosidades e em pequenas vesículas do epitélio, demonstrando que a quimotripsina é secretada ao lúmem por exocitose e indicando que o MdChy1 corresponde à atividade majoritária de quimotripsina. Análises de expressão em M. domestica indicam a existência de dois conjuntos de serina proteinases digestivas, um expresso na região anterior e um segundo na região posterior do ventrículo. O MdChy1 é expresso na região posterior, local em que se encontra a atividade majoritária de quimotripsina. Uma reconstrução filogenética dos genes similares a quimotripsinas de Drosophila melanogaster e de M. domestica demonstram que a MdChy1 se agrupa com genes expressos no intestino médio, portanto, com função digestiva. / Trypsins and chymotrypsins, serine proteinases enzymes, are the major proteolytic activities present in the midgut of insects. However, enzymes obtained from different insects present different kinetic properties, and the reason for the differences are speculated. Trypsin precipitation of Tenebrio molitor, Diatraea saccharalis and Spodoptera frugiperda with ammonium sulfate showed that Lepidopteran insects possess serine proteinases with a higher superficial hydrophobicity than insects belonging to other orders, which may be associated to oligomerization of enzymes and resistance to inhibitors present in the food. This was confirmed by hydrophobic interaction chromatography and analysis of solvent access to serine proteinases surface. Moreover, inactivations of chymotrypsins by TPCK showed that S. frugiperda chymotrypsins react one order slower and has an optimum pH of modification more than 1 unit higher than chymotrypsins of D. saccharalis and T. molitor, which was related with the resistance of the enzyme to the presence of plant ketones, since S. frugiperda is a polyphagous organism. The digestive trypsin from Periplaneta americana midgut was purified microssequenced, resulting in the sequence VSPAFSYGTG, coincident to the MPA3 allergen (named PaTry), which is expressed in the caeca and anterior ventriculus. Western blot using M. domestica trypsin antisera recognized a single band, and immunohistochemical assays using this antisera showed that the P. americana trypsin is secreted by exocitosys in caeca and anterior ventriculus, which is coincident to the expression data. Although the major M. domestica chymotrypsin activity is present in the posterior ventriculus, only 28% of the activity is lost in feces, because 31% of activity is membrane-bound, and 41% is in the cellular soluble fraction (glycocalix-associated), and only 12% of total activity is soluble in the lumen, indicating the existence of at least two molecular species of chymotrypsins. Thermal inactivations of both activities (soluble and membrane-bound) showed that they may represent two different molecular enzymes, since the membrane-bound activity has a higher half-life than the soluble both in the presence and in the absence of Triton X-100. Both activities presented a linear first-order inactivation kinetic. In gel assays showed the presence of only one activity band in the midgut of 30 kDa. The major soluble activity was purified through one affinitychromatography, and active fractions presented a single 30 kDa band, a optimum pH of 7.4 and was 90% modified by TPCK 0.1 mM at pH 8.5 during 15 min. This enzyme preferentially cleaves substrates containing Phe residues in P1, although it cleaves substrates containing Tyr and Leu. A contig of a chymotrypsin-like sequence was randomly obtained from a cDNA library of M. domestica midguts from 71 ESTs (a total of 826 sequences), indicating that this sequence corresponds to the major activity present in the lumen. This sequence, named MdChy1, predicted a protein with 28639.2 Da which was cloned, recombinantly expressed in E. coli BL21 (DE-3) Star, this recombinant MdChy1 was used to raise polyclonal antibodies in rabbit. A western blot using this antisera recognised a single band in the anterior and posterior ventriculus, but not in the middle. Imunno-gold labeling of epithelium marked proteins in the lumen, at the microvilli and inside small vesicles, demonstrating that chymotrypsin is secreted through exocytosis in M. domestica and reinforcing that MdChy1 corresponds to the major chymotryptic activity found in the midgut. A semi-quantitative RT-PCR of M. domestica serine proteinase-like genes demonstrated that there are two set of genes, one expressed in the anterior and another in the posterior ventriculus, as visualized in western blot. MdChy1 is expressed in the posterior ventriculus, where the major chymotryptic activity is found. A phylogenetic reconstruction of Drosophila melanogaster chymotrypsin-like sequences and M. domestica chymotrypsins showed that MdChy1 branched with sequences expressed in midgut, thus coding proteins involved in digestion.

