Les Iron Regulatory Proteins 1 (IRP1/2) sont des protéines cytosoliques qui contrôlent l’homéostasie du fer chez les mammifères. Elles régulent la concentration de fer intracellulaire au niveau post-transcriptionnel, en interagissant spécifiquement avec des motifs appelés iron responsive élément (IREs). Ces motifs sont localisés dans les régions non traduites des ARNm codant notamment pour la ferritine (Ft), la ferroportine (Fpn) et le récepteur de la transferrine (TfR1). L’IRP1 est une protéine bifonctionnelle, majoritairement exprimée sous une forme contenant un centre [4Fe-4S] qui présente une activité aconitase. Les deux activités de l’IRP1 (aconitase/trans-régulateur) s’excluent mutuellement par la présence ou non du centre Fe-S. L’IRP2 est exprimée constitutivement sous une forme liant les IREs. Le monoxyde d’azote (NO), une importante molécule de signalisation impliquée dans les défenses immunitaires, cible le centre Fe-S de l’IRP1 et permet la conversion de l’IRP1 de sa forme aconitase vers sa forme liant les séquences IREs. Il a également été rapporté que l’IRP2 détecterait NO, cependant la fonction intrinsèque de l’IRP1 et de l’IRP2 dans le contrôle du métabolisme du fer intracellulaire en réponse à NO reste à ce jour non élucidée. Dans cette étude, nous avons identifié le régulateur principal du métabolisme du fer intracellulaire en réponse à NO, en utilisant des modèles de souris déficients pour les gènes IRP1 et/ou IRP2 et testé la contribution de la tension en oxygène dans cette régulation. Ainsi, nous avons exposé des macrophages primaires issus de la moelle osseuse de souris Irp1-/-, Irp2-/- et de souris Irp1-/- Irp2-/- de la lignée macrophagique à une source de NO, sous différentes tensions en oxygène. Les activités IRPs, l’expression des gènes Ft, Fpn et TfR1 ainsi que l’activité d’une protéine à centre Fe-S (l’aconitase mitochondriale) ont été mesurées après fractionnement cellulaire. Nous avons montré qu’en normoxie, la conversion de l’aconitase cytosolique en apo-IRP1 par NO est entièrement responsable de la régulation post-transcriptionnelle des ferritines (L-Ft et H-Ft), de la Fpn et du TfR1. En augmentant le transport du fer intracellulaire et en diminuant le stockage et l’export, l’activation de l’IRP1 par NO servirait à maintenir des taux de fer intracellulaire suffisants pour alimenter la biogenèse des centres Fe-S après l’arrêt des flux de NO. En effet, nous observons une restauration efficace de l’activité de l’aconitase mitochondriale dans les macrophages de souris sauvage alors qu’elle est bloquée dans les macrophages de souris Irp1-/-. De plus, l’IRP1 activée par NO, permet également de diminuer les taux de L- et H-Ft, anormalement élevée dans les macrophages de souris Irp2-/-. Nous montrons que le NO endogène active l’IRP1 sous sa forme trans-régulatrice alors qu’il tend à diminuer l’activité de l’IRP2. Néanmoins, l’IRP1 reste le régulateur principal des ferritines en conditions de normoxie. En condition hypoxique, les deux IRPs semble coopérer pour inhiber la traduction des ferritines car dans les macrophages Irp1-/-exposés à NO, l’IRP2 stabilisée est suffisante pour inhiber la traduction de la L- et H-Ft et ceci malgré l’activation transcriptionnelle des gènes de la L- et H-Ft. Concernant la régulation du TfR1 par NO et en hypoxie, TfR1 est principalement régulé par une voie transcriptionnelle dominant largement la voie post-transcriptionnelle impliquant l’IRP1. Le facteur de transcription HIF-1 alpha pourrait être le régulateur critique dans cette régulation. En conclusion, nous montrons dans cette étude, comment le regulon IRP participe à la régulation du métabolisme du fer intracellulaire en réponse à NO et son étroite connexion avec la concentration en oxygène. Nos résultats soulignent l’importance d’explorer davantage le rôle de l’IRP1 dans des situations inflammatoires in vivo, où les tissus peuvent être exposé à un microenvironnement non hypoxique. / Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) and 2 (IRP2) are two cytosolic regulators of mammalian cellular iron homeostasis. IRPs post-transcriptionally modulate expression of iron-related genes by binding to specific sequences, called Iron Regulatory Elements (IREs), located in the untranslated regions (UTR) of mRNAs. Either of the two IRPs inhibits translation when bound to the single 5’UTR IRE in the mRNA encoding proteins of iron export (ferroportin - Fpn) and storage (ferritin - Ft) or prevents mRNA degradationwhen bound to the multiple IREs within the 3’UTR of the mRNA encoding the transferrinreceptor 1 (TfR1) - iron uptake molecule. The IRE-binding activity of both IRPs respondsto cellular iron levels, albeit via distinct mechanisms. IRP1 is a bifunctional protein, whichmostly exists in its non IRE-binding, [4Fe-4S] aconitase form and can be regulated by apost-translational incorporation or removal of the Fe-S cluster. In contrast to IRP1, IRP2 isnot able to ligate an Fe-S cluster, and its IRE-binding activity is determined by the rate ofits proteasomal degradation. Although both IRP1 and IRP2 can regulate cellular ironhomeostasis, only mice lacking IRP2 were shown to display iron mismanagement in mosttissues. This could be explained by the fact that IRP1 exists mostly in its non IRE−binding,aconitase form under physiological oxygen conditions (3-6%). Interestingly, nitric oxide(NO), an important signalling molecule involved in immune defence, targets the Fe-Scluster of IRP1 in both normoxia and hypoxia, and converts IRP1 from aconitase to anIRE-binding form. It has also been reported that IRP2 could sense NO, but the intrinsicfunction of IRP1 and IRP2 in NO−mediated regulation of cellular iron metabolism hasremained a matter of controversy. In this study, we took advantage of mouse models ofIRP deficiency to define the respective role of IRP1 and IRP2 in the regulation of cellulariron metabolism by NO and assess the contribution of oxygen tension on the regulation.Therefore, we exposed bone marrow-derived macrophages (BMMs) from Irp1-/-, Irp2-/- andmacrophage specific double knockout mosaic mice (Irp1/2-/-) to exogenous andendogenous NO under different oxygen conditions (21% O2 for normoxia and 3-5% forhypoxia experiments) and measured IRPs activities, iron-related genes expression andactivity of Fe-S cluster protein – mitochondrial aconitase. We showed that in normoxia, thegenerated apo-form of IRP1 by NO was entirely responsible for the post-transcriptionalregulation of TfR1, H-Ft, L-Ft and Fpn. Moreover, by increasing iron uptake and reducingiron sequestration and export, NO−dependent IRP1 activation served to maintainadequate levels of intracellular iron in order to fuel the Fe−S biosynthetic pathway, asdemonstrated by the efficient restoration of the mitochondrial Fe−S aconitase, which wasprevented under IRP1 deficiency. Furthermore, activated IRP1 was potent enough todown-regulate the abnormally increased L-Ft and H-Ft protein levels in Irp2-/-macrophages. Endogenous NO activated IRP1 IRE-binding activity and tended todecrease IRP2 IRE-binding activity. Nevertheless, IRP1 was the predominant regulator offerritin in those conditions. In hypoxia, in Irp1+/+ and Irp2+/+ macrophages exposed to NO,both stabilized IRP2 and NO-activated IRP1 seemed to cooperate to inhibit ferritinsynthesis. However, in Irp1-/- cells, IRP2 stabilized in hypoxia was sufficient to inhibit LandH-Ft synthesis despite the concomitant increase of corresponding mRNAs.Interestingly, TfR1 was shown to be predominantly regulated at the transcriptional level byNO in hypoxia, in which HIF-1 alpha may be the critical regulator. In conclusion, we revealin this study how the IRP regulon participates in the regulation of cellular iron metabolismin response to NO and its intimate interplay with the oxygen pathway. The findingsunderlie the importance to further explore the role of IRP1 in inflammation in vivo, in nonhypoxictissue microenvironments.

Wu, Xinggang. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2013. / Includes bibliographical references (leaves 124-161). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Hepcidin is a well-known iron-regulatory hormone that plays a key role in maintaining peripheral iron homeostasis. The presence and wide-spread distribution of hepcidin in the brain suggests that this peptide may also be an important player in brain iron homeostasis. In this study, we tested the hypothesis that hepcidin exerts an important role in the regulation of brain iron content, which might benefit iron-associated NDs such as PD. We also examined the hypothesis that hepcidin could control iron transport processes via regulating iron transport proteins in the brain cells, thus maintaining brain iron homeostasis. / In conclusion, the results of the present study implied that hepcidin plays an important role in maintaining brain iron homeostasis. Hepcidin is beneficial for PD and this effect is related to its iron-regulatory effect via inhibiting iron accumulation in the substantia nigra. Hepcidin effectively controls iron uptake and release through regulating iron transport proteins expressions in the brain, which would contribute to brain iron homeostasis. Therefore, manipulation of hepcidin level in the brain has a potential to be developed into a novel preventive approach for the iron-associated NDs such as PD. / In the second part, we investigated the effect of hepcidin on the processes of iron uptake and release in the cultured brain cells including neurons, astrocytes and brain vascular endothelial cells (BVECs). The expressions of iron uptake proteins such as transferrin receptor 1 (TfR1) and divalent metal transporter 1 (DMT1) as well as the iron exporter ferroportin 1 (Fpn1) were also observed. We found that hepcidin reduced both iron uptake and release via decreasing iron transport proteins expressions in these brain cells, which would contribute to its iron regulatory effect. Finally, we further explored the mechanisms underlying the regulatory effect of hepcidin on the iron transporters in the last part, and found that the action of hepcidin in reducing TfR1 expression is a direct and cAMP-PKA (Cyclic Adenosine 3', 5'-monophosphate/ Protein Kinase-A) pathway-dependent event. / Iron is a transition trace metal essential for mammalian cellular and tissue viability. It also plays important roles in the central nervous system (CNS), including embryonic brain development, myelination, and neurotransmitters synthesis. However, abnormal iron accumulation has been demonstrated in a number of neurodegenerative diseases (NDs) such as Parkinson's (PD), Alzheimer's (AD) and Huntington's diseases (HD). Currently very little is known about the mechanisms involved in brain iron homeostasis and therefore it is not known why and how iron is abnormally increased in the brain. However, given the essential role that excess iron plays in the pathological processes in the NDs, to suppress the accumulated iron is expected to be an effective strategy to prevent and treat these NDs. / To investigate whether hepcidin could benefit iron-associated NDs including PD and whether this beneficial role is related to its iron-regulatory function in the brain, in the first part of study, we investigated the effects of hepcidin on the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in vitro and in vivo PD models. We found that in primary cultured mesencephalic (MES) neurons, hepcidin overexpression via adenovirus-hepcidin (Ad-hepcidin) infection prevented 6-OHDA-induced increase in cellular iron content and protected the MES neurons. In the 6-OHDA model of PD in vivo, overexpression of hepcidin in the substantia nigra via Ad-hepcidin intranigral injection significantly prevented iron accumulation and dopaminergic neurons loss in the pars compacta of substantia nigra (SNc). These effects were accompanied by a marked improvement in motor performance of the PD animals. These findings indicate that hepcidin could benefit iron-associated NDs such as PD and via its iron-regulatory role in the brain. / Du, Fang. / Adviser: Ya Ke. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-06, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 152-173). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

L'utilisation des ressources en fer et les variations du potentiel redox sont des processus impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Ils participent à l'hématopoïèse normale et leur dérégulation peut être associée à des conditions pathologiques. Les hémopathies, telles que la leucémie aiguë myéloïde (LAM), témoignent du lien entre disponibilité en fer, signalisation redox et leucémogenèse. La déplétion en fer induit un arrêt de la prolifération suivi de la mort cellulaire, et pour des cellules primaires leucémiques (blastes) de patients LAM, elle peut conduire à un réengagement de la différenciation vers la lignée monocytaire. Cependant, les besoins en fer des clones leucémiques restent mal définis. Dans les cellules animales, le cœur du réseau de régulation du fer est organisé à travers le système régulateur IRE-IRP. Les Iron Regulatory Proteins (IRP), agissent sur la traduction de nombreuses protéines impliquées dans la gestion du fer par interaction avec les Iron Responsive Elements (IRE) localisés sur les régions non codantes des ARN messager (ARNm) régulés. A partir de lignées cellulaires leucémiques (KG1, K562), de blastes de patients LAM et de progéniteurs CD34+ contrôles issus de sang de cordon et de moelle osseuse de donneurs sains, le statut du système de gestion cellulaire du fer a été caractérisé pour les premières étapes de l'hématopoïèse normale et pathologique. A travers la manipulation des apports cellulaires en fer, notamment par l'utilisation de chélateurs à usage thérapeutique, la réponse du système homéostatique a été suivie. Nos données soulignent les faibles besoins en fer des progéniteurs hématopoïétiques, et d'autres cellules, pour proliférer. Dans les lignées cellulaires le régulateur IRP est en excès par rapport à ses cibles IRE, ce qui pourrait être une caractéristique générale du contrôle de la traduction pour des ARNm spécifiques par fixation de régulateurs translationnels. La régulation semble exclusivement le fait d' IRP1, puisqu' IRP2 n'a pas été détecté dans les progéniteurs hématopoïétiques, qu'ils soit pathologiques ou non. De subtiles différences ont été identifiées dans les quantités des composants du réseau gérant le fer dans les cellules leucémiques en comparaison des cellules saines témoins, ainsi que des capacités différentes à croître dans un milieu minimal comportant des concentrations en fer précisément définies. Les informations obtenues à travers ce travail pourraient bénéficier à l'élaboration de protocoles thérapeutiques, incluant notamment la manipulation du fer, dans les LAM ou d'autres pathologies. / Use of iron resources and variations of the redox balance are processes involved in cell proliferation and differentiation. They participate to normal hematopoiesis and their disturbance may be associated with pathological conditions. Hematological neoplasms, such as acute myeloid leukemia (AML), provide clinical evidence of the link between iron availability, redox signaling, and malignancy. Stringent iron depletion induces arrest of proliferation followed by cell death, and deprived primary leukemic cells of AML patients (blasts) have been previously shown to engage into the monocytic lineage. Yet, the iron needs of leukemic clones are unknown. The core network of cellular iron regulation in mammals is organized around the IRE-IRP system. The Iron Regulatory Proteins (IRP) act on the translation of many proteins involved in iron management by interacting with Iron Responsive Elements (IRE) located on the untranslated regions of messenger RNA (mRNA) coding these proteins. Using leukemic cell lines (KG1, K562), blasts of AML patients and CD34+ progenitors isolated from cord blood or the bone marrow of healthy donors, the status of the iron management system was established in the first stages of normal and pathological hematopoiesis. The response of the homeostatic system upon manipulation of iron provision, including with clinically implemented chelators, has been monitored. Our data emphasize the weak iron requirements of hematopoietic progenitors, and other cells, to proliferate. In cell lines the IRP regulator is in excess of its IRE targets, which may be a general feature of translational control for specific mRNA. The regulation seems exclusively mediated by IRP1, as the IRP2 regulator has not been detected in normal or malignant hematopoietic progenitors. Subtle differences have been found in the iron handling system of leukemic cells as compared to normal cells, together with different abilities to grow on a minimal medium containing precisely defined iron concentrations. The design of improved therapeutic regimens including iron manipulation, in AML and other pathologies, may benefit from considering the information obtained in this work.