Made available in DSpace on 2014-07-29T15:29:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Solimar A de Oliveira.pdf: 1870870 bytes, checksum: 5c7849377c8610cb5cbc8b8d4905a909 (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / Introduction: The chronic renal insufficiency is in between the transition epidemiologist illness, being able to be affected by the enteric opportunistic parasites for representing a population of immunosuppressed. Catalogued as emergent agents of opportunistic character, protozoan disease is responsible for important morbi-mortality rates, but little recognized on the part of the professionals of health and for the shortage of specialized laboratories in its diagnostics. They are caused mainly by protozoan, as the Blastocystis hominis, Cryptosporidium sp, Isospora belli, Cyclospora cayetanensis, amongst others. Objectives: Mapping world-wide studies through a systematic revision of literature concerned to the detection of these protozoan in hemodialysis patients. And, besides, to identify enteric opportunistic agents in immunosuppressed children with chronic nephropathies who were submitted to hemodialysis and also children patients who don t have chronic nephropathies, in the Clinical Hospital /UFG. Methods: The theoretical part, represented by the systematic revision of literature, was elaborated from standardized forms on the selection of scientific articles available in the Virtual Library in Health. This work, concerning the experimental part, was built in the period of October of 2009 to May of 2011 with analysis of the epidemiologic profiles of the patients and laboratorial detection of opportunistic enteroparasitosis in 229 fecal samples of 26 hemodialysis children (test-group) and of 59 children who haven t chronic nephropathies (control group), from the Hospital of the Clinics of the Federal University of Goiás. For further detection of the oocysts of coccids (Cryptosporidium sp, Cyclospora cayetanensis and Isospora belli), microscopic examination was used direct (fresh).It was also used the methods of Hoffman, Pons and Janer, Ridley or of concentration in formalin 10% - Acetate of Ethyl, Coloration of Kinyoun (hot), and, Ziehl-Neelsen (modified). With regard to the diagnosis of Blastocystis hominis, it was used the microscopic examination direct (fresh) and the technique of Coloration of Nair - Blue of Methylene. Results: In the systematic revision of literature, nine articles had been selected, and from the interpretation on these studies, the presence of enteric opportunistic protozoan in fecal samples of hemodialysis patients was evidenced. In the experimental part, the detection of protozoan for patients, in the test group and in the control group was, respectively, of: Blastocystis hominis in 9 (34,6%) and 13 (22%); Giardia lamblia in 3 (11,5%) and 2 (3,4%); Endolimax nana in 9 (34,6%) and 9 (15,3%); Entamoeba coli in 3 (11,5%) and 2 (3,4%). And still it had been detected only in the test group: Cryptosporidium sp in 1 (3,8%) patient and Entamoeba histolytica/dispar in 3 (11,5%). Regarding the quantitative analysis of fecal samples, it was collected 115 samples of the group of hemodialysis children and 114 samples of the group of children who don t have chronic nephropathies. The results gotten in this comparison had designated the presence of oocysts of intestinal protozoan in the test group and in the control group. Respectively, we have: Blastocystis hominis in 24 (20,87%) and 16 (14,04%) samples; Giardia lamblia in 3 (2,61%) and 2 (1,75%) samples; Endolimax nana 15 (13,4%) and 9 (7,89%) samples. Besides, it had been detected only in the test group: Cryptosporidium sp in 1 (0,87%) sample and Entamoeba histolytica/dispar in 3 (2,61%). With regard to the diarrheal feces analysis, it was detected in test group 1 sample (0,87%), and in the control group, 8 (7.02%). Conclusion: These findings demonstrate that such agents are present in our environment, reinforcing isolated infections or associates, between them or ahead of other opportunistic enteric parasites, providing a risk for the population of hemodialysis patient. They still disclose the urgency of an implantation of specialized laboratories with specific detection techniques of these infectum-parasitic agents. / Introdução: A insuficiência renal crônica está entre as doenças de transição epidemiológica, podendo ser afetada pelas parasitoses entérico oportunistas por representar uma população de imunossuprimidos. Catalogadas como agentes emergentes de caráter oportunista, as protozooses são responsáveis por importantes índices de morbi-mortalidade, mas pouco reconhecidas por parte dos profissionais de saúde e pela escassez de laboratórios especializados em seus diagnósticos. São causadas, principalmente, por protozoários como o Blastocystis hominis, Cryptosporidium sp, Isospora belli, Cyclospora cayetanensis, dentre outros. Objetivos: Mapear estudos mundiais mediante revisão sistemática da literatura quanto à detecção destes protozoários em pacientes hemodialisados. Identificar agentes entéricos oportunistas em crianças imunossuprimidas com nefropatias crônicas e submetidas à hemodiálise e em crianças não portadoras de nefropatias crônicas, no Hospital das Clínicas/UFG. Métodos: A parte teórica, representada pela revisão sistemática da literatura, foi elaborada a partir de formulários padronizados para a seleção de artigos científicos existentes na Biblioteca Virtual em Saúde. Este trabalho, no que tange à parte experimental, foi realizado no período de outubro de 2009 a maio de 2011, com análise do perfil epidemiológico dos pacientes e detecção laboratorial de enteroparasitoses oportunistas em 229 amostras fecais de 26 crianças hemodialisadas (grupo teste) e de 59 crianças não portadoras de nefropatias crônicas (grupo controle), procedentes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás. Para a detecção dos oocistos de coccídeos (Cryptosporidium sp, Cyclospora cayetanensis e Isospora belli), foram utilizados exames microscópicos diretos a fresco, bem como os métodos de Hoffman, Pons e Janer, Ridley ou de concentração em formalina a 10% Acetato de Etila, Coloração de Kinyoun a quente e ainda, Ziehl-Neelsen modificado. Já para o diagnóstico de Blastocystis hominis, foram utilizados exames microscópicos diretos a fresco e a técnica de Coloração de Nair Azul de Metileno. Resultados: Na revisão sistemática da literatura foram selecionados nove artigos e a partir da interpretação desses estudos foi constatada a presença de protozoários entéricos oportunistas em amostras fecais de pacientes hemodialisados. Na parte experimental, a detecção de protozoários por pacientes, no grupo teste e no grupo controle, foi de: Blastocystis hominis em 9 (34,6%) e 13 (22%); Giardia lamblia em 3 (11,5%) e 2 (3,4%); Endolimax nana em 9 (34,6%) e 9 (15,3%); Entamoeba coli em 3 (11,5%) e 2 (3,4%), respectivamente. Ainda, foram detectados no grupo teste: Cryptosporidium sp em 1 (3,8%) paciente e Entamoeba histolytica/dispar em 3 (11,5%). Quanto à análise quantitativa de amostras fecais, foram coletadas 115 amostras fecais do grupo de crianças hemodialisadas e 114 amostras fecais do grupo de crianças não portadoras de nefropatias crônicas. Os resultados obtidos nessa comparação assinalaram a presença de cistos e oocistos de protozoários intestinais no grupo teste e no grupo controle. Nos referidos grupos teste e controle foram encontrados cistos de Blastocystis hominis em 24 (20,87%) e 16 (14,04%) amostras; Giardia lamblia em 3 (2,61%) e 2 (1,75%) amostras; Endolimax nana 15 (13,4%) e 9 (7,89%) amostras, respectivamente. Além disso, foram detectados no grupo-teste: Cryptosporidium sp em 1 (0,87%) amostra e Entamoeba histolytica/dispar em 3 (2,61%). Em relação à consistência das fezes, foi detectada fezes diarréicas em 1 (0,87%) amostra do grupo-teste e 8 (7,02%) do grupo controle. Conclusão: Estes achados demonstram que tais agentes estão presentes em nosso meio ambiente, potencializando infecções isoladas ou associadas, entre eles ou diante de outros parasitos entéricos oportunistas, proporcionando um risco para a população de hemodialisados. Revelam ainda, a premência de implantação de laboratórios especializados com técnicas específicas de detecção destes agentes infecto-parasitários.

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O diagnóstico da Cryptosporidium pode também ser realizado pela detecção de coproantígenos por ensaio imunoenzimático (ELISA) ou pela amplificação do DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR), dispensando a identificação morfológica dos oocistos. Além disso, a análise do polimorfismo genético de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) pode ser utilizada na caracterização das espécies de Cryptosporidium, permitindo um melhor entendimento da dinâmica da transmissão deste parasito. Os objetivos deste trabalho foram: (1) comparar as técnicas de concentração de formol-acetato de etila (FE) e sedimentação por centrifugação (SC), bem como as técnicas de coloração de Ziehl-Neelsen modificado (ZN), auramina (AR) e safranina (SF) na detecção de oocistos de Cryptosporidium e Isospora belli em amostras fecais; (2) comparar a microscopia com a pesquisa de coproantígeno para o diagnóstico de Cryptosporidium e avaliar os resultados discordantes utilizando a PCR e (3) caracterizar as espécies de Cryptosporidium de amostras fecais humanas, através da PCR-RFLP. Para comparação entre os métodos de concentração de oocistos, FE e SC, e as técnicas de coloração, ZN, AR e SF, foram utilizadas amostras fecais positivas para Cryptosporidium (n=27) e I. belli (n=15), conservadas em formalina a 10%. Os métodos foram avaliados quanto ao número de oocistos detectados e a qualidade microscópica dos esfregaços. Para comparação entre o método de ZN e ELISA para o diagnóstico de Cryptosporidium foram examinadas amostras fecais de 626 crianças de diferentes grupos. Posteriormente, todas as amostras positivas para Cryptosporidium obtidas no estudo, juntamente com outros isolados disponíveis no laboratório, foram submetidos à extração de DNA e análise por Nested-PCR/RFLP dos genes COWP e 18S rRNA, para determinação das espécies de Crptosporidium. Os métodos SC e ZN identificaram mais oocistos de ambos parasitos do que os demais métodos avaliados (p<0,05). Houve perda de oocistos no anel de detritos gordurosos no FE em praticamente todas as amostras de Cryptosporidium e I. belli. Por outro lado, os métodos FE e AR apresentaram menos artefatos nos esfregaços comparados aos demais, sendo classificados com qualidade microscópica superior. A frequência de Cryptosporidium nas crianças foi de 2,6% (16/626), sendo maior no grupo com doença diarreica, enfatizando a importância deste coccídeo como agente etiológico da diarreia infantil. A sensibilidade e especificidade do ELISA foram de 85,7% e 99,7%, respectivamente. A eficiência da amplificação do DNA de Cryptosporidium foi de 92% (23/25), considerando os resultados dos dois genes analisados. As espécies do parasito identificadas foram C. hominis (78,3%), C. felis (8,7%), C. parvum (4,3%) e mistura C. felis + C. hominis (8,7%). Esses dados são os primeiros de genotipagem de Cryptosporidium de indivíduos de Salvador, demonstrando a predominância de C. hominis nas infecções, e a elevada frequência de C. felis, sugerindo um provável papel de gatos na transmissão do parasito aos humanos em nosso meio. / The diagnosis of coccidia Isospora belli and Cryptosporidium is usually accomplished by identification of oocysts in stained fecal smears. However, there is a lack of standardization in the routine laboratory for microscopic identification of these coccidia. The diagnosis of Cryptosporidium can also be done by detecting coproantigens using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or by parasite DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR), eliminating the need of morphological identification of oocysts. Furthermore, the analysis of restriction fragment length polymorphism of amplified DNA (RFLP-PCR) can be used to characterize the species of Cryptosporidium, allowing a better understanding of the transmission dynamics of the parasite. The objectives of this study were: (1) to compare the techniques of concentration of formalin-ethyl acetate (FE) and sedimentation by centrifugation (SC), as well as the techniques of modified Ziehl-Neelsen (ZN), auramin (AR) and safranin (SF) in the detection of Cryptosporidium and Isospora belli in stool samples, (2) to compare the microscopy with coproantigen detection for the diagnosis of Cryptosporidium and evaluate discordant results using PCR and (3) to characterize the species Cryptosporidium in human fecal samples by PCR-RFLP. To compare the methods for concentration, FE and SC, and staining of oocysts, ZN, AR and SF, there were used positive fecal samples for Cryptosporidium (n = 27) and I. belli (n = 15), preserved in 10% formalin. The methods were evaluated according the numbers of oocysts detected and the microscopic quality of smears. For comparison between ELISA and ZN for the diagnosis of Cryptosporidium in faecal samples, there were examined 626 stool samples from children of different groups. Subsequently, all positive samples for Cryptosporidium obtained in the study, along with other isolates available in the laboratory, were subjected to DNA extraction and analysis by Nested-PCR/RFLP of the COWP and 18S rRNA genes to determine the species of Crptosporidium. The SC and ZN methods identified more oocysts of both parasites than other methods tested (p <0.05). The loss of oocysts in the fatty debris layer of FE method was observed in all Cryptosporidium and I. belli samples. Moreover, the methods of FE and AR had fewer artifacts in smears compared to the others, being ranked with higher microscopic quality. The frequency of Cryptosporidium in children was 2.6% (16/626), being higher in patients with diarrheic disease, emphasizing the importance of this protozoan as etiologic agent of childhood diarrhea. The sensitivity and specificity of ELISA were 85.7% and 99.7%, respectively. The efficiency of amplification of Cryptosporidium DNA was 92% (23/25), considering the results of the two genes. The species of the parasite identified were C. hominis (78.3%), C. felis (8.7%), C. parvum (4.3%) and a mixture of C. felis + C. hominis (8.7%). To our knowledgment, these data represent the first genotyping study of Cryptosporidium from individuals of Salvador, demonstrating the dominance of C. hominis infection and the high frequency of C. felis, suggesting a potential role of cats in the transmission of the parasite to humans in our area.