Orientador: Flavio Henrique Caetano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T03:36:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_GiovanaAndressaTomaino_D.pdf: 12559217 bytes, checksum: 64524c3f699037f78f61a1a662484f1e (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Acutisoma (=G.) longipes Roewer, 1913 (Arachnida: Opiliones) é uma espécie de opilião pertencente à sub-ordem Laniatores. As fêmeas da espécie passam por um jejum durante o período de cuidados com a prole. Assim fêmeas sem ovos maduros, com ovos maduros e cuidando da prole foram coletadas e os ventrículos e ovário analisados com técnicas histológicas (hematoxilina-eosina), histoquímica para proteínas totais (azul de bromofenol e xilydine ponceau), polissacarídeos (PAS), proteínas colágenas (Picrosirius red) e proteínas ácidas (azul de toluidina), Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e citoquímica ultra-estrutural para glicogênio. Histologicamente o ventrículo é formado de células digestivas e generativas. As primeiras têm características de células secretoras, com acúmulo citoplasmático de grânulos protéicos ácidos, formação e liberação de vesículas granulares para o lúmen. O ventrículo sofre retração e ocorre a diminuição de vesículas citoplasmáticas de secreção entre a fase em que a fêmea se alimenta e não tem ovos maduros para a fase em que permanece algum tempo em jejum e cuida da prole. O corpo gorduroso que circunda o ventrículo é considerado tecido de estocagem, dando suporte ao metabolismo do aparelho digestivo. Ultraestruturalmente, distinguem-se três tipos de células no epitélio ventricular, as células digestivas, que provavelmente tornam-se células excretoras, e as secretoras, sendo as células excretoras escassas em fêmeas com prole. Em Acutisoma longipes, as células generativas ou de reposição têm núcleos grandes e pouco citoplasma não especializado, podendo se diferenciar ou em células digestivas, secretoras ou células de excreção. O ovário das fêmeas na fase de cuidados com a prole apresenta camada de células epiteliais que também sofre retração, assim como ocorre no ventrículo no mesmo período fisiológico deste. Tais observações são constatadas com a MET, com a qual é evidente o estreitamento parcial do lúmen. Ovário caracteriza-se pela presença de ovócitos em toda sua extensão e pela ausência de células nutridoras. Todos os graus de desenvolvimento dos ovócitos podem ser encontrados nas três fases de fêmeas estudadas. Isto demonstra ser a ovogênese um processo dinâmico e contínuo. Ovócitos sendo reabsorvidos são comuns na última fase (de cuidados com a prole) quando o tempo de jejum já é longo. A reabsorção de nutrientes de ovócitos pode ser nesse caso, para suprir o déficit nutricional e energético das fêmeas em jejum (cuidando da prole) até o momento que a cria é emancipada e a fêmea volta a se alimentar, e posteriormente entrar ou não em novo ciclo reprodutivo. / Abstract: Acutisoma (=G.) longipes Roewer, 1913 (Arachnida: Opiliones) is a harvestmen of the suborder Laniatores. Females of this species do not feed while tending the brood care. In this study, females without mature eggs, with mature eggs, and tending the brood care were collected, and the ventriculi and ovaries were examined using histological techniques (hematoxylin-eosin), histochemistry for total proteins (bromophenol blue and xylidine ponceau), polysaccharides (PAS), collagenous proteins (picrosirius red) and acidic proteins (toluidine blue), transmission electron microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM), ultrastructural cytochemistry for glycogen. Histologically, the ventriculus consists of digestive cells and regenerative cells. The former exhibit characteristics of secretory cells, with granules of acidic proteins in the cytoplasm, forming vesicles containing granules and releasing them into the lumen. From the phase when the female feeds and does not carry mature eggs to the phase when she tends the brood and does not feed the ventriculus retracts and the amount of cytoplasmic secretory vesicles decreases. The fat body was observed surrounding the ventriculus. The fat body is considered an energy storage tissue, supporting the digestive system metabolism. Three different cell types were observed in the ventricular epithelium: Digestive cells, which probably become excretory cells, and secretory cells. Excretory cells are not abundant in females tending the brood. In A. longipes, regenerative cells have large nuclei and little undifferentiated cytoplasm, and can later be specialized to carry out digestive, secretory or excretory functions. The ovary of females in these phases exhibit a layer of epithelial cells and this organ also retracts similar to what is observed in the ventriculus, with a partial narrowing of the lumen. The presence of oocytes is characteristics of the ovary throughout its extension, as well as the absence of nurse cells. Young oocytes and these in other developmental stages are observed in females during the three phases examined, indicating that oogenesis is a dynamic and continuous process. Oocytes being reabsorbed are common in the brood care phase when the starving period is long. The resorption of nutrients from ooctyes in this case might reduce the nutritional and energetic deficit until emancipation of the brood when the female can feeding again and possibly begin a new reproductive cycle. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